Ⅰ群禽腺病毒12个血清型毒株Hexon蛋白全基因序列测定和酶切位点分析

利用3对引物(A、B、C)分别进行Ⅰ群禽腺病毒的12个血清型毒株的Hexon全基因序列PCR扩增,并进行序列测定和PCR-RFLP分析,通过DNAStar软件和MEGA软件进行序列分析并绘制遗传发育进化树。结果显示,Hexon基因全长为2 800左右个核苷酸,编码约940个氨基酸,不同血清型之间的同源性为75.2%～99.5%,变异范围是0.0%～24.3%。推导的氨基酸同源性为20.7%～98.8%,差异性为0.0%～24.2%。12个血清型之间Hexon全基因序列信息用来评价Ⅰ群禽腺病毒家族的种系发育关系,构建的进化树显示出5个主要的分支。选用限制性内切酶HaeⅡ,利用存在差异的Hexon序列片段D特异性可以有效区分大部分血清型。结果表明,获得了Ⅰ群禽腺病毒12个血清型不同毒株的Hexon全基因序列并进行了分子进化分析,同时结合12个血清型PCR-RFLP分析,为进一步分析鉴别Ⅰ群禽腺病毒不同血清型提供依据。     

11株禽腺病毒遗传变异分析

为了分析2019年禽腺病毒(FAdV)遗传变异情况,通过PCR分段扩增、测序,获得11株FAdV Hexon基因序列。经分析发现,11株腺病毒Hexon基因高变区核苷酸序列同源性为66.1%～100.0%,推导编码的氨基酸序列同源性为56.5%～100.0%;与参考株核苷酸序列同源性为65.4%～100%,与参考株氨基酸序列同源性为56.5%～100.0%。其中9株序列基因长度均为738 nt,编码246个氨基酸;GX-1901001毒株序列基因长度均为750 nt,编码250个氨基酸;HB-1911039毒株序列基因长度均为756 nt,编码252个氨基酸。与目前流行株相比,本试验获得的11株腺病毒Hexon基因存在不同程度的变异或缺失,在进化树中已形成多个小分支。表明我国FAdV在流行过程中已出现变异。本试验结果为监测和分析我国FAdV的变异和演化提供了有价值的基因信息数据。     

11株血清4型禽腺病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了阐明Ⅰ群禽腺病毒在我国部分地区鸡群的感染状况,对2015年10月~2016年10月采集自山东、河北等鸡场疑似禽腺病毒感染病鸡的肝脏样品,通过病毒分离、PCR、动物回归试验等进行分离鉴定,最终鉴定出11株血清4型禽腺病毒。根据Gen Bank上发表的Ⅰ群禽腺病毒(FAd VⅠ)Hexon基因序列设计引物,对分离的11个毒株测序,并与其他血清型参考毒株进行比较分析。结果表明:分离的11株FAd V同源性高达99.7%以上,与FAd V-4参考毒株的核苷酸序列的同源性在98.3%~99.7%之间,与FAd V-10血清型序列同源性较近,为97.2%,而与FAd V-5、FAd V-8血清型同源性较低,仅在66.4%~87.2%之间。研究结果为FAd V的防控和新疫苗研发提供了可靠的理论依据。     

Ⅰ群禽腺病毒hexon基因分型与序列分析

对鸡群中感染的Ⅰ群禽腺病毒hexon基因进行分型与序列分析,以期明确Ⅰ群禽腺病毒基因型的分布和hexon基因变异情况。参考GenBank上FAdV基因序列,设计2对引物,采用套式PCR技术扩增临床病料中Ⅰ群禽腺病毒hexon基因,测序后获得了8株FAdV hexon基因片段。结果表明,构建系统进化树发现,其中HM、SXFS、LQQD、HXGB、GSPL、DYQY和FP共7株属于FAdV-4型,而GS株属于FAdV-1型。7株FAdV-4型毒株核苷酸同源性在99.9%～100%之间,推导的氨基酸序列同源性均为100%,提示这7株FAdV-4型流行毒株高度同源。FAdV-1型的GS与CELO株核苷酸、推导的氨基酸序列同源性均为99.2%,提示GS与CELO株亲缘关系较近。在鸡群中发现存在FAdV-1型和FAdV-4型Ⅰ群禽腺病毒,各血清型毒株之间高度同源,毒株遗传稳定性高。     

