小麦隐性核不育保持系表达载体的构建及拟南芥遗传转化

利用小麦杂种优势能够创制稳定的雄性不育系。相比于细胞质雄性不育系和光温敏雄性不育系,细胞核雄性不育具有育性稳定、易恢复、不受环境影响等特点。小麦隐性核不育基因 ms1的克隆以及杂交制种技术(hybrid seed production technology, SPT)的开发,为雄性不育的保持和杂种优势利用奠定了基础。本研究将小麦花粉育性恢复基因 Ms1、花粉致死基因 ZmAA1、红色荧光蛋白基因 DsRed2及其特异性启动子和终止子连接到表达载体pGEII上,转化野生型拟南芥,得到6株转基因拟南芥。通过荧光显微镜观察拟南芥种子,发现野生型拟南芥种子表面平滑,不能发出红色荧光;而转基因种子表面呈现颗粒状,能够发出红色荧光。这说明表达载体构建成功,并能够在拟南芥中成功表达。这为创制人工小麦隐性核不育系奠定了理论和材料基础。     

玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因高效表达载体构建及其导入小麦的研究

为获得具有C4光合特征的高光效转基因小麦材料,利用从玉米中克隆的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因(pepc,GenBank接受号为FJ415327)构建高效双元表达载体,通过基因枪介导法将其导入小麦品种(系)中,利用Real-time PCR方法分析外源基因在转基因植株中的拷贝数.PCR和双酶切鉴定表明,玉米PEPC cDNA序列已插入双元表达载体pCAMBIA3301中,命名为p3301-pepc;对获得的抗性再生植株进行PCR扩增,其中有342株扩增出目的条带;在选取的15株转基因植株中7株拷贝数为1,3株拷贝数为2,2株拷贝数为3,拷贝数为5、8和17的分别为1株.初步证明玉米pepc基因已整合到小麦基因组中,且外源基因在转基因植株中既有单拷贝插入,也有多拷贝插入,这为进一步研究该基因在小麦基因组中的功能表达提供了试验材料.     

两步法构建灰飞虱RNAi载体及水稻遗传转化

灰飞虱不仅直接危害水稻,还是水稻条纹叶枯病和黑条矮缩病的传播媒介。为了探索防治灰飞虱及由灰飞虱引起的水稻病毒病的方法,本研究利用两步法快速高效构建灰飞虱RNAi载体,并应用于水稻遗传转化。针对灰飞虱的激活性蛋白激酶C受体(RACK)基因设计了一对特异性引物,通过PCR扩增一段200 bp的干扰片段,将干扰片段克隆到入门载体p ENTR,再经过LR反应使入门载体上的干扰片段整合入目的载体p ANDA,形成RNAi载体p ANDA-RACK,通过农杆菌EHA105介导的水稻转化法转入武陵粳1号,获得20株经鉴定为阳性的转基因植株,为防控灰飞虱及其传播的水稻病毒病提供了珍贵材料。     

HrpZpsta基因植物表达载体的构建及其在大豆中的转化

利用PCR技术扩增含有hrpZpsta基因的克隆载体pMD18-T-hrpZpsta,以植物表达载体pBI121为基础,将PCR产物插入到此植物表达载体中.利用农杆菌介导的大豆子叶节转化法将构建好的表达载体导入大豆品种吉农28中,选用筛选条件为100mg·L-1的卡那霉素选择培养基培养,对获得的转基因植株进行PCR检测...     

花生PEPC基因反义表达载体构建及对花生的遗传转化

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是控制花生蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶.本研究利用PCR方法扩增出了PEPC基因片段,并将其克隆到pMD18-T Simple载体,序列分析表明克隆片段的长度为728bp.将该PEPC基因片段反向插入pCAMBIA1301-35S双元表达载体,构建了带PEPC反义基因的双元载体并进行花生的转化,目前已获得转基因植株,收获T1代种子.     

pCAAFP66表达载体的构建及其大豆遗传转化的研究

以pCAMBIA3301为载体骨架,afp为目的基因,构建了大小为9868 bp的大豆表达载体pCAAFP66,该载体带有抗冷冻蛋白基因afp和筛选标记基因bar.以大豆品种华春3号和华春6号的胚尖和子叶节为外植体,应用农杆菌介导法进行遗传转化,以草甘膦(PPT)为筛选底物.结果表明:在胚尖转化体系中,华春3号和华春6...     

