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水稻条纹病毒编码的Pc2蛋白在病毒侵染及宿主症状发生中起作用。研究其与寄主间的分子互作有助于揭示病毒侵染与致病的分子机制。分别将编码Pc2 N端(Pc2-N)与Pc2 C端(Pc2-C)的基因片段克隆到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7上,并构建水稻叶片cDNA文库,然后分别用Pc2-N和Pc2-C为诱饵筛选文库寻找与其互作的寄主因子。结果表明,诱饵载体中插入的Pc2-N和Pc2-C编码框和氨基酸序列均正确。Pc2-N对酵母菌株AH109无毒性和自主激活能力,但Pc2-C对酵母具有细胞毒性。文库滴度为4×107 CFU/mL,且大多数插入片段在500~2 000 bp之间。利用Pc2-N为诱饵筛选水稻cDNA文库,获得有8个候选阳性克隆。经序列测定和BLAST分析结果表明,这些克隆共编码5种蛋白,主要为胁迫相关蛋白与光系统相关蛋白。 相似文献
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为解析白粉病菌侵染小麦以及小麦防御的分子机制,以抗白粉病种质N9134为材料,剪取白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.tritici,Bgt)接种48 h后的叶片,提取总RNA,利用SMART技术进行反转录合成双链cDNA(ds-cDNA),并进行均一化处理和SfiI酶切处理,处理后的ds-cDNA分别连接pGADT7-SfiI三框载体,将连接产物转化至感受态细胞HST08中构建文库。通过滴度测定和PCR鉴定其库容量和基因重组率,最后收集细菌并提取质粒。经鉴定,该文库库容量大于1.0×10~6 cfu·mL~(-1),插入片段主要分布在400~2 000 bp之间,重组率为100%,冗余度为3%。利用酵母双杂交系统筛选cDNA文库,获得2个与热休克蛋白HSP40-70互作的蛋白质,分别为DnaJ类蛋白(DnaJ-like)和E3泛素蛋白连接酶AIP2(AIP)。综上表明,文库构建质量较好,为后续筛选抗逆关键基因奠定了基础。 相似文献
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油菜与核盘菌相互作用的过程中,JA(茉莉酸)合成相关基因表达量升高,但是JA信号传递却受到了抑制,推测核盘菌分泌的效应蛋白可能直接或间接作用于JAR1蛋白,使其活性降低,从而抑制依赖JA途径的油菜防御系统。前期通过转录组测序获得了差异表达基因BnJar1全长序列,为进一步揭示BnJar1基因参与油菜-核盘菌相互作用过程的机理,本研究对BnJAR1蛋白进行生物信息学分析和预测,构建了核盘菌-油菜互作表达基因酵母文库,并以BnJar1作为诱饵蛋白对文库进行酵母双杂交筛选,获得了5个来自油菜的互作蛋白:丙二烯氧化物环化酶2(BnAOC2)、COP9信号复合物(BnCOP9)、4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶(BnDcoH)、腈水解酶2(BnNIT2)和茎特异性蛋白(BnTSJT1);2个来自核盘菌的互作蛋白:MFS结构域蛋白(SsMFS)和Rho3 GTP酶(SsRho3)。相关结果为研究油菜-核盘菌的相互作用,挖掘致病或抗病相关基因,进一步解析其机理奠定了基础。 相似文献
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为研究Gm SPX3在大豆低磷胁迫响应中的作用机制,寻找与Gm SPX3发生相互作用的蛋白质,利用Gateway技术构建了低磷大豆根系酵母杂交c DNA文库,并使用p GBKT7-Gm SPX3融合蛋白为诱饵,采用酵母双杂交方法筛选酵母杂交c DNA文库,经过显色反应验证后获得21个阳性克隆,通过生物信息学分析,选择2个转录因子编码基因Gm UNE12和Gm Pos F21作为候选基因进行克隆,并分别构建AD载体p GADT7-Gm UNE12和p GADT7-Gm Pos F21,与诱饵p GBKT7-Gm SPX3进行一对一互作验证,结果证明Gm UNE12和Gm Pos F21蛋白均与Gm SPX3诱饵蛋白发生了相互作用。 相似文献
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酵母双杂交技术研究NS3蛋白及其与CP,SP,NSvc4之间的互作 总被引:1,自引:0,他引:1
