寡糖诱导向日葵抗锈病的信号转导途径

为了解寡糖诱导向日葵抗锈病过程中的信号转导途径,利用寡糖、水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）预先喷雾处理向日葵叶片,1d后接种锈菌,通过对植株体内脂氧合酶（LOX）活性及SA含量的测定,并通过RT-PCR对SA、JA信号途径的标记基因PR5和PDF1.2等表达水平进行测定,初步确定诱导抗性表达的信号转导途径。结果表明：经寡糖诱导后,向日葵叶片内LOX活性降低,SA含量上升,且诱导水杨酸途径标记基因PR5表达量增加。结果说明寡糖诱导向日葵抵抗锈病主要与SA介导的信号途径有关。     

MeJA和ET对巴西橡胶树胶乳HbGSK1基因表达的影响

GSK3蛋白与进化过程中的激素信号网络和生物、非生物胁迫响应密切关联。GSK3是否在橡胶树JA和ET信号途径起作用尚不清楚。qPCR分析结果表明，机械伤害、MeJA和ET处理上调胶乳中HbGSK1基因的表达，并且“机械伤害+MeJA”处理的表达水平显著高于机械伤害处理，推测机械伤害通过上调胶乳内源JA含量上调HbGSK1基因的表达；机械伤害上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1蛋白可能参与橡胶树非生物胁迫响应；MeJA和ET处理上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明HbGSK1蛋白可能参与橡胶树JA和ET植物激素信号途径的调节。MeJA和ET处理均上调胶乳中HbGSK1基因的表达，表明JA和ET对HbGSK1基因的表达的调节具有协同作用。     

核盘菌诱导后向日葵防卫及激素信号传导相关基因差异表达分析

为探讨向日葵抗菌核病分子机制，在已构建的核盘菌诱导向日葵转录组差异表达基因分析基础上，筛选了8个向日葵防卫相关基因和水杨酸（SA）、茉莉（JA）及茉莉酸-乙烯（JA/ET）信号途径中的关键调控基因进行了qRT-PCR诱导表达分析。结果表明，当核盘菌侵染向日葵时，向日葵防御酶基因表达量与对照相比均有显著的变化，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和谷胱甘肽-S转移酶（GST）基因在6h表达量分别为对照25.02、22.34和26.25倍；苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化氢酶（CAT）和查尔酮合成酶（CHS）基因也上调表达，表达量在12h均达到最高，分别为对照的23.89、24.23和24.89倍；β-1，3-葡聚糖酶（GLU）基因在0～6h下调表达，之后又迅速升高，24h表达量达到最高，为对照的23.66倍；几丁质酶（CHI）基因先是下调表达，12h后开始上调表达，36h时表达量达到最高，为对照的22.13倍。SA、JA及JA/ET信号途径中的调控基因与未经诱导的相比均有明显的转录水平变化，而且JA/ET途径“节”点基因PDF1.2和SA-JA“节”点基因NPR1、MPK4和EDS1也明显上调表达。研究结果表明核盘菌诱导激发了向日葵多种抗病信号传导途径及防御反应，暗示向日葵对核盘菌侵染响应的分子机制受到多基因网络系统的调控。     

木薯MeLHCB4基因的克隆及表达分析

本研究采用RT-PCR技术克隆了木薯叶绿素a/b结合蛋白基因MeLHCB4编码区序列。通过生物信息学对其基因结构、基因编码蛋白的理化性质等进行分析,并对不同物种的LHCB4氨基酸序列进行比对和构建进化树。结果表明,木薯MeLHCB4基因的CDs序列全长858 bp,编码285个氨基酸,蛋白理论相对分子质量约为30.9 kDa,理论等电点为5.47,该蛋白属于稳定的亲水性蛋白,预测该蛋白可能定位于细胞核或细胞质中。实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式发现,MeLHCB4基因主要在木薯叶片和茎中表达,受到茉莉酸甲酯（JA）、水杨酸（SA）和乙烯前体（ACC）等激素的诱导表达,推测其可能参与了JA、SA、ACC信号途径。细菌性枯萎病病原菌侵染木薯叶片12 h后,MeLHCB4的表达量显著提高,表明MeLHCB4参与了木薯对病原菌的响应过程。     