鸵鸟Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定、血清型鉴定以及Hexon蛋白基因序列分析

对3份来自不同地方的病死鸵鸟进行病理剖检、病原分离鉴定,确诊为Ⅰ群禽腺病毒感染,并成功分离到3株鸵鸟FAV-Ⅰ。采用PCR方法成功扩增2株临床分离株的Hexon基因,分别克隆于p MD20-T载体,对其进行了核苷酸序列测定、同源性比较及遗传进化分析。并运用Ⅰ群禽腺病毒12个标准毒阳性血清对其中2株毒进行了血清型鉴定。结果显示,分离株2014.07.10-HBHD-TN、2014.07.19-HBHS-TN与12个标准株之间的同源性在72.5%~98.0%之间,其中与FAV-4的同源性最高是98.0%。在系统进化树中,这两个分离株均位于FAV-I的大分支中,且与FAV-4位于同一小分支。这2个分离株经血清学鉴定均为血清4型的毒株。     

禽腺病毒12个血清型代表毒株的分子生物学鉴定研究

为建立和完善禽腺病毒(FAdV)标准毒株库,针对FAdV不同种的纤突(Fiber)和六邻体(Hexon)序列设计引物,对中国兽医药品监察所保藏的FAdV 12个血清型代表毒株进行PCR扩增和遗传进化分析,完成了对毒株的分型鉴定,再结合同种不同血清型病毒Hexon序列上酶切位点的特征,用酶切法验证了毒株不存在同种中不同血...     

鸡腺病毒HZBL-S1株Hexon蛋白基因序列测定与遗传进化分析

为了解广东省禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV) HZBL-S1株遗传进化情况,试验对HZBL-S1株六邻体(Hexon)蛋白全基因进行PCR扩增、克隆和序列测定,并对其进行蛋白全基因序列及其氨基酸推导序列的遗传进化分析。结果表明:HZBL-S1株与来自国内外的FAdV基因C型、血清型为4型的参考株的相似性较高,核苷酸(推导的氨基酸)序列的相似性为98.2%～99.9%(98.5%～99.9%)。对Hexon蛋白全基因核苷酸序列及其氨基酸推导序列进行遗传进化分析,HZBL-S1株与基因型为A、B、D、E型的参考株均处于进化树的不同分支,遗传距离相对较远;而与基因型为C型、血清型为4型的参考株均处于进化树的同一分支,遗传距离相对较近。说明HZBL-S1株与基因型为C型的参考株来自同一祖先,推测该病原有可能由国外经某种途径传入我国。     

H5N1亚型禽流感病毒新疆株NS基因的克隆和序列分析

根据已发表的H5N1禽流感病毒NS基因全序列设计了1对引物，对4株禽流感病毒新疆株的NS基因进行了RT—PCR扩增，并将其克隆到pMD18-T载体上，分别获得了全长为817、851、854、854bp的全基因序列。序列分析结果表明，新疆毒株间的核苷酸同源性为97．8％～98．9%，氨基酸同源性为96．5％～98．7％，与广东、香港和东南亚等不同地区的11个毒株比较，同源性为90．0％～99．4％；与来自野禽、猪等不同种类的11个流感毒株比较，同源性为81．4％～99．3％。系统进化树分析表明，新疆株独立分支。     