采用RT-PCR扩增水稻条纹病毒基因NS3,构建酵母表达载体,将其分别连接酵母诱饵载体pGBKT7与酵母捕获载体pGADT7,得到重组子pGAD-NS3和pGBK-NS3。自身毒性的实验结果表明,NS3蛋白对酵母细胞无毒性,其自身也没有自激活活性,不存在自身互作。将这2个重组子分别与水稻条纹病毒外壳蛋白CP、病害特异性蛋白SP、运动蛋白NSvc4两两共转化到酵母感受态细胞AH109中,转化产物涂布营养缺陷型培养基二缺、三缺、四缺平板,后经X-a-Gal染色观察,结果表明,NS3与SP的转化产物能在三缺平板上生长并在相应培养基中变蓝色,说明NS3与SP蛋白存在互作,该结果有助于进一步研究NS3蛋白的功能及彼此的互作在水稻条纹病毒致病机理上的作用。 相似文献
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利用Trizol法提取接种PRsv 4 d的番木瓜种苗总RNA,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,双链cDNA末端经Pfu-DNA聚合酶补平,与EcoR I接头连接,XhoI酶切消化产生粘端.用Sepharose CL-2B柱分离纯化去除小分子cDNA片段,再与pMyr酵母表达载体连接,转化受体菌XL10-Gold,构建了接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库.所获得的原始文库的克隆总数为1.8×106cfu,重组率为100%,文库滴度为2.6×109cfu/mL.对随机选取的34个克隆进行PCR鉴定,结果表明插入片段长度均大于O.5 kb且集中在1 kb左右.文库质量鉴定结果表明,该文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段. 相似文献
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植物KNOX(Knotted1-like homeobox)可通过蛋白质相互作用参与调控落果、纤维细胞发育、次生细胞壁发育、开花等事件。为筛选剑麻叶中与AhKNOX2相互作用的蛋白,采用SMART同源重组技术构建剑麻叶片酵母双杂交表达文库,利用AhKNOX2为诱饵筛选与之相互作用的蛋白。结果表明:文库总容量为3.9×106 CFU,转化效率为9.15×105 CFU/μg pGADT7-Rec,插入片段大小主要分布于0.5~3.0 kb之间,重组率为92%,保存的文库细胞密度为1.35×108/mL,文库滴度为2.22×107CFU/mL。构建的pGBKT7-AhKNOX2诱饵载体存在自激活性,5 mmol/L的3-氨基- 1,2,4-三唑(3-Amino-1,2,4-triazole,3-AT)能抑制诱饵载体的自激活,通过筛选获得了16个与AhKNOX2相互作用的蛋白。本研究成功构建剑麻叶片酵母表达文库,并筛选获得与AhKNOX2相互作用的蛋白,该结果为进一步研究AhKNOX2在剑麻中的功能奠定前期基础,为培育高纤维产量的剑麻新品种提供基因资源和理论基础。 相似文献
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针对小麦黄花叶病毒(WYMV)和中国小麦花叶病毒(CWMV)在症状、传播途径、发生规律等方面高度相似、难以用常规手段鉴定的问题,根据两种病毒基因序列的异同点设计了三条引物CWWY-R2、CW1-F2和WY1-F2,以植物总RNA为模板、CWWY-R2为引物反转录合成cDNA.通过优化建立了一种同步检测两种病毒的反应体系:cDNA1.6 μL,引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL,10×PCR Buffer(不合Mg2+)2μL,dNTPs(10 mmol·L-1 each)0.4 μL,Taq DNA聚合酶(5U·μL-1)0.8μL,MgCl2(25 mmol·L-1)0.8μL,ddH2O 13.2 μL,合计20 μL; PCR反应条件:94 ℃预变性5 min,94℃ 50 s,50℃50 s,72℃90 s,共30个循环,72℃延伸10 min.WYMV和CWMV的PCR扩增预期目的片段分别为508和918 bp.利用该方法对江苏高邮、扬州和大丰的样本进行检测,它们分别为WYMV、WYMV、CWMV单一侵染,证明该方法准确性较高,可用于两种病害同步检测. 相似文献
