牦牛及杂种后代犏牛的TSPY基因克隆分析

克隆测序了牦牛、犏牛TSPY基因的编码区全序列,并用生物信息学软件分析了该基因的编码区序列、蛋白结构和进化关系.结果表明,牦牛和犏牛TSPY基因编码区序列长度均为954 bp,编码317个氨基酸,牦牛与普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95％,犏牛与牦牛、普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95％、99.79％,杂交后代犏牛与亲本序列差异表现在第113位核酸位点发生了改变(T→T→C),导致第38位氨基酸发生变化(V→V→A).牦牛和犏牛TSPY蛋白含有TSPY家族典型的SET/NAP保守结构域,与人、鼠TSPY蛋白结构域一致,推测牦牛和犏牛TSPY蛋白在雄性减数分裂过程中参与了精原细胞和初级精母细胞的调节.     

类乌齐牦牛UCP3基因克隆与序列分析

利用RT-PCR方法成功克隆UCP3基因,对其核苷酸序列及氨基酸序列进行生物学在线分析。结果表明,类乌齐牦牛UCP3基因CDS区序列长为936bp,A、G、C和T平均含量分别为20.83%、28.63%、31.09%和19.44%;与普通牛UCP3基因CDS区序列一致性高达99%;共发现碱基突变位点6个,其中同义突变4个,反义突变2个。UCP3基因共编码311个氨基酸,分子质量为34.18ku,理论等电位点9.53;其主要分布在线粒体内膜上,为非分泌蛋白;具有α-螺旋、无规则卷曲、延伸链、β-转角等结构。由系统进化树可知,类乌齐牦牛与野牦牛最接近,与普通牛次之。     

大通牦牛DQA2基因CDS区序列分析

为了获得大通牦牛DQA2基因序列,并研究其序列特征及编码蛋白的结构和功能,本研究采用DNA混合池扩增后直接测序的方法,通过DNAstar软件和在线服务器预测大通牦牛DQA2基因CDS区编码蛋白的理化性质、疏水性/亲水性、糖基化位点、信号肽、跨膜结构、二级结构以及三级结构。结果表明,大通牦牛DQA2基因CDS区长度为765bp,编码253个氨基酸。蛋白结构预测结果表明,该蛋白是一种混合型的可溶性蛋白质,具有4个潜在的N-糖基化位点,分别为Asn31、Asn96、Asn260、Asn369;在第1~23位氨基酸之间存在信号肽;存在1个典型的跨膜螺旋区,氨基酸序号为216-239;蛋白质功能显示该蛋白存在信号受体活性、催化活性、运载体、调节代谢过程、细胞定位及免疫系统过程的功能。本研究结果为进一步研究大通牦牛的遗传育种提供理论基础。     

藏猪与大约克夏猪Mx1基因CDS区多态性及生物信息学分析

为了解藏猪与大约克夏猪Mx1基因编码序列(coding sequence, CDS)多态性,试验选择健康的成年(180日龄以上)大约克夏猪20头和藏猪30头为试验动物,采用PCR法扩增两个猪群的Mx1基因CDS区,测序分析其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs),采用生物信息学方法分析Mx1基因CDS区编码蛋白质的理化性质、疏水性、磷酸化位点、二级结构、三级结构和与其他蛋白质的相互作用,分析SNPs位点对Mx1基因编码蛋白的上述指标的影响。结果表明：在藏猪Mx1基因CDS区存在C867G、A923C、A1241G和C1324A 4个SNP位点,在大约克夏猪中存在A1241G和C1324A 2个SNP位点;其中C867G、A923C和A1241G位点属于错义突变,分别使第289位由天冬氨酸变为谷氨酸,第308位由谷氨酸变为丙氨酸,第414位由赖氨酸变为精氨酸;C1324A为同义突变。Mx1基因CDS区共编码663个氨基酸,编码蛋白质呈酸性、亲水性,二级结构以α螺旋为主;共有55个磷酸化位点,其中有37个丝氨酸(Ser)磷酸化位点,13...     