拟南芥AtLURP1基因启动子在转基因烟草和水稻中的功能分析

克隆拟南芥LURP1基因上游1515 bp的启动子调控序列并命名为AtLURP1p,将其与GUS报告基因融合,构建成植物表达载体,分别遗传转化烟草和水稻,获得LURP1p::GUS的烟草和水稻转基因植株及其相应的T2代株系,分别研究LURP1p对水稻稻瘟病、辣椒青枯病侵染及SA、MeJA、ABA等几种重要的植物激素信号分子处理的应答.结果表明:(1)转基因烟草和水稻在几种激素,包括SA、MeJA、ABA的诱导处理下,GUS基因均可以被诱导表达;(2)转基因烟草在细菌性病菌青枯病的侵染下,GUS可被诱导表达并表现出持续表达的趋势,转基因水稻在稻瘟病的侵染下,其GUS基因也被诱导表达,并表现出后期持续上调的趋势.这些研究结果表明,拟南芥LURP1的应答逆境信号通路也存在于烟草和水稻等植物,该启动子可用作诱导型启动子广泛地应用于不同植物抗病基因工程.     

OsLOX10正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性

【目的】由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病和由水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的白叶枯病严重影响水稻的产量和品质。创制转OsLOX10基因水稻材料，进行稻瘟菌和白叶枯菌的抗病性分析，有助于揭示其调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性机制。【方法】采用CRISPR/Cas9系统构建OsLOX10的敲除载体，利用限制性内切酶XcmⅠ线性化pCXUN-HA，TA连接构建OsLOX10的过表达载体，遗传转化获得OsLOX10转基因水稻，筛选过表达株系和纯合敲除株系进行真菌和细菌的抗病性分析。在稻瘟菌（Guy11）侵染水稻后，对水杨酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）途径的标志基因进行qRT-PCR分析;在几丁质（chitin）和flg22诱导下，观测水稻活性氧（reactive oxygen species，ROS）的暴发情况。【结果】 qRT-PCR分析表明，接种稻瘟菌和白叶枯菌24 h后，OsLOX10表达量上调;OsLOX10的纯合敲除和过表达水稻转基因株系接种稻瘟病菌Guy11孢子悬浮液，与野生型（日本晴）相比，OsLOX10敲除株系更易感病，过表达株系则无典型的病斑症状;接种 6、12、24和36 h时，3个病程相关蛋白基因OsPBZ1、OsPR1a、OsPR1b和SA通路基因OsPAL1，以及JA合成通路上的2个基因OsAOS2、OsLOX5的转录水平在敲除转基因株系中显著下调，而在过表达转基因株系中显著上调。对转OsLOX10基因水稻接种白叶枯菌（PXO99A），发现敲除OsLOX10的转基因水稻对白叶枯菌更易感病。qRT-PCR分析OsPR1b和OsPAL1以及JA合成通路上的3个基因OsAOS2、OsAOC和OsJAZ在OsLOX10过表达基因水稻中表达量明显上调，而在敲除OsLOX10的转基因水稻中却保持在较低水平，在接种7 d后表现出显著性差异。在几丁质和flg22诱导下，OsLOX10敲除株系的ROS水平显著性降低，而且在几丁质诱导下，ROS的起峰时间推迟。【结论】稻瘟病菌和白叶枯病菌能够诱导OsLOX10的表达，OsLOX10通过病原菌分子模式触发的免疫途径（PTI）参与抗病反应，其在水稻抵御稻瘟病和白叶枯病中起着正调控作用。同时，OsLOX10可能通过调节SA和JA介导的信号通路来正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性。     