植物防御素D1基因种子特异表达载体构建及在玉米中的转化

以绿豆基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增了绿豆防御素D1基因序列,与GenBank中绿豆防御素基因的相应片段有99.08%同源性,克隆片段长为355bp。将种子特异启动子sbeIIb和D1基因插入到带有耐盐基因的表达载体pCAMBIA1301-BADH中,构建了无抗生素选择标记的种子特异表达载体pSBEIIb-D-B,该载体是利用耐盐基因BADH替代抗生素基因作为筛选标记,消除了对环境及肠道微生物的潜在威胁。将该载体利用超声波辅助农杆菌介导法转化了2个玉米自交系丹598、988的愈伤组织,经分化诱导出苗后进行PCR检测,证明得到转基因阳性植株,相对转化率最高达到7.8%。     

AtCS25基因过表达载体的构建和拟南芥的遗传转化

AtCS25基因是拟南芥中一个功能未知的基因.生物信息学分析发现,该基因可能与花粉和花粉管的发育有关.为了进一步探究该基因的功能,克隆了AtCS25基因的全长CDS序列,并将克隆得到的片段插入到过表达载体pBI121相应的位置,构建了AtCS25基因的过表达载体pBI121 - AtCS25.通过农杆菌GV3101介导将该载体转入拟南芥Col生态型中,获得了5株转基因植株,为进一步研究AtCS25基因的功能奠定了良好的基础.     

大豆Gy1基因种子特异性表达载体的构建及在玉米中的转化

实验构建了2个大豆贮藏蛋白Gy1基因种子特异性表达载体,并将其分别转入玉米愈伤组织中。载体1以潮霉素为筛选标记,将Gy1基因片段插入到含有种子特异启动子的植物表达载体pCAMBIA1301-7αP上,得到种子特异性表达载体pCAMBIA1301-7αP-Gy1;载体2以BADH为筛选标记,将Gy1基因插入到带有耐盐基因BADH的植物表达载体pCAMBIA1301-BADH上,得到安全性无抗生素选择标记的种子特异性表达载体pCAMBI-A1301-sbeⅡb-Gy1。通过农杆菌介导法将其分别导入玉米自交系H99的愈伤组织中,共获得132株再生植株;经过PCR检测,初步证明获得了34株转基因阳性植株。     

亚麻木质素合成相关基因COMTRNAi表达载体构建及转化

以已经克隆到亚麻木质素合成关键酶咖啡酸-O-甲基转移酶基因(COMT)全长cDNA序列为基础,通过扩增RNAi顺式及反式片段(均为249 bp),先连接到中间载体pBSK,再连接表达载体pCAMBIA-1301-multi,构建成COMT基因的RNAi表达载体,通过农杆菌介导转化亚麻,获得转基因植株,通过GUS染色和PCR检测,表明干扰载体已经转入亚麻中。这为推进亚麻纤维品质改良的分子育种提供了基础。     

病毒诱导的全新tae-miR9663的沉默影响叶片发育和籽粒大小

MicroRNA(miRNA)是一类长度为18~24nt的非编码小分子RNA,参与植物各种发育进程。tae-miR9663是新发现的在小麦幼苗、旗叶和籽粒中高表达的miRNA,但其生物学功能未知。为了探索taemiR9663的功能,通过人工合成tae-miR9663的小串联模拟靶标(short tandem target mimic,STTM),将其构建到大麦条斑花叶病毒(barley stripe mosaic virus,BSMV)载体上,利用病毒介导的基因沉默(virus-inducing gene silencing,VIGS)技术转染小麦宁春16五叶一心期的第5片叶,转染20d后观察叶片表型并取旗叶进行实时定量PCR,成熟时观察种子大小。叶片表型观察结果表明,与BSMV:00相比,接种BSMV:STTM-taemiR9663的9株幼苗中出现4种叶片表型,即第6片叶有白点或白条纹,旗叶(第7片叶)有白点或白条纹,第6片叶边缘有锯齿状,旗叶叶尖处有皱缩。实时定量PCR分析结果表明,STTM-tae-miR9663过表达植株的tae-miR9663表达丰度下降,说明BSMV-VIGS技术可通过过表达STTM有效地沉默内源miRNA。成熟种子大小观察结果表明,与BSMV:00比较,接种BSMV:STTM-tae-miR9663的植株种子的长和宽均减小。     

小麦 TaSABP2基因的克隆及表达分析

为挖掘小麦抗逆基因,进一步解析小麦抗逆机制,采用电子克隆结合RT-PCR的方法,从小麦叶片中分离出 TaSABP2基因;利用生物信息学手段分析其序列特征;运用实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)技术检测其在不同条件下的表达情况。结果表明,小麦 TaSABP2基因的cDNA全长为878 bp,包含一个长度为807 bp的开放阅读框,编码268个氨基酸。 TaSABP2基因的编码蛋白包含Abhydrolase及PLN02211两个结构域及一个酶活性中心(VVLVGHSLGG),属于Abhydrolase超家族的成员。其蛋白二级结构由四种形式构成,包括40.3%的α-螺旋、16.42%的延伸链、4.48%的β转角、38.81%的无规则卷曲。通过与其他植物的氨基酸序列进行多重序列比对,发现功能区域的氨基酸序列较为保守。qRT-PCR结果表明, TaSABP2基因的表达具有较强的组织特异性,植物激素ABA和BR处理及干旱和盐胁迫处理,均能诱导该基因的表达量迅速增加。以上结果表明, TaSABP2基因在小麦抵抗逆境胁迫过程中起到一定作用。     