牦牛KAP3.3基因的克隆及生物信息学分析

本研究以牦牛的角蛋白关联蛋白3.3(KAP3.3)基因作为研究对象,通过查询GenBank中收录的黄牛KAP3.3基因的mRNA序列设计1对特异性引物,通过逆PCR、PCR以及基因克隆测序的方法首次获得牦牛的KAP3.3基因完整的CDS区序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明:牦牛KAP3.3基因的CDS区为297 bp,编码98个氨基酸;编码的蛋白质属于亲水性蛋白。二级结构含有延伸链、β转角以及无规卷曲3种。氨基酸序列与黄牛的完全一致,具有Keratin,high sulphur matrix protein家族的完整结构域。     

牦牛及杂种后代犏牛的TSPY基因克隆分析

 克隆测序了牦牛、犏牛TSPY基因的编码区全序列,并用生物信息学软件分析了该基因的编码区序列、蛋白结构和进化关系。结果表明,牦牛和犏牛TSPY基因编码区序列长度均为954 bp,编码317个氨基酸,牦牛与普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95%,犏牛与牦牛、普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95%、99.79%,杂交后代犏牛与亲本序列差异表现在第113位核酸位点发生了改变（T→T→C）,导致第38位氨基酸发生变化（V→V→A）。牦牛和犏牛TSPY蛋白含有TSPY家族典型的SET/NAP保守结构域,与人、鼠TSPY蛋白结构域一致,推测牦牛和犏牛TSPY蛋白在雄性减数分裂过程中参与了精原细胞和初级精母细胞的调节。     

类乌齐牦牛SIRT3基因克隆与生物信息学及差异表达分析

本实验旨在丰富牦牛 SIRT3基因的基础研究,通过对西藏类乌齐牦牛 SIRT3基因克隆、生物信息学分析及差异表达分析,进一步探讨 SIRT3基因的生理功能及分子机制。结果表明:类乌齐牦牛 SIRT3基因CDS区长 1 002 bp,编码 333个氨基酸,与普通牛 SIRT3基因 CDS区比对存在碱基突变,编码氨基酸发生错义和同义突变,同义突变发生在碱基第 49、279、342、384 位,错义突变发生在碱基第 149 和 620 位,其编码蛋白属亲水性蛋白,有多个跨膜区域和磷酸化位点,无信号肽片段,主要位于线粒体,二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主;SIRT3基因编码蛋白在催化活性、核苷酸结合及辅因子结合等过程发挥主要功能,主要参与生物体代谢过程;类乌齐牦牛 SIRT3基因序列与普通牛一致性较高,亲缘关系最近;QPCR分析显示,SIRT3基因在牦牛肝脏中的表达水平极显著高于其他组织(P<0.01)。     

牦牛MEF2A基因克隆与差异性表达分析

MEF2A是一种由MEF2A基因编码的蛋白质,在心脏和平滑肌细胞的形态发生和肌细胞的生成过程中发挥关键作用。该研究运用RT-PCR技术并结合生物信息学分析方法,对西藏类乌齐牦牛MEF2A基因CDS区序列进行克隆及差异表达分析。结果表明:牦牛MEF2A基因CDS区全长1469 bp,共编码489个氨基酸。分子式为C 2263 H 3601 N 647 O 742 S 20,蛋白质分子量52385.58,总原子数为7273,理论等电点(pI)为6.27,消光系数为27515,不稳定指数60.68。脂溶系数和亲水性平均值分别是64.60、-0.604,该蛋白属于亲水性不稳定蛋白。蛋白质二级结构和三级结构预测结果显示,MEF2A蛋白主要由无规则卷曲、α螺旋和延长链在空间上折叠形成。牦牛MEF2A基因CDS区编码的氨基酸序列与普通牛、家猫、家犬、绵羊、小鼠、金钱豹、宽吻海豚、抹香鲸、美洲野牛、白犀、马、东北虎、猴的同源性分别为99.6%、96.1%、96.4%、99.6%、89.3%、96.8%、96.6%、96.8%、93.6%、97.2%、96.1%、96.3%、96.7%,该基因在不同物种高度保守。利用实时荧光定量PCR检测可知,MEF2A mRNA在牦牛臀肌、心脏、肝脏、肺脏中均有表达,且在臀肌中的表达优势较为显著(P<0.05)。研究结果为进一步探讨MEF2A基因对牦牛肌肉代谢调控的分子机制研究提供了理论依据。     