Ⅰ群禽腺病毒血清4型QD株的分离与鉴定

为了对Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的毒株进行分离,试验采用病毒分离、DNA提取、PCR鉴定、Hexon基因序列分析、病毒毒价测定、病毒形态学观察及动物回归试验等方法对青岛地区疑似心包积水及包涵体肝炎病鸡的肝脏进行了研究。结果表明:该分离毒株提取的DNA经PCR鉴定为阳性;该分离毒株序列与已发表的Ⅰ群禽腺病毒4型序列同源性为97.7%,病毒毒价为1×10~8TCID_(50)/0.1 mL;病毒形态为球形、无囊膜、二十面体对称的粒子结构;在动物回归试验中,病死肉鸡心包有积液,发病鸡肝脏的中央静脉广泛淤血,肝细胞发生空泡样变性,细胞浆和细胞核内可见嗜碱性包涵体。说明该分离株为Ⅰ群禽腺病毒血清4型毒株。     

蓝舌病病毒血清1型野毒株及疫苗株S10基因差异

蓝舌病病毒血清型 1型是主要致病血清型之一。为明确其流行规律的分子生物学基础 ,采用 RT- PCR扩增和序列测定技术分析了 15株野毒株及 1株弱毒疫苗株的 S10全基因片段 ,并对其核苷酸和氨基酸差异进行了比较。所有毒株 S10基因核苷酸长度均为 82 2 bp,含有 2个起始密码子 (核苷酸 2 0～ 2 2和 5 9～ 6 1)和 1个终止子 (核苷酸 70 7～70 9) ,预测编码 2种蛋白 (NS3和 NS3A)。不同毒株间 S10基因核苷酸差异为 0～ 138个 (同源性 10 0 %～ 82 %) ,NS3/NS3A蛋白氨基酸差异为 0～ 15个 (同源性 10 0 %～ 93%)。基于 S10基因序列分析 ,可将蓝舌病病毒野毒株及疫苗株分为 2个基因群 :12株野毒株及 1株疫苗株为基因 群 ,3株野毒株与澳大利亚 型毒株属于基因 群 ,两群间的核苷酸同源性为 79%。各基因群在地域分布及宿主来源上未发现有明显的特征性。基因群与毒株分离年代、对 BHK- 2 1细胞毒力等特征关系亦不明显。     

鉴别犬瘟热病毒疫苗株和野毒株RT—PCR—RFLP方法的建立及应用

根据Onderstepoort株H基因序列,设计1对引物建立RT-PCR-RFLP检测方法,对不同宿主来源的疑似犬瘟热临床样品进行检测,并对检出的犬瘟热病毒野毒山东株PCR产物进行克隆和序列分析,验证RT—PCR—RFLP检测方法。结果RT—PCR扩增片段为1921bp,产物经RFLP分析,野毒株的PCR产物能被NdeI酶切为1282、345和294bp3个片段,弱毒疫苗株则不能被切开;病毒RNA的最小检出量为2．15ng。临床检测共检出19份样品为犬瘟热阳性,其中15份为野毒株感染,其H基因编码区全长为1824bp,均在1279和1543处有NdeI酶切位点,推导氨基酸与野毒株的同源性在92．9％～96．9％,与疫苗株的同源性在89．0％～90．8％,进化树分析显示这些毒株在基因型上属于Asia-1型,为野毒株谱系。该方法的建立为临床上犬瘟热病毒的鉴别检测和诊断提供了依据。     

禽腺病毒血清4型吉林株的分离鉴定与遗传变异分析

对吉林地区送检的疑似禽腺病毒感染样品进行了分子流行病学调查,并对检测为阳性的样品进行病毒分离鉴定,共得到61个I型禽腺病毒流行毒株。对hexon基因进行的PCR扩增,获得长度为1 414,1 786,1 670bp的基因片段。通过测序分析发现,吉林地区禽腺病毒流行毒株基因型由B型变化为C型,血清型4型。根据同源性分析结果显示,本次获得的3个分离株与禽腺病毒4型标准毒株ON1株的核苷酸序列相似性较高,达到了99.1%。     

