家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因(BmGSTd1)的诱导表达定量分析

谷胱甘肽-S-转移酶(GST)在机体的解毒代谢和抗氧化中起重要作用。为探究家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因(BmGSTd1)在家蚕体内的解毒和抗性功能,采用实时荧光定量PCR方法,对BmGSTd1基因在正常饲养及添食NaF家蚕5龄幼虫不同组织中的转录水平进行检测,并采用家蚕Actin3、GAPDH、28S rRNA 3种内参照基因对检测结果进行归一化处理。BmGSTd1基因在家蚕5龄幼虫各组织的转录水平存在差异,且采用不同内参照基因结果不一致:分别以家蚕Actin3、GAPDH、28S rRNA基因为内参照,该基因转录水平最高的组织分别为中肠、丝腺、脂肪体。5龄第2天幼虫添食NaF对体内各组织中BmGSTd1基因的转录水平具有诱导作用,且在不同组织中诱导表达的情况不同,采用以上3种内参照基因进行归一化处理的结果数据表明,中肠和脂肪体组织中的诱导转录水平最高,可能与这2种组织是家蚕主要的解毒器官有关。研究认为,检测基因在不同组织中的转录水平,采用合适的内参照基因对保证检测结果的可靠性非常重要。     

氟化物添食对家蚕耐氟品种和敏感品种5龄幼虫体内蛋白质及谷胱甘肽硫转移酶含量的影响

为探明家蚕耐氟化物机理,以家蚕耐氟品种T6和敏感品种734为材料,通过人工添食NaF的方法测定了其血液与中肠组织蛋白质及谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）的活力.结果表明：随着NaF添食浓度的增加,敏感品种734血液蛋白质浓度低于耐氟品种T6血液蛋白质浓度,而两者中肠组织的蛋白质浓度无明显差异.敏感品种734血液及中肠组织的GSTs酶活力呈现幅度较大的波动;耐氟品种T6血液中的GSTs酶活力呈现上升趋势,中肠组织的GSTs酶活力波动的幅度较小.由此可见,耐氟家蚕品种能够在氟化物的调控下提高体内GSTs的含量,推测其为耐氟家蚕品种具有氟化物抗性的原因之一.     

家蚕黄血近等基因系差异蛋白组学分析

为了获取与家蚕黄血基因(Y)协同作用的相关蛋白的基础信息,通过双向电泳技术对家蚕黄血近等基因系5龄起蚕黄血个体和白血个体的中肠蛋白进行分离并作图像分析,发现分离出的较为清晰的蛋白点主要集中在14～80kD区域,等电点(pI)4～9。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对其中一些差异明显的蛋白点进行鉴定,鉴定结果较为可信的5个蛋白点包括参与能量代谢、蛋白质合成等功能蛋白,这些蛋白可能与家蚕黄血性状的形成有关。采用实时定量PCR方法,对质谱鉴定出的质子转移ATP合酶β亚基2编码基因在家蚕黄血近等基因系黄血个体和白血个体5龄不同发育时期的相对表达量进行分析,结果表明该基因在2种个体中的表达均呈现明显上升的趋势,并且在黄血个体中的表达量明显较白血个体高,5龄第1-2天的相对表达量高7倍左右,提示该基因可能与家蚕的黄血性状有关联。     

柞蚕谷胱甘肽硫转移酶-theta基因(GSTT)的克隆及其在5龄幼虫丝腺中的表达规律

谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)是一种解毒酶。为明确柞蚕谷胱甘肽硫转移酶-theta(GSTT)在柞蚕丝素蛋白准备和合成过程中所起的作用,采用生物信息学的方法克隆了柞蚕GSTT基因,并分析其在5龄幼虫丝腺中的表达规律。根据家蚕GSTT基因序列设计引物,获得了柞蚕GSTT基因的cDNA序列(651 bp,编码216个氨基酸,Gen-Bank登录号:EU541490)。该基因编码的蛋白与家蚕GSTT的同源性为89%。利用柞蚕18S核糖体蛋白基因作为内参,对柞蚕GSTT在不同时期的表达情况进行实时定量PCR检测,结果发现柞蚕GSTT的mRNA表达量在5龄第4天达到最高,后期逐渐下降。研究表明,在柞蚕丝素蛋白合成的5龄期,GSTT表达量大量提高,推测其主要功能为帮助柞蚕排除体内过多的氨基酸,以达到排毒目的。     