隆林山羊SCD基因的克隆及序列分析

为了研究硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)基因对肌间脂肪组织三酰甘油形成的影响,试验采用克隆隆林山羊SCD基因CDS区序列并进行序列分析的方法,根据Gen Bank中收录的西农萨能羊SCD序列设计引物并进行PCR扩增及克隆测序,利用在线生物信息学软件分析SCD蛋白的序列特性,分析不同物种间SCD基因的进化关系及三级结构,从而预测隆林山羊SCD基因的功能。结果表明:隆林山羊SCD基因CDS区序列全长1 080 bp,由4个外显子组成,编码359个氨基酸,与牛、绵羊、人的氨基酸相似度分别为94.2%、98.3%、83.8%,并与牛和人具有相似的三级结构。系统进化树显示,隆林山羊与绵羊和牛具有较近的亲缘关系,而与鸡的亲缘关系较远。     

美仁牦牛ILK基因克隆及生物信息学分析

为探究美仁牦牛ILK基因的结构与功能,利用PCR技术克隆了美仁牦牛背最长肌ILK基因CDS区序列,并利用在线软件预测和分析其编码氨基酸序列的生物信息学特征。结果表明,美仁牦牛ILK基因编码区长度1 359 bp,共编码452个氨基酸,是一种主要在细胞质中发挥生物学功能的亲水性蛋白;美仁牦牛ILK基因编码蛋白分子式C₂₂₇₆H₃₅₈₀N₆₅₆O₆₄₇S₃₀,分子量51 447.27 Da,原子总数7 189,理论等电点8.30,不稳定性指数41.47,共有27个磷酸化位点;同时,亚细胞定位结果表明,美仁牦牛ILK基因主要分布在细胞质中;系统进化树表明,美仁牦牛与野牦牛和普通牛亲缘关系最近,与非洲爪蟾亲缘关系最远。     

牦牛谷胱甘肽过氧化酶1基因(GPX1)的克隆及系统发育分析

本研究克隆了牦牛谷胱甘肽过氧化酶1GPX1基因的CDS区序列,分析了其核苷酸序列,并进行了系统发育分析.结果表明,牦牛GPX1基因CDS区全长618 bp,编码205个氨基酸;经与GenBank中其他物种GPX1基因CDS区比对,牦牛GPX1基因CDS区与普通牛和瘤牛完全一致,与水牛、绵羊和猪的序列一致性较高,与其他哺...     

西藏牦牛ATGL基因克隆及生物信息学分析

为了研究西藏牦牛ATGL基因的理化特性及分子结构,试验采用PCR扩增和DNA测序技术以及生物信息学分析软件对西藏类乌齐牦牛ATGL基因进行克隆测序和生物信息学分析。结果表明:西藏类乌齐牦牛ATGL基因编码区全长为1 461 bp,可编码486个氨基酸,其中A、T、G、C碱基含量分别为17.2%、17.9%29.0%、35.9%,A+T为35.1%,G+C为64.9%;相对分子质量为53 417.9,理论等电点为6.83,在构成该蛋白所编码的氨基酸中亮氨酸(Leu)和脯氨酸(Pro)的含量最高,分别为13.4%和9.5%,总的带正电(Arg+Lys)和负电(Asp+Glu)残基分别为46和47;西藏类乌齐牦牛ATGL基因编码区核苷酸序列与普通牛、野猪、人、绵羊、山羊、绿头鸭、原鸡、小家鼠的核酸序列一致性分别为99.58%、87.52%、87.78%、96.26%、95.93%、67.63%、64.44%、82.65%;西藏类乌齐牦牛ATGL基因编码氨基酸序列与普通牛、野猪、人、绵羊、山羊、绿头鸭、原鸡、小家鼠的氨基酸序列一致性分别为99.79%、87.45%、87.66%、95.06%、96.09%、73.14%、69.56%、87.53%;ATGL蛋白为不稳定的跨膜蛋白,无信号肽;其二级结构主要以α-螺旋、β-折叠以及无规卷曲为主,其中94个氨基酸残基参与了16个α-螺旋的形成(占39.11%),35个氨基酸残基参与了9个β-折叠的形成;在三级结构中,其N端存在1个Patatin结构域。说明西藏牦牛ATGL基因在编码区序列存在明显的碱基偏倚性,在进化关系上ATGL基因无论核苷酸序列还是氨基酸序列都有较高的保守性。     