冬小麦miR398前体的克隆及其在低温条件下对靶基因CSD1表达的调控

miR398是受逆境胁迫负调控的miRNA,其靶基因CSD编码超氧化物歧化酶(SOD),使植物抵御活性氧(ROS)的毒害。为进一步了解低温胁迫下miR398的调控机制,从东农冬麦1号中克隆小麦miR398前体,构建过表达载体并转化拟南芥,用Real-time PCR检测T0代植株中小麦miR398及其靶基因CSD1在低温胁迫下的表达量。结果表明,随着低温胁迫时间的延长,miR398表达下调、CSD1基因表达上调,认为小麦miR398能响应低温胁迫、负调控CSD1基因表达,间接提高了拟南芥的抗寒性。     

TaHIPP32与 TaHAK1表达及小麦缺钾胁迫耐性的关系

钾是植物生长发育必需的三大营养元素之一。高亲和性钾转运蛋白（HAK）能加强植物在缺钾胁迫时钾的吸收和转运。本课题组前期研究发现,小麦 TaHAK1基因在缺钾胁迫条件下显著上调表达,并筛选得到可能调控 TaHAK1基因表达的上游转录因子基因 TaHIPP32,但这两个基因在缺钾胁迫中的作用机制尚不清楚。本研究首先对 TaHIPP32基因进行了系统发育和亚细胞定位分析,然后利用双荧光素酶验证 TaHIPP32和 TaHAK1基因的互作,并以河南省大面积推广的小麦品种百农207为试验材料,利用大麦条纹花叶病毒诱导基因沉默（BSMV-VIGS）技术分析缺钾胁迫处理下 TaHIPP32基因沉默对小麦植株的影响。系统发育和亚细胞定位分析表明, TaHIPP32基因与水稻 OsHIPP33基因的亲缘关系最近,且其编码的蛋白定位于细胞膜上。双荧光素酶试验表明,TaHIPP32蛋白能够与 TaHAK1基因启动子互作。通过BSMV-VIGS技术瞬时沉默 TaHIPP32基因,发现该基因沉默后,小麦植株对缺钾胁迫更为敏感,植株生长受到抑制,干重显著降低,丙二醛(MDA)含量显著提高;缺钾胁迫处理下,沉默 TaHIPP32基因的植株中, TaHAK1和 TaHIPP32基因的表达均被抑制,且植株体内钾元素从地下部到地上部的转移系数显著降低,说明 TaHIPP32基因通过调节 TaHAK1基因的表达来影响植株体内钾元素的转运。     

农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化影响因素分析

为解决农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化效率较低的难题,以春小麦Bobwhite成熟胚为外植体,分析植物激素、愈伤组织预培养时间、侵染时间和共培养阶段干燥处理对小麦成熟胚愈伤组织遗传转化的影响,并在遗传转化处理中辅以3个组织再生相关基因(TaSERK1、TaSERK2、TaNiR)的qRT-PCR分析。结果表明,愈伤组织预培养阶段添加适量的2,4-D和Picloram均可诱导成熟胚愈伤组织的形成,但是2mg·L~(-1)Picloram培养基中愈伤组织的胚萌发率为20.78%,远高于2,4-D诱导的胚萌发率(11.38%);共培养阶段对农杆菌侵染的愈伤组织进行干燥处理能适当提高愈伤组织的转化效率;qRT-PCR分析发现再生相关基因TaNiR相对表达量的增加能适当提高愈伤组织的转化率。     

小麦抗逆相关基因 TaGB1的克隆及其表达特性分析

为了解小麦的 TaGB1基因特性、表达情况及其与双子叶植物同源基因的进化关系,以小麦品种济麦22为研究对象,采用同源克隆的方法获得小麦G蛋白β亚基编码区序列, TaGB1编码区全长1 143 bp,编码380个氨基酸,预测分子量为41 kD,基因组序列中包含6个外显子和5个内含子,分别位于小麦基因组的4A、4B、4D染色体上,不同拷贝的氨基酸同源性高达99.91%。 TaGB1基因结构中包含7个WD40保守域,表达产物位于胞质和质膜上。经系统发育进化关系分析,单子叶植物与双子叶植物的G蛋白β亚基分化形成两大分支; TaGB1在进化关系上与单子叶植物较近,而与拟南芥等双子叶植物较远。 TaGB1在ABA、盐、热和干旱胁迫条件下上调表达,植物的根、茎、叶等部位均有表达,叶片中表达量较高,说明该基因可能参与调控植物的抗逆反应。     