桃蚜取食抗、感辣椒品种的茉莉酸途径基因表达差异分析

根据蚜口密度及取食时间效应,明确桃蚜取食前后辣椒茉莉酸（JA）合成及信号途径基因表达差异,初步阐明JA途径介导的辣椒抗蚜性分子机理。本研究以抗蚜辣椒品种猪大肠（ZDC）和感蚜辣椒品种大羊角椒（DYJJ）为材料,采用实时定量PCR技术分析与植物防御相关的JA合成途径基因（LOX2、AOS、AOC和OPR3）与信号途径基因（COI1和JAR1）在桃蚜不同蚜口密度（20、30、40、50、60蚜/叶）及取食不同时间（6、12、24、48、72 h）后的表达量变化情况。结果表明：在不同蚜口密度和取食为害时间下,JA合成途径的4个基因在ZDC中表达量总体上显著高于DYJJ,而信号途径2个基因表达量总体上显著低于DYJJ。在桃蚜较低为害水平状态下,抗、感辣椒品种之间表达量差异显著,且在部分相同蚜口密度下部分基因表达量峰值和低谷出现时间基本一致。较高水平的为害情况下,抗、感辣椒品种之间差异显著性下降。以上结果表明,JA合成及信号途径AOS、AOC及JAR1基因可能具有作为鉴定评价辣椒抗蚜性水平的分子指标的潜力,可为将来辣椒抗蚜种质资源评价与创新利用提供理论依据。     

剑麻PGIP基因克隆和表达研究

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase inhibitor proteins, PGIPs）是一类与植物自身免疫相关的多功能蛋白, 在植物防卫反应中扮演着重要角色。为了探讨剑麻PGIP基因的功能,本研究利用PCR的方法从剑麻H.11648中克隆2个剑麻PGIP基因——AhPGIP1和AhPGIP2。利用荧光定量PCR（qRT-PCR）分析AhPGIP1和AhPGIP2基因在烟草疫霉侵染、伤害、低温、盐胁迫、水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）处理后的表达模式。结果表明：AhPGIP1基因 cDNA全长为1008 bp,编码335个氨基酸,蛋白分子量约为36.7 kDa,等电点为8.65。AhPGIP2基因全长为981 bp,编码326个氨基酸,蛋白分子量约为35.8 kDa,等电点为8.98。AhPGIP1基因在烟草疫霉侵染过程中表达水平先下降后明显上升,侵染48 h达到最大值,在盐、伤、SA和MeJA处理后表达水平明显上升,分别在3、12、3、12 h达到最大值,低温处理6 h表达水平不变,3、12、24 h表达水平明显下降。AhPGIP2基因在烟草疫霉侵染24 、36、48 h表达水平明显下降,侵染72 h明显上升并达到最大值,在盐胁迫、低温、SA和MeJA处理后表达水平明显上升,分别在3、24、3、12 h达到最大值,在伤处理12 h后显著上升并达到最高水平,在3、6、24 h明显下降。本研究为深入探讨剑麻PGIP基因在不同逆境胁迫反应中的功能奠定了基础。     

巴西橡胶树类甜味蛋白基因HbTLP1的克隆及表达分析

根据模式植物拟南芥中同类蛋白的氨基酸序列在橡胶树转录组数据库中进行同源搜索并设计引物,通过RT-PCR方法扩增巴西橡胶树TLP同源基因的cDNA片段,命名为Hb TLP1.该片段包含一个984 bp的开放阅读框,编码327个氨基酸的多肽.生物信息学分析结果表明,该氨基酸序列含有一个超级THAUMATIN-Like结构域,与杨树、大豆、葡萄和拟南芥的TPL蛋白有较高的同源性.半定量分析结果表明,该基因的表达受水杨酸(SA)和鞭毛蛋白(flg22)的诱导,但不受茉莉酸(JA)的影响.以上结果揭示该基因为橡胶树的TPL同源基因,参与SA介导的抗病信号途径和植物的先天免疫反应.     