家蚕谷胱甘肽硫-转移酶的组织分布及发育期变化规律

为明确家蚕谷胱甘肽硫-转移酶(GSTs)的生物学信息,对家蚕不同发育阶段GSTs的变化规律、5龄幼虫主要组织及不同品种间的GSTs活性差异进行了研究。家蚕GSTs在中肠、脂肪体、血淋巴、表皮、头部等组织中都有分布,脂肪体中GSTs活性最高,其次是中肠,头部最低。各发育阶段中,在由一种虫态变为另一种虫态的初始期GSTs活性较高,以后逐渐降低。在幼虫主要组织中GSTs活性5龄第3天最高,以后逐渐下降,至吐丝前达到较低的水平。抗性较强的夏秋蚕品种的GSTs活性高于春用蚕品种,杂交种的GSTs活性高于原种。研究结果提示家蚕GSTs活性与其组织器官的生理功能、品种抵抗性等相关联。     

家蚕谷胱甘肽-S-转移酶研究进展

谷胱甘肽-S-转移酶在内外源有毒物质的代谢中起着重要作用。家蚕既是重要的经济昆虫,也是重要的模式生物。家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物,研究家蚕谷胱甘肽-S-转移酶,对于阐明谷胱甘肽-S-转移酶与杀虫剂抗性的关系,防治农林害虫有着重要的理论意义。本文就谷胱甘肽-S-转移酶在家蚕中的研究现状作了归纳,希望对今后谷胱甘肽-S-转移酶的研究能有所帮助。     

芸香苷诱导家蚕谷胱甘肽-S-转移酶omega家族基因的表达变化

谷胱甘肽-S-转移酶(GST)是在机体的解毒代谢和抗氧化过程中起重要作用的超家族酶系。分析家蚕(Bombyx mori)GST omega家族基因在体内摄入植物次生物质芸香苷后的表达变化,为从代谢生理研究家蚕对农药的抗性,以及探讨植物次生代谢物质影响鳞翅目害虫对农药的敏感性的机制提供参考。采用双跟踪标定定量PCR(dual-spike-in qPCR)方法,检测添食不同浓度芸香苷溶液的家蚕5龄幼虫的中肠和脂肪体中GST omega家族不同基因的转录水平,结果显示添食质量浓度为5×10-2 ng/μL的芸香苷溶液能诱导GST基因的转录水平发生显著变化:与对照相比,中肠中BmGSTo1、BmGSTo2和BmGS-To3基因在诱导后24 h的相对转录水平分别上升了7 143、1 391和3 398倍;在脂肪体中BmGSTo1的转录水平最高且在诱导后2 h达到最大值。与添食5×10-2 ng/μL芸香苷溶液处理组相比,添食5×10-1 ng/μL芸香苷溶液诱导后GST基因在蚕体组织转录水平上升的幅度较小,并且达到峰值的时间不同,而添食5×10-3 ng/μL芸香苷溶液诱导后并不能使GST基因的转录水平发生变化。研究结果提示:家蚕GST omega家族基因可能参与对摄入蚕体内的芸香苷的代谢。     