小麦类病斑突变基因lm3的定位

为进一步对类病斑突变基因lm3进行克隆和功能研究,以EMS诱变普通小麦花培品系H261所得后代中选育出的一个稳定遗传的小麦类病斑突变体LF2010为研究材料,通过BSA(bulked segregant analysis)、MBSA(multiple bulked segregant analysis)、小麦90K基因芯片结合BSA三种不同的基因定位策略对该突变基因进行定位。结果表明,lm3基因位于小麦6B染色体的长臂,与其两侧标记SWES2和Xbarc134的遗传距离分别为13.1cM和3.8cM,为一个新的小麦类病斑突变基因。     

小麦 TaWIN1基因的克隆和表达分析

14-3-3蛋白家族在植物生长发育和逆境胁迫响应中发挥着重要作用。 TaWIN1基因是小麦14-3-3基因家族成员之一,为了进一步了解该基因的功能,本研究以普通小麦中国春为材料克隆了 TaWIN1基因并进行了生物信息学分析和表达分析。结果表明, TaWIN1基因含有801 bp的开放阅读框,编码266个氨基酸,含有完整的14-3-3蛋白家族结构域;该基因的编码蛋白为酸性蛋白,不具有跨膜区,可能定位于细胞质;进化分析显示,小麦TaWIN1蛋白与大麦14-3-3E、二穗短柄草GF14-D的亲缘关系最近; TaWIN1基因在小麦不同发育时期和不同组织中均有表达,但在10 mm幼穗中的相对表达量最高,其次为苗期叶片和旗叶,在根中表达量最低;根中 TaWIN1基因在干旱、高温、低温和盐胁迫下均显著上调表达;叶片中 TaWIN1基因在干旱、低温和盐胁迫下均显著上调表达,而在高温下则显著下调表达。     

基因枪介导的转 TaGAPDH8基因小麦的获得与鉴定

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是参与糖酵解和糖异生途径的关键酶之一,在维持细胞能量供应和植物抗逆性方面具有重要作用。本研究以耐旱型小麦品种长武134及干旱敏感型小麦品种郑引1号为材料,利用基因枪法将 TaGAPDH8基因分别转化这两种小麦的幼胚愈伤组织,经潮霉素筛选和PCR鉴定,最终得到4个下调表达的长武134株系(CW134-3、CW134-6、CW134-12、CW134-13)和8个上调表达的郑引1号株系(ZY1-1、ZY1-3、ZY1-4、ZY1-9、ZY1-10、ZY1-14、ZY1-15、ZY1-17)。对生长于大田的T_2代转基因植株在乳熟期的生长状况进行了测定,获得了与对照相比有明显表型差异的植株。用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定了T_3代小麦株系中 TaGAPDH8的表达量,结果表明,4个长武134株系中 TaGAPDH8基因的表达量分别为对照的0.53、0.75、0.21和0.78倍,而8个郑引1号株系中目的基因的表达量分别为对照的3.02、1.22、2.15、1.36、4.02、1.87、1.48和1.97倍。本研究获得了与对照存在明显表型差异的T_2代及稳定遗传目的基因的T_3代小麦株系,为后续的试验提供了研究材料和基础。     

小麦丙氨酸-乙醛酸转氨酶基因（ TaAGT2）的克隆、生物信息学预测及表达分析

光呼吸是植物细胞H_2O_2的重要来源,也是维持细胞氧化还原的重要成分,影响植物对生物和非生物逆境的应答,因此,挖掘与光呼吸有关的基因对提高植物的抗逆性具有重要意义。本研究以耐旱小麦品种青麦6号转录组数据为基础,通过RACE技术克隆得到小麦 AGT2基因的全长cDNA,将其命名为 TaAGT2,并对其进行了生物信息学预测及表达模式分析。结果表明, TaAGT2开放阅读框长1 434bp,编码477个氨基酸。该蛋白属于亲水性稳定蛋白,定位于线粒体中,二级结构以α-螺旋(42.14%)和无规则卷曲(32.91%)为主。 TaAGT2基因包含AAT-I基因族保守区域,与二穗短柄草 AGT2的相似性高达97%。通过qRT-PCR对基因 TaAGT2在不同组织中(根、茎和叶)及4种非生物胁迫(低温、ABA、干旱、高盐)下的表达特性进行分析,结果表明, TaAGT2在根、茎和叶中均有表达,茎中的表达显著高于根和叶,在不同胁迫条件下上调表达,表明该基因可能参与调控植物的抗逆反应。