外源MeJA对低温胁迫下冬小麦冷响应基因表达的影响

为了探讨外源MeJA(茉莉酸甲酯)处理对低温胁迫下东农冬麦1号(Dn1)叶片和分蘖节中 TaICE41(CBF表达诱导因子)及4个冷响应基因( Wcor14、 Wcor15、 Wcor18、 Wcor413)表达量的影响,了解Dn1强抗寒性是否与JA(茉莉酸)对CBF途径冷响应基因的调节有关,以Dn1为试验材料,叶面喷施1mmol·L~(-1)MeJA,采用荧光定量PCR法检测低温(5℃、0℃、-10℃和-25℃)胁迫下Dn1叶片及分蘖节中 TaICE41及下游4个冷响应基因的表达量。结果表明,外源MeJA处理提高了低温胁迫下Dn1叶片及分蘖节中上述基因的表达量;-10℃下,Dn1分蘖节中 TaICE41、 Wcor14、 Wcor15、 Wcor18、 Wcor413表达量均达到最高值,处理组依次约为对照组的3.3倍、38.0倍、12.7倍、9.4倍、3.5倍,表明JA对CBF途径冷响应基因的调节与低温胁迫下Dn1的强抗寒性有关;-10℃是Dn1抗寒的重要温度节点,分蘖节是影响其越冬性的主要部位。生物信息学分析及预测表明, TaICE41位于3A染色体上,定位于细胞核内,表达产物为无规则卷曲型蛋白,属于HLH蛋白家族成员,与节节麦的ICE1蛋白亲缘关系最近。本研究可为解析激素JA调控植物抗寒性的分子机制提供理论依据。     

大豆GmCYP82C4基因克隆与表达分析

细胞色素P450 CYP82家族基因为双子叶植物特有,参与生长代谢和逆境生理调控。为了探究大豆P450 CYP82的基因功能,克隆大豆P450同源基因GmCYP82C4,得到该基因编码区1584bp,它编码527个氨基酸,编码的蛋白质具有保守的血红素结合域。生物信息学分析表明,GmCYP82C4蛋白与大豆中GmCYP82A3同源性最高,其次为豌豆的PsCYP82A1。亚细胞定位结果显示,GmCYP82C4定位于细胞质膜。实时荧光定量结果表明,GmCYP82C4在大豆幼苗根中表达量最高,能够响应低温、伤害和大豆疫霉胁迫,并受到脱落酸、茉莉酸甲酯、乙烯和水杨酸信号调控。由此推测GmCYP82C4可能通过激素信号途径调控大豆对胁迫的响应。     

海马齿胚胎发育晚期丰富蛋白基因SpLea5的克隆与表达分析

根据筛选文库时获得的EST序列信息,利用RACE技术从海马齿根中分离获得了一个海马齿胚胎发育晚期丰富蛋白基因的全长cDNA,命名为SpLea5。序列分析结果表明,SpLea5基因cDNA全长685 bp,含有一个294 bp的完整开放阅读框,编码97个氨基酸残基;推测编码的氨基酸序列与柽柳、杨木樨、烟草、甜橙、温州蜜柑、麻风树和陆地棉中相应基因的氨基酸序列一致性为54%、52%、48%、47%、47%、46%、44%、41%,在聚类分析时与高等植物聚为一类。SpLea5在海马齿植株中呈组成型表达,但根中表达最为丰富,茎和叶次之;海水、NaCl、PEG、ABA处理均能够诱导根部SpLea5基因的表达。这些结果表明,SpLea5基因可能参与了海马齿对盐和干旱胁迫的分子响应。     

茉莉酸甲酯与水杨酸对光温敏雄性不育小麦颖花开闭的调控

为探索雄性不育小麦小花颖壳开闭人工调控的有效途径,将离体穗或连体穗用茉莉酸甲酯(Methyljasmonate,MeJA)或水杨酸(Salicylic acid,SA)溶液浸穗,研究了MeJA与SA对光温敏雄性不育小麦BS366(Triticum aestivum L.)颖花开闭的诱导效应.结果表明,0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L MeJA均可显著诱导BS366离体穗开颖,并且诱导效应随浓度的增加而增强;1.0、2.0、4.0 mmol/L MeJA诱导的开颖率无显著差异,三者在处理后12 h内可诱导大部分的小花开颖,并且对低结实率的诱导效应更明显.适播(自交结实率为0%)的BS366对MeJA响应速度起初略快于晚播(自交结实率为7%),之后适播的BS366开颖率的增长呈先慢后快的变化,晚播的BS366则呈先快后慢的变化.4.0 mmol/L MeJA亦可显著诱导田间连体穗开颖,MeJA处理后第1 d和第5 d人工授粉的结实率达80.4%和91.3%,表明MeJA处理对雌蕊无副作用.5.0和10.0 mmol/L的SA对MeJA诱导离体麦穗开颖的效应有明显的抑制效应,而2.0 mmol/L的SA没有抑制效应;各浓度的SA均能显著促进经MeJA诱导开颖的小花闭颖,5.0和10.0 mmol/L SA的效应更为明显.     