I群禽腺病毒江苏分离株(FAVI-JS)的分离鉴定

通过形态学、致细胞病变和序列比较等对一株疑为I群禽腺病毒江苏分离株FAVI_JS进行了鉴定 ,试验结果表明 :该病毒为球形、无囊膜、二十面体对称 ,直径为 70nm～ 80nm ;不具有凝集鸡、鸭、鹅红细胞的能力但可以凝集大鼠红细胞。在鸡胚肾细胞 (CEK)上可致细胞变圆 ,折光性增强等病变 ;通过PCR方法扩增出的FAVI_JSL、R、ITR三个片段 ,经过测序分析并与GenBank上发表的属于血清I型的CELO病毒、FAV_1、FAV_A和血清 8型的禽腺病毒 (FAV_8)全基因组的相应序列比较 ,FAVI_JS与I群禽腺病毒各毒株在三个片段上同源性都很高 ,其中与血清I型的同源性高达 96 %以上 ,在根据对遗传上具有重要意义的ITR序列绘制的遗传进行树分析 ,FAVI_JS与Ⅲ群禽腺病毒EDS、Y81G4株明显属于不同的分支 ,而与群禽腺病毒 ,特别是与血清I型的禽腺病毒更接近 ,这些结果证明 ,FAVI_JS确为I群禽腺病毒     

五华鸡J亚群白血病病毒env部分基因的和序列分析

本试验通过PCR技术获得了安徽省地方品种五华鸡禽白血病病毒J亚群(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)env部分基因序列AL V-J-env1,并将该序列与GenBank数据库中登录的8条env基因相应序列进行了比对分析.结果表明,五华鸡已经感染了J亚群禽白血病,且部分鸡个体已经发病.通过分析可见,AL V-J-env1与所比较的基因序列同源性介于94.2％～96.6％之间,说明不同毒株之间的env基因有一定变异.但与ALV J-env1同源性最高的是来自于中国ALV-J毒株的HQ425636和HM235665基因序列,且在进化树中聚集为一组,暗示它们之间亲缘关系较近,由共同的毒株进化而来.与ALV-J-env1同源性最低的是来源于马来西亚毒株的AY312965基因序列,遗传进化分析也进一步证实,两者之间亲缘关系较远.     

6株猪圆环病毒2型山东分离株ORF2基因的克隆与序列分析

分别从山东省6个地区的猪圆环病毒2型(PCV2)阳性病料中PCR扩增ORF2基因。以ORF2为靶基因进行6个毒株的分子流行病学分析。序列同源性分析表明,6个毒株之间的核苷酸序列同源性为93.3%～99.7%,氨基酸序列同源性为92.3%～100%;氨基酸序列存在2个高变区,分别位于序列的57～90和190～220位区域,其中57～90区域位于结构蛋白的免疫反应活性区;遗传进化树分析显示,SDI、SD Ⅲ、SD Ⅴ、SD Ⅵ与法国株和中国农大株共同形成一群,可能起源于共同的祖先;SD0282、SD Ⅳ与其他7株PCV2毒株共同形成另一大群,与海南株的亲缘关系最近;结合GenBank报道的山东境内分离的13个毒株的ORF2基因序列进行RFLP分析,可将该省PCV2流行毒株分为CHN-2H型、CHN-2F型、CHN-2I型和二种新的基因型,命名为CHN-2J和CHN-2K型。其中,CH-2H型所占比例最高,为优势基因型,是引起该省规模化猪场暴发PCV2疾病的主要基因型,因此研制防治该省PCV2的疫苗应以此基因型为主。     

传染性法氏囊病病毒BC6/85株全基因组克隆及其序列分析

以传染性法氏囊病病毒（IBDV）BC6／85株基因组RNA为模板,采用RT—PCR方法扩增并克隆了IBDVBC6／85株基因组全长eDNA。序列测定结果表明：A节段全长共3260个核苷酸,与IM株的同源性最高为97．4％,与其他血清I型毒株的核苷酸同源性介于91．2％～97．1％;B节段有2827个核苷酸,与IM株同源性最高为98．6％,与其他毒株的核苷酸同源性为88．7％～98．6％。通过对编码的氨基酸序列进行分析,发现BC6／85株有21个特有氨基酸,其中15个位于多聚蛋白VP2—4—3。系统进化树分析表明,BC6／85株与经典毒株、弱毒株和变异株的关系较近,而与超强毒株相对较远。     