牦牛GHR exon 10-2序列SNP多态性分析

生长激素受体基因是泌乳性状重要候选基因,研究牦牛GHR基因SNP多态性是开展牦牛乳用性能分子标记辅助选育的重要基础。本试验对牦牛GHR基因exon 10-2片段SNP多态性检测结果表明:相对于普通牛GHR exon 10 (Genebank登录号AM161140.1),本试验青海泽库高原型牦牛GHR基因exon 10-2含SNP多态位点5个,AM161140.1-10第702位T(C/C型),该碱基编码的氨基酸为半胱氨酸(C),本群体所有样本该SNP位点编码氨基酸均为精氨酸(R)。第730位A(A/G型),导致编码的氨基酸由丝氨酸(S)变成甘氨酸(G),第755位C(T/T型),该位点碱基突变并未造成氨基酸的变化,为同义突变。第810位T(C/T型),导致编码的氨基酸由脯氨酸(P)变成丝氨酸(S)。第989位T(C/C型),碱基T编码的氨基酸为酪氨酸(Y),本群体所有样本该SNP位点编码氨基酸均为组氨酸(H);相对于本试验群体,共含SNP多态位点2个(第730位A,第810位T),且2个SNP多态位点共形成3种基因型,AA/CT共1头,基因型频率为4.35%,AG/TT共7头,基因型频率为30.43%,AA/TT共15头,基因型频率为65.22%,AA/TT为该群体优势基因型.     

牦牛AQP9基因CDS全长序列克隆及其生物信息学特征分析

为了研究高原动物对青藏高原极端生境的适应机理,并为探讨高原动物适应机制提供基本数据。本研究运用基因克隆技术对牦牛脑AQP9基因CDS全长序列进行克隆,采用生物信息学方法进行分析,AQP9基因和编码序列特征进行了以下几方面的预测和分析:其物化性质、疏水性、跨膜结构和蛋白二级结构。结果表明,牦牛AQP9的CDS含有一个885bp的开放阅读框,编码295个氨基酸;牦牛AQP9基因编码蛋白分子量和理论等电点分别为31.89ku和6.21,其编码蛋白含有6次跨膜结构,属于疏水性蛋白;二级结构由α-螺旋、延伸链、β-折叠及无规则卷曲构成;牦牛AQP9基因编码氨基酸序列与黄牛、藏羚羊、绵羊等物种间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致。本研究将为牦牛低氧适应性研究提供一定的基础资料。     

西藏牦牛ELOVL6基因的克隆、生物信息学及组织表达量分析

为探究西藏牦牛ELOVL6基因的结构与功能,试验采用PCR技术克隆西藏牦牛ELOVL6基因编码区序列,利用在线软件预测和分析其编码氨基酸序列的生物信息学特征,并利用实时荧光定量PCR技术测定ELOVL6基因在西藏牦牛不同组织中的表达水平。结果表明：西藏牦牛ELOVL6基因编码区序列长度为795 bp,共编码264个氨基酸;与牛ELOVL6基因(GenBank登录号为NM＿001102155.1)编码的氨基酸序列比较,其第18位核苷酸位点发生了碱基突变(A→C)。西藏牦牛与普通牛亲缘关系较近,与斑马鱼亲缘关系较远。ELOVL6基因编码蛋白是一种主要在内质网发挥生物学功能的疏水性蛋白,共有20个磷酸化位点,有跨膜结构,无信号肽,二级结构以α-螺旋为主。ELOVL6基因在西藏牦牛的不同组织中均有表达,其中,在脂肪组织中的相对表达量最高,极显著高于其他组织(P<0.01)。说明ELOVL6基因可能是调控牦牛脂肪酸代谢的关键基因。     