逆境信号下木薯MeMYC2转录因子表达及功能分析

MYC2是茉莉酸信号途径中的关键节点基因,在植物生长发育及逆境信号响应过程中发挥重要作用。本研究基于木薯基因组数据库序列,以木薯‘cv. 60444’品种为材料,采用RT-PCR方法同源克隆得到MYC2基因（数据库No. Manes.17G016000）,命名为MeMYC2.1。MeMYC2.1基因开放阅读框（ORF）全长2055 bp,无内含子,氨基酸序列中包含典型的bHLH保守结构域;序列比对分析发现MeMYC2与蓖麻MYC2具有较高同源性。外源施加植物激素水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、过氧化氢（H₂O₂）以及低温胁迫下,木薯叶片中MeMYC2.1的表达被显著诱导。进一步克隆获得MeMYC2.1基因上游1500 bp启动子序列,利用在线数据库PlantCare分析发现,MeMYC2.1启动子序列中不仅含有响应茉莉酸的顺式元件CGTCA/TGACG,还含有低温响应元件LTR及ABA响应元件ABRE。以上研究结果表明,MeMYC2.1可能是植物激素茉莉酸（JA）、脱落酸（ABA）响应低温物胁迫分子网络中的一个节点基因,对其功能的深入研究将有助于探讨JAs在植物低温胁迫应答中的作用机制。     

外源水杨酸诱导香蕉苯丙烷类代谢提高对枯萎病抗性

由尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4, TR4）引起的香蕉枯萎病严重阻碍我国香蕉产业的绿色可持续发展。外源水杨酸（SA）处理能诱导香蕉体内SA合成及信号传导途径关键酶基因上调表达,激活香蕉植株内系统获得抗性,增强对各种生物和非生物胁迫的抵抗能力,在此基础上,本研究对香蕉感病品种‘巴西蕉’和抗病品种‘农科1号’进行SA诱导处理,随后接种TR4,结果显示2个品种的病情指数均降低。为了进一步探究水杨酸信号途径下游的苯丙烷类途径在SA诱导的香蕉植株抗病过程中的作用,本研究运用实时荧光定量PCR技术（RT-qPCR）,对SA处理的感病品种‘巴西蕉’和抗病品种‘农科1号’中苯丙烷类途径关键基因的表达情况进行分析,结果发现分支途径中常规苯丙烷类途径关键酶基因C4H和4CL、木质素合成途径关键酶基因CAD和CCoAOMT、黄酮类物质生物合成途径关键酶基因CHS和CHI,对SA处理和TR4接种均有响应。在仅接种TR4的情况下,‘巴西蕉’相关基因主要表现为显著下调表达,而‘农科1号’相关基因主要表现为上调表达;仅用SA处理时,2个品种的C4H和4CL被诱导上调表达;SA处理并接种TR4,2个品种C4H和4CL依然保持上调表达的趋势,变化幅度在‘农科1号’中偏高;‘巴西蕉’CAD经SA诱导上调表达,但在接种TR4后,CAD相对表达量降低,而‘农科1号’CAD被SA诱导显著上调表达,SA和TR4共同作用下,表达水平亦显著升高;‘巴西蕉’CCoAOMT被TR4诱导显著上调表达,在SA处理并接种TR4的‘巴西蕉’植株中也表现为上调表达,‘农科1号’CCoAOMT在SA处理或SA、TR4共同作用下表现为强烈上调表达;CHS和CHI在SA处理的2个品种中主要表现为上调表达,SA和TR4双重作用下,依然表现为上调表达。结果表明外源SA处理可诱导感病和耐病香蕉根组织中苯丙烷类途径关键酶基因上调表达,该途径在SA诱导的香蕉抗枯萎病过程中起着重要作用。     