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根据Banerjees等(1992)的方法,建立了中国小麦花叶病毒(CWMV)和大麦黄花叶病毒(BaYMV)外壳蛋白(CP)叶绿体离体跨膜运输体系,研究了孵育时间、CP浓度对跨膜运输效率的影响。结果表明,CWMV-CP和BaYMV-CP可分别快速进入离体的小麦与大麦叶绿体中,其跨膜运输所需的孵育时间均最低为5min,孵育时间超过15min后进入叶绿体中CP的量不受影响;加入跨膜体系中CP的浓度与跨膜后进入叶绿体的CP浓度呈正相关,能够实现跨膜的最低CWMV-CP和BaYMV-CP浓度分别为4.2和37.8μg.mL-1。 相似文献
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小麦黄花叶病毒病是危害我国冬小麦的一种重要病害,为明确山东小麦生产品种对该病害的抗性水平,给山东小麦黄花叶病毒病育种、病害防控及品种合理布局提供参考信息,于2012-2015年在山东省莒南县板泉镇的小麦黄花叶病毒病品种抗病性鉴定圃,对山东80个小麦生产品种进行了抗性评价和产量性状分析。结果表明,在供试的80个小麦品种中,济麦22、烟农5158、鲁原231、鲁原304、良星99、烟农0428、烟农173、烟农999、阳光10、红地09-5、山农18、山农29、烟农426、烟农836、济南17共15个品种对小麦黄花叶病毒病表现为抗病,占供试品种的18.75%;烟农24、鲁原502、济麦21、泰农1014等31个品种表现中抗,占供试品种的38.75%;其余34个品种表现为感病,占供试品种的42.5%。感病品种产量的损失率与有效穗数、穗粒数、千粒重3因素的综合损失率密切相关。 相似文献
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分子标记辅助聚合抗小麦黄花叶病和白粉病育种 总被引:2,自引:0,他引:2
抗白粉病基因Pm21和PmV定位于不同簇毛麦种质的6VS染色体臂,对已知白粉病生理小种均表现高抗。小麦-簇毛麦小片段顶端易位系NAU421(T4VS-4DS·4DL)携带Wss1基因,高抗小麦黄花叶病。为选育兼抗小麦黄花叶病和白粉病的育种新材料,以NAU421为亲本,分别与携有Pm21基因的品系Y16-Pm和携有PmV基因的品种扬麦22杂交,构建F2代分离群体,然后利用与Wss1和Pm21/PmV基因连锁的共显性分子标记CINAU301和MBH1对F2代进行检测。结果表明,在286个NAU421/Y16-Pm的F2单株中,同时携有纯合Wss1和Pm21基因的单株有18株,比例为6.38%;在232个NAU421/扬麦22的F2单株中,同时携有纯合Wss1和PmV基因的单株有5株,比例为2.16%。细胞学与分子标记鉴定结果一致,说明CINAU301和MBH1可用于对Wss1和Pm21/PmV基因的高效选择。F3代株系抗病性鉴定表明,筛选出的23个双抗基因聚合体对白粉病免疫并高抗黄花叶病,可用于下一步双抗聚合品种(系)的筛选或作为抗病中间亲本。 相似文献
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小麦土传花叶病毒病是侵染小麦的一种重要病害,该病害病原有多个病毒种类,主要为小麦黄花叶病毒(WYMV)和中国小麦花叶病毒(CWMV),由禾谷多黏菌以持久性方式传播为害。为明确该病害在山东的最新分布状况,于2013-2016年采用田间调查,结合dot-ELISA和RT-PCR检测等方法对小麦土传花叶病毒病进行了研究。结果表明,小麦土传花叶病毒病主要分布在鲁南地区,而鲁中、鲁东、鲁北等为零星发生区。WYMV主要分布在临沂、济宁、泰安和枣庄等地;CWMV主要分布在烟台、威海、青岛、临沂和德州等地;烟台、威海、青岛、临沂为两种病毒的混发区。对CWMV主要分布区域(文登、荣成、胶州、莒南、平原、沂水、福山)的CWMV的CP基因进行系统进化聚类分析发现,CWMV的CP基因同源性为94.7%~98.3%,在进化树中聚类为两组,其中,平原、文登、福山和莒南分离物与日本分离物(登录号:AB299272.1)亲缘关系较近,沂水、荣成和胶州分离物与江苏大丰分离物(登录号:EF121374.1)亲缘关系较近。 相似文献