桑螟触角中谷胱甘肽硫转移酶基因的鉴定及组织表达谱分析

桑螟(Glyphodes pyloalis)是桑树的主要害虫,严重危害各蚕桑主产区的桑叶产量。从桑螟触角转录组数据库中共鉴定出15个谷胱甘肽硫转移酶(GST)基因。序列分析显示,这些基因均具有完整的开放阅读框,与其他鳞翅目昆虫的GST基因具有高度的相似性,其中8个GST基因具有谷胱甘肽结合域。系统进化树显示这些GST基因分别归属于GST的6个亚类。荧光定量PCR结果表明,GpGST-D1在雌、雄成虫触角中高度特异性表达,推测可能参与桑螟触角中气味降解过程。GpGST-O1和GpGST-O2在雌成虫触角中的表达量高于其他组织,GpGST-D3在雌成虫腹部的表达量最高,但在触角中的表达量与雄成虫无显著差异。除GpGST-D3外,10个GpGST(GpGST-D2、GpGST-D4、GpGST-E1、GpGST-E2、GpGST-E3、GpGST-T1、GpGST-Z1、GpGST-S1、GpGST-S2、GpGST-S3)在桑螟成虫腹部的表达量也高于其他组织,但呈现出性别差异。研究结果为深入了解桑螟嗅觉感受行为的分子机制提供了基础,也为研发新型桑螟防治手段提供了参考。     

家蚕氟化物中毒后血淋巴中脂质过氧化物和抗氧化物含量及抗氧化酶活性的变化

为了探究氟化物对家蚕的毒理作用,通过给家蚕5龄期幼虫添食NaF,检测氟化物中毒家蚕幼虫血淋巴中脂质过氧化物质丙二醛(MDA)、抗氧化物质谷胱甘肽(GSH)的含量变化以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)等抗氧化物酶的活性变化。正常家蚕幼虫和氟化物中毒家蚕幼虫血淋巴中的MDA含量在5龄期均逐渐下降,但氟化物中毒家蚕的MDA平均浓度比正常家蚕升高了83.77%;GSH含量变化趋势为5龄第1天和第5天较高,第3天较低,但氟化物中毒家蚕5龄期的GSH浓度平均比正常家蚕下降了47.81%;氟化物中毒家蚕5龄期的GSH-Px和GST的平均活性分别比正常家蚕升高63.49%、39.22%,5龄第3天达到最高峰,5龄第1天和第5天较弱。初步分析认为家蚕幼虫血淋巴中MDA和GSH的含量变化以及GSH-Px和GST的活性变化,与家蚕氟化物中毒后体内氧自由基含量上升和脂质过氧化作用增强密切相关,可作为诊断家蚕氟化物中毒的生化指标。     

二化性家蚕滞育过程中谷胱甘肽S-转移酶活性的变化

二化性家蚕卵以25℃和15℃催青,可分别诱导成虫产下子代滞育和非滞育卵,而即时浸酸和5℃左右的低温处理可以分别阻止和解除胚胎滞育。利用1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)显色法测定了经上述处理后的胚胎滞育过程中谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)的活性,结果表明:胚胎发育后期的蚕卵经25℃催青,卵中的GST活性显著高于15℃催青蚕卵;蚕卵即时浸酸未显著改变胚胎滞育发动阶段蚕卵中的GST活性;5℃低温处理显著提高了滞育卵中的GST活性,但是未能显著改变即时浸酸卵的GST活性。上述结果表明,蚕卵中的GST活性变化与二化性家蚕胚胎滞育诱导和解除密切相关。     

家蚕DnaJ5基因的克隆与表达谱分析

DnaJ蛋白是一种调节蛋白。从构建的家蚕蛹cDNA文库中检索到一条编码DnaJ蛋白的EST,并克隆获得家蚕DnaJ5基因(Bm-DnaJ5,GenBank登录号为FJ592078)。该基因的开放阅读框长1 056 bp,编码351个氨基酸,分子质量为38.93 kD,等电点为9.25。利用实时定量PCR技术对Bm-DnaJ5基因在家蚕不同组织和发育时期的时空表达谱进行定量分析,结果显示:该基因在5龄幼虫时期的各组织中都有表达,在睾丸中的表达量最高,拷贝数达到1.16×108个/μg,其次在头部、中肠、前部丝腺和翅原基中的表达量也较高,在气管丛中的表达量最低,拷贝数仅为1.84×104个/μg;在蛹中期的几个组织中均有表达,其中在眼和睾丸中的表达量较高,拷贝数分别为8.79×107个/μg和1.78×107个/μg,而在卵巢中的表达量最低,拷贝数仅为1.94×105个/μg。     