应用PCR检测禽腺病毒

根据禽腺病毒 CELO株的基因序列 ,设计合成了 1对引物 :上游引物为 5′-CCCTCCCACCGC-TAACCA-3′,下游引物为 5′-CACGTTGCCCTTATCTTGC-3′。用这对引物对 群禽腺病毒中 1 2个血清型病毒和 1 9个分离野毒株、 群 4个血清型病毒、 群禽腺病毒株的核酸模板进行了 PCR扩增 ,结果均特异性地扩增出了与设计片段大小相一致的 4 2 1 bp片段 ,而对其他 5种禽病病原体和哺乳动物腺病毒血清 2型核酸模板的扩增均为阴性。该 PCR能检出 1 fg禽腺病毒 DNA模板     

咸阳地区猪瘟病毒 E2基因扩增与序列分析

为了解陕西咸阳地区猪瘟流行毒株 E2基因变异情况,采用套式 PCR 方法,扩增了17个流行毒株和2个市售疫苗毒株 E2基因主要抗原区,并进行了序列比对分析。结果表明,17个流行毒株和兔化弱毒株（HCLV）株相比,E2基因主要抗原区核苷酸同源性在79．0％～80．9％,氨基酸同源性在80．0％～84．4％。市售疫苗和 HCLV 株核苷酸同源性为93．4％,氨基酸同源性为90．0％。系统发育树分析发现17个流行毒株同属基因Ⅱ群。流行毒株与 HCLV 相应氨基酸位点相比,总体变异氨基酸位点占26．4％,呈现出典型的变异特征。17个流行毒株在2个氨基酸关键位点出现了705（T→I）、729（L→A）变异现象,可能导致抗原性发生改变。发现 E2蛋白高保守序列 RYLASLH（713～719）变异现象,即 XYSY01株719位发生了 H→R 变异。结果提示,近年陕西咸阳地区猪瘟病毒流行毒株变异较为一致,E2基因核苷酸与编码氨基酸有较明显的变异。     

鸽源Ⅰ型禽副黏病毒HN基因序列测定和分析

以分离自云南省的一株鸽源禽I型副黏病毒YN-P1株的基因组RNA为模板,通过RT-PCR的方法扩增出HN基因片段,然后将其克隆至T载体中。经PCR鉴定后,对阳性克隆进行核苷酸序列测定。测序后拼接得出HN基因的全序列。测序结果显示,YNP1毒株HN基因为1 716 nt。通过与参考毒株比较HN基因序列,发现所研究毒株YN-P1与TW95核苷酸序列同源性最高为88.3％;与ZJ1／Go氨基酸序列同源性最高为91.6％。     

中国2005年～2006年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析

本研究应用RT—PCR方法扩增到我国2005年-2006年8个省市12株IBV病毒核蛋白基因,并将其进行了克隆、序列测定及分析。以疫苗株H120作为参考毒株,对12株IBV分离株核蛋白基因序列进行分析。结果发现我国分离株的N基因及其局部功能区序列存在广泛的氨基酸替代现象。同时还发现毒株CK／CH／LSD／05I与疫苗株H120同源性最高（93.4％）。与GenBank中的11个IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,发现本研究分离的大部分毒株（9株）分布于第1群中,可见我国主要的IBV分离株在N基因进化关系上形成了自己独立的进化群。通过与S1基因系统发育进化树比较发现,毒株CK／CH／LSD／05I存在基因重组现象。以上结果表明我国2005年-2006年IBV毒株存在基因突变和基因重组现象。