香蕉中 8 个 WRKY 转录因子的克隆及表达分析

WRKY 转录因子在植物生长发育和抗逆过程中发挥重要作用。为了解香蕉 WRKY 转录因子的功能,本研究 在香蕉根系中克隆了 8 个 WRKY 家族基因,与香蕉基因组数据库比对后,将其分别命名为 MaWRKY2、MaWRKY21、 MaWRKY44、MaWRKY47、MaWRKY125、MaWRKY136、MaWRKY139 和 MaWRKY147。序列分析和遗传进化树结果表 明,MaWRKY2 和 MaWRKY47 属于第 I 类家族,其余 6 个属于第 II 类家族。对 8 个基因在香蕉的根、球茎、假茎、 叶、花和果中的表达进行分析,结果表明,这 8 个基因在所有的器官中均表达,说明这些基因在香蕉的生长发育过程 中起作用。对 8 个基因在盐、低温、干旱、水杨酸、茉莉酸、ABA、乙烯和香蕉尖孢镰刀菌生理 4 号小种胁迫处理的 香蕉苗根系中的表达进行分析,结果表明 8 个基因对这些胁迫均有响应,说明香蕉中的这 8 个 WRKY 基因参与了生物 胁迫、非生物胁迫和激素信号途径。     

剑麻与烟草疫霉互作过程中的转录组研究

斑马纹病是剑麻的主要病害之一,为了挖掘剑麻斑马纹病抗病相关基因,以斑马纹病抗病品种热麻1号为材料,分别在接种0、24、36、48和72 h进行转录组测序,组装后获得103 326个转录本和70 110个Unigenes,转录本和Unigene的平均长度分别为726 bp和645 bp。其中有33 474个Unigenes被成功注释到NR,NT,KO,Swissport等7个功能数据库中。DEG分析表明,在接种24、36、48、72 h后分别有4 676、3 769、3 308、3 757个Unigenes被诱导差异表达,且PR蛋白,类黄酮生物合成、苯丙素类生物合成、过氧化物酶等基因上调表达明显,而热击蛋白、细胞色素P450和叶绿素a/b结合蛋白等基因明显下调表达。差异基因代谢通路分析表明,参与核糖体、光合作用、苯丙素类生物合成、苯丙氨酸代谢通路、植物激素信号转导途径、类黄酮生物合成途径、脂肪酸生物合成途径等代谢通路明显富集。本研究全面了解剑麻与烟草疫霉互作关系,是为剑麻斑马纹病抗病机制研究提供理论基础。     

芸薹根肿菌侵染早期甘蓝型油菜转录组分析

根肿病是油菜最为严重的病害之一。为探索根肿病菌和油菜互作中的抗性分子机制,采用RNA-seq技术对根肿病早期侵染中抗病品系ZHE-226(R)和感病油菜10159(S)进行转录组分析。与感病材料S相比,在0、12、48和72h 4个接种时间点,抗性材料R中共有809个基因上调表达,1082个基因下调表达。模式识别受体、几丁质酶、R基因、WRKY、水杨酸和茉莉酸等抗性相关(PRR)基因在抗病材料R和感病材料S中诱导表达并表现出不同的表达模式。抗病材料R中PRR相关基因主要表现为下调表达,R基因上调表达,水杨酸表现为前期下调后期上调表达,茉莉酸、几丁质酶和WRKY因子在R和S中均诱导表达。结果表明PRR介导的PTI(病原相关分子模式触发的免疫反应)在感病材料S中显著诱导,在抗病材料R中作用不明显;R基因介导的ETI(效应蛋白触发的免疫反应)和水杨酸介导的抗病信号途径对根肿病抗性起重要作用。