SO2对家蚕血淋巴中谷胱甘肽含量及相关酶活性的影响

通过分析在SO2胁迫下家蚕5龄幼虫血淋巴中谷胱甘肽(GSH)含量及相关酶活性的变化,探讨SO2对家蚕的毒理作用机制。当对家蚕5龄幼虫每天以40 mg/m3SO2熏气刺激6 h,蚕体血淋巴中的GSH含量显著降低,雄蚕GSH的平均含量为49.8μmol/L,雌蚕为41.0μmol/L,分别为对照的73.80%和55.76%,而谷胱甘肽硫-转移酶(GST)活性显著升高,雄蚕GST的平均活性为31.86 U/L,雌蚕为31.80 U/L,分别高于对照46.15%和27.30%。与此同时,γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)活性在蚕体中也有不同程度的升高,其中在雄蚕体内的变化极为显著;谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)和谷胱甘肽合成酶系的活性在蚕体内均无显著变化。以上结果表明:SO2刺激可对家蚕血淋巴中的GSH含量及其相关酶的活性产生影响,且雌、雄蚕对SO2的敏感性不同;GSH含量的减少及其相关酶活性的上升,说明SO2对蚕体的毒害作用与其降低蚕体抗氧化物质水平、削弱抗氧化防御系统有关。     

家蚕近等基因系感染浓核病毒(BmDNV-Z)前后中肠组织蛋白的差异表达分析

家蚕浓核病毒(BmDNV)是危害家蚕的主要病毒之一。为鉴定与家蚕抗病毒相关的蛋白质,以对BmDNV完全不感染的家蚕品种兰10(L10)为供体亲本,将其抗性基因导入家蚕敏感品种菁松(JS)中,构建抗性近等基因系NIL(BC6F2)。对JS及其近等基因系NIL分别用家蚕浓核病毒镇江株(BmDNV-Z)添毒,二者分别表现为高度敏感和完全不感染。对JS和NIL在病毒感染前后中肠组织蛋白双向电泳(2D-PAGE)图谱中的差异蛋白点进行串联质谱(MALDI-TOF-TOF)分析,共鉴定了41个差异表达的蛋白点,其中有35个蛋白点可能与病毒的诱导相关,有6个蛋白点可能与家蚕的组成抗性相关。鉴定的差异表达蛋白包括糖酵解酶类、能量代谢酶类、参与基因表达的蛋白质以及参与其它细胞功能的蛋白质等。选取10个差异表达蛋白点进行基因表达定量PCR分析,进一步确证了这些蛋白质在JS及其近等基因系NIL之间以及在病毒诱导前后的差异表达。例如:精氨酸激酶在NIL和JS中均可被诱导表达;V-ATP合成酶及热激蛋白HSP70只在NIL中被特异性诱导表达;烯醇化酶在NIL中的表达水平显著高于JS,且不能被病毒感染所诱导,是一个典型的组成抗性相关蛋白。鉴定出的41个差异表达蛋白点有可能参与了家蚕对BmDNV-Z的抗性。     