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甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus, SCSMV)是引起甘蔗花叶病的一种主要病原。SCSMV编码的P1蛋白是RNA沉默抑制子,在SCSMV抑制寄主的RNA沉默防御中发挥关键作用,但其作用机制尚未清楚。与寄主蛋白互作是RNA沉默抑制子发挥其抑制作用的主要途径之一,因此鉴定与病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用机制的一个重要方法。为探究SCSMV P1抑制寄主RNA沉默的机制,本研究首先将SCSMV P1基因连接到质粒pGBKT7上构建诱饵质粒pGBKT7-P1,然后对pGBKT7-P1进行毒性和自激活检测,最后以pGBKT7-P1为诱饵,采用酵母双杂交技术从甘蔗cDNA文库中筛选与P1互作的寄主蛋白。结果显示,成功构建pGBKT7-P1诱饵质粒。将pGBKT7-P1诱饵质粒转入Y2H Gold酵母菌株后,酵母菌株在SD/-Trp平板及液体培养基中生长良好,表明pGBKT7-P1诱饵质粒对Y2H Gold酵母菌株无毒性。含pGBKT7-P1诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落未变蓝,在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA和SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板上无菌落生长,表明pGBKT7-P1诱饵质粒无自激活活性。用pGBKT7-P1诱饵质粒对甘蔗cDNA文库进行筛选,经SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板筛选1次及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA平板筛选3次后,获得42个阳性酵母克隆,提取阳性酵母质粒并导入大肠杆菌中扩大培养,经测序及blastx比对分析,获得13个可能与SCSMV P1互作的寄主甘蔗蛋白,分别是生长素应答蛋白IAA1、IAA15,转录因子NAC、GATA4、OFP4,真核翻译起始因子eIF5A,分子伴侣DnaJ,辅分子伴侣SBA1,重金属相关异戊二烯化植物蛋白HIPP35,mec-8和unc-52蛋白同系物抑制子SMU2,外膜孔蛋白OEP24,及2个未表征蛋白。基于这些蛋白的功能,推测P1可能通过与寄主蛋白互作来调控寄主防御反应相关基因的表达,和/或通过与寄主蛋白互作来影响寄主RNA沉默相关蛋白的合成、加工或转运,从而发挥其RNA沉默抑制子的功能。研究结果为后续深入解析P1抑制RNA沉默的作用机制奠定了重要基础。 相似文献
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为筛选抗梭条花叶病的小麦品种(系)供育种和生产应用,自1997年起对425份江苏省农业科学院粮食作物研究所(以下简称"本所")育成的高代品系和384份来自不同省份的推广品种(系)进行了连续多年的梭条花叶病抗性鉴定.结果表明,425份本所育成的高代品系中有54份表现高抗,占12.7%,116份为中抗,占27.3%.来自不同省份的推广品种(系)表现高抗的有102个,占26.6%,中抗的有71份,占18.5%.不同省份之间出现高抗品种的比例差异很大,来自陕西和山西省的绝大部分小麦品种均表现高抗,而来自四川、江苏、湖北的小麦品种中出现高抗的品种较少.通过系统选育和采用抗感品种间杂交,后代进行严格选择,均可以育成抗病高产的小麦品种. 相似文献
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酵母双杂交系统筛选与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻蛋白 总被引:1,自引:0,他引:1
RBSDV编码的非结构蛋白P6为该病毒的沉默抑制子。为了研究P6与寄主水稻间的互作关系,首先利用RT-PCR扩增,获得水稻黑条矮缩病毒P6基因,并将其构建到酵母表达载体pGBKT7上,自激活验证表明,P6蛋白无自激活活性。利用酵母双杂交系统顺序转化法从水稻cDNA文库中筛选,获得4个与RBSDVP6互作的寄主因子,分别为水稻内囊体抗坏血酸过氧化物酶、醛糖1差向异构酶、immutans蛋白基因同源蛋白和一个功能未知蛋白。分析了3个已知功能的寄主因子在病毒侵染过程中的可能功能。 相似文献