黄牛MEF2A基因克隆及真核表达载体构建

旨在克隆MEF2A基因和构建其真核表达载体,为黄牛种质资源保存利用以及肉牛转基因育种和产业化提供基因资源和育种素材。本研究通过RT-PCR克隆黄牛MEF2A基因CDS区,并将其插入到质粒载体pEGFP-C1的多克隆位点中,构建真核表达载体pEGFP-C1-MEF2A。同时应用生物学软件分析MEF2A基因及其编码蛋白的生物学特性,了解其复杂的调控机能。结果,MEF2A基因的CDS区全长1 494bp,编码498个氨基酸残基。生物信息学分析表明,N端第2～56位氨基酸肽段为MADS-box结构域,第57～77位氨基酸肽段为MEF2结构域;C端没有明显的功能域。成功的构建了含有牛MEF2A基因的真核表达载体pEGFP-C1-MEF2A。     

牦牛生长激素受体基因exon5序列SNP多态性分析

生长激素受体基因是泌乳性状重要候选基因,本试验对牦牛GHR基因exon 5片段进行了SNP检测,该结果表明牦牛GHR基因exon 5含SNP多态位点1个,第82位T,形成C/C和C/T两种基因型,且该SNP为非同义cSNP,碱基C/T的转换导致了编码氨基酸精氨酸/半胱氨酸的改变。     

牦牛CAPS基因克隆及生物信息学分析

钙磷蛋白(calcyphosine, CAPS)是一种钙结合蛋白,对维护生物体内钙磷平衡起着重要作用。本研究克隆了牦牛CAPS基因的CDS区序列,分析了其核苷酸序列,并进行了生物信息学分析。结果表明,牦牛CAPS基因CDS区全长570 bp,编码189个氨基酸;编码蛋白的分子式为C₉₀₅H₁₄₃₄N₂₆₆O₂₉₇S₈,分子量为21 049.43 Da,理论等电点为4.69,脂溶指数为75.29,不稳定指数为37.52,是疏水性稳定蛋白;系统进化分析表明,牦牛CAPS基因CDS区与普通牛和瘤牛的基本一致,与水牛、绵羊和猪的序列一致性较高。本研究为深入研究牦牛CAPS的生理功能提供了参考资料。     

类乌齐牦牛EGLN1基因克隆、生物信息学分析及差异表达

为了对牦牛egl-9家族缺氧诱导因子1 (EGLN1)基因的CDS区核苷酸序列进行克隆,预测其编码的蛋白结构和功能,并分析其在牦牛和黄牛心脏、肺脏、肝脏及大脑等器官中的表达差异,试验根据GenBank中公布的黄牛EGLN1基因mRNA序列设计特异性引物,运用RT-PCR技术获取牦牛EGLN1基因的cDNA序列,对牦牛EGLN1基因CDS区核苷酸序列与蛋白质结构进行生物信息学分析,并构建系统进化树,利用荧光定量PCR技术检测黄牛和牦牛心脏、肺脏、肝脏、大脑中EGLN1基因的相对表达水平。结果表明:牦牛EGLN1基因CDS区序列长度为1 263 bp,编码420个氨基酸;EGLN1的半衰期为30 h,属于碱性蛋白,表现为亲水性,无信号肽及跨膜结构;磷酸化位点共30个,存在3个低复杂区域和1个P4Hc结构功能域;二级结构以无规则卷曲为主,三级结构由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角构成。牦牛和其他9种动物EGLN1基因序列构建系统进化树中,牦牛与水牛亲缘关系最近,同源性高达99.3%,与褐家鼠亲缘关系较远。EGLN1基因在黄牛和牦牛肝脏、大脑、心脏、肺脏4个器官中均有表达,表达量依次递减;EGLN1基因在牦牛各器官中的相对表达量均显著高于黄牛(P0.05),其中牦牛肝脏中的相对表达量约为黄牛的5.5倍。说明EGLN1基因可作为牦牛低氧适应性研究的重要基因之一。