家蚕耐氟近等基因系SSH文库的构建及部分差异表达基因的分析

为了获取与家蚕耐氟性状相关的基因信息,利用家蚕耐氟品种T6和氟化物敏感品种733新建立耐氟近等基因系,以回交11代的家蚕耐氟近等基因系群体中的耐氟个体和敏感个体的中肠为材料,构建家蚕耐氟近等基因系抑制消减杂交(SSH)cDNA文库。通过对抑制消减杂交cDNA文库中随机挑选的153个阳性克隆测序和聚类拼接,得到19个重叠群(con-tig)、47个已知功能基因(un igene)和28个未知功能基因。获得的表达序列标签(EST)经BLASTx比对和同源性分析,初步发现这些基因参与家蚕体内物质转运、能量代谢、基因转录、蛋白质合成与降解、蛋白质加工、信号转导、机体免疫防御、细胞结构形成等诸多生物学过程。采用实时定量RT-PCR方法,对部分基因在家蚕耐氟近等基因系群体中的耐氟个体和敏感个体的不同组织的表达进行定量分析,发现磷酸根离子转运蛋白基因、三磷酸腺苷(ATP)合成酶基因、液胞型H+-ATP酶基因、脂肪酶基因以及主要过敏原蛋白基因在耐氟个体的中肠、马氏管、脂肪体组织中的表达量有较明显上调。     

家蚕富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白基因BmSPARC的表达及亚细胞定位

富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)是一种小分子酸性糖蛋白,在有机体内广泛分布,通过与胞外基质蛋白相互作用而表现出多种生物活性。从家蚕蛹cDNA文库中获得SPARC基因(BmSPARC)的cDNA序列,GenBank登录号为FJ602783。利用生物信息学方法对此序列进行分析表明,BmSPARC的cDNA序列全长1 626 bp,含有1个954 bp的开放阅读框(ORF),编码317个氨基酸残基;同源性比较显示该基因编码蛋白的氨基酸序列在无脊椎动物中具有较高的保守性。将BmSPARC片段在大肠杆菌BL21中表达并纯化后,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,通过亚细胞定位研究发现该基因表达蛋白主要存在于细胞质中。利用实时荧光定量PCR的方法,对BmSPARC在家蚕不同发育时期、不同组织中的mRNA转录水平进行比较,并采用Western blotting方法对BmSPARC蛋白的表达进行分析,结果表明:BmSPARC在家蚕卵期和5龄幼虫丝腺组织中无表达,而在5龄幼虫、蛹、蛾发育时期及5龄幼虫的头部、脂肪体、中肠、马氏管、卵巢、表皮和气门等7个组织中均有不同程度的表达,其中在蛾期和5龄幼虫卵巢中的表达量较高。研究结果为进一步探讨BmSPARC在家蚕生长发育过程中的生物学功能打下了基础。     

家蚕蜕皮激素22激酶2(BmEcK2)的序列及基因表达特征分析

前期研究发现在感染家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrovirus,Bm CPV)的家蚕幼虫中肠中,有一个下调表达的差异蛋白可能参与了家蚕对Bm CPV感染的抵抗过程。利用Blastp进行同源性比对的结果显示,该蛋白质与尺蠖(Operophtera brumata)的未知蛋白质OBRU01_04785和蜕皮激素22激酶(Ecdysteroid 22-kinase)的序列相似度分别为51%、49%,进一步通过多序列比对和系统进化分析发现该蛋白质与Ecdysteroid 22-kinase蛋白的亲缘关系最近,属于蜕皮激素激酶超家族;该蛋白质与家蚕中已知的蜕皮激素22激酶1(Bm Ec K1)的序列相似度为24.4%,因此将其命名为Bm Ec K2。实时荧光定量PCR检测Bm Ec K2基因m RNA在家蚕5龄幼虫中肠组织中的转录水平最高,其次是马氏管、丝腺和卵巢,而在血淋巴、头部、精巢、脂肪体中几乎检测不到转录;家蚕5龄起蚕感染Bm CPV后24、48、72 h,中肠中Bm Ec K2基因m RNA的转录水平下调,分别是对照组家蚕中肠的0.32、0.45和0.21倍。研究结果初步提示,Bm CPV感染导致家蚕中肠中的Bm Ec K2下调表达,进而可能影响到家蚕体内激素调节水平的变化。     

不同发育阶段家蚕体内抗坏血酸含量的变化

抗坏血酸又称维生素C(Vc),是家蚕幼虫生长发育必需的营养物质。为探讨在非取食阶段家蚕体内还原型抗坏血酸(AsA)的来源,采用分光光度法测定家蚕在不同发育时期以及不同条件下体内的AsA含量和总抗坏血酸(TAA)含量变化,并采用实时荧光定量PCR检测AsA合成相关酶基因在家蚕不同发育阶段的表达量变化。滞育卵中AsA含量在产卵24 h内,TAA含量在产卵72 h内均有所增加,此后二者的含量均不同程度降低并一直保持相对稳定;即时浸酸解除滞育蚕卵的AsA含量在产卵24 h内显著增加,且在产卵48~144 h一直保持较高水平,到胚胎发育后期又明显下降,但AsA含量一直高于滞育卵。幼虫期取食桑叶或添加Vc的人工饲料之后,蚕体内AsA和TAA含量均增加,幼虫在眠中或取食缺乏Vc的人工饲料及饥饿一定时间后,体内的AsA和TAA含量均明显降低,尤其是饥饿后体内的AsA含量会下降到很低的水平。蛹期的TAA含量无显著变化,但雌蛹体内AsA含量在化蛹0~24 h显著升高,雄蛹体内AsA含量在化蛹0~144 h一直保持较高水平,到蛹后期才有较为明显的下降。编码AsA合成相关酶的4个同源基因BmG ULO_like1、BmG ULO_like2、BmA Lase_like1、BmA Lase_like2在中肠和脂肪体中的表达量总体上都是卵期及蛹期显著高于幼虫期,并且随卵和蛹的发育进程呈上升趋势。研究结果提示,家蚕胚胎发育期和蛹期的AsA来源途径,可能包括自身合成途径及由氧化型抗坏血酸(DHA)还原为AsA的途径,而在幼虫期主要从食物中吸收Vc,缺乏其他来源。     

家蚕脂质运载蛋白基因BmLip32的特征与表达活性分析

从已构建的家蚕蛹期cDNA文库中筛选得到一条新的cDNA片断,经生物信息学分析发现其编码框具有脂质运载蛋白(lipocalin)保守结构域,命名为BmLip32基因,GenBank登录号为FJ602775。构建融合表达质粒pET-28a-BmLip32后转化大肠杆菌BL21并诱导表达,将纯化的His-BmLip32融合蛋白免疫新西兰大白兔成功制备多克隆抗体,效价大于1∶12 800。RT-PCR检测结果表明BmLip32在家蚕蛹期转录水平最高,在5龄幼虫头部中的转录水平明显高于其它组织。Western blotting分析结果显示BmLip32在5龄幼虫头部大量表达。免疫细胞化学实验显示BmLip32蛋白存在于家蚕Bm5细胞的细胞质中。推测BmLip32基因是家蚕神经系统发育相关的重要调控基因。     

家蚕抗浓核病近等基因系及其RAPD分子标记

用抗浓核病的蚕品种东 3 4 (rr)与感病的品种菁松 (RR)杂交 ,再以菁松作轮回亲本 ,进行回交育种。由于家蚕抗浓核病基因表现隐性 ,因此 ,用测交添毒选择方法保留抗病基因 (r) ,通过回交 5代和自交一代的选择培育获得了抗浓核病的近等基因系菁东。对 2个品系及抗病亲本用 50个随机引物进行了RAPD分析。     

氟中毒家蚕幼虫血淋巴中谷胱甘肽过氧化物酶的活性

为了解家蚕氟中毒的机理 ,研究了氟中毒家蚕幼虫血淋巴中谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH—Px)的活性。正常的家蚕 5龄幼虫血淋巴中GSH—Px活性在龄中期较强 ,龄初和龄末较弱。幼虫添食 10mmol/L的氟化钠溶液后 ,GSH—Px的活性显著增强