植物雄性育性相关基因的克隆方法

文章基于植物分子生物学的研究成果．介绍了几种克隆植物雄性育性相关基因的方法．其中包括mRNA差异显示技术、染色体步行法（Chromosome walking）、基因标签法（Gene tagging）、基因序列同源克隆法等。     

陆地棉洞A不育与可育花药中激素相关基因的转录差异分析

以陆地棉洞A为材料,取不育株和可育株小孢子单核早期花药进行转录组测序。结果表明:在获得注释的66 535个Unigene中,有51个激素相关基因差异表达,其中不育花药上调表达的有23个,可育花药上调表达的有28个。本研究首次分析了该时期激素相关基因在转录组水平上的差异,并对其中2个关键基因进行了验证,为深入研究陆地棉洞A的不育机理和挖掘关键基因奠定基础。     

枣ATP1基因克隆及其在雄性可育和不育品种中的表达分析

以枣树雄性不育材料JMS1及雄性可育品种‘月光’及花粉中度可育品种‘冬枣’为试材,克隆ATP1基因,并比较其在枣雄性可育和不育材料之间的表达差异。枣ATP1基因包含完整开放阅读框为1 530bp,其编码蛋白与苹果和西瓜同源蛋白相似性系数分别达95.88%和98.62%。ATP1基因在3个品种中不存在碱基差异,且确定该基因为线粒体基因。利用实时荧光定量PCR技术检测ATP1基因组织特异表达发现,JMS1的嫩枝、老枝、叶、蕾中ATP1基因的表达量较高,但在花、花药、花萼、子房中,JMS1的ATP1基因表达量均低于‘月光’。在单花发育前期JMS1中ATP1表达量高于‘月光’和‘冬枣’,在单花发育后期其表达量低于‘月光’,但高于‘冬枣’。枣花蕾发育早期ATP1基因异常高表达可能影响了ATP合酶的合成,可能与JMS1花粉完全败育的主要原因有关。     

鸡IL-1βcDNA片段的克隆及序列分析

本文以鸡外周血单个核细胞总 Ｒ Ｎ Ａ 为模板,据已报道的８ 种哺乳动物 Ｉ Ｌ—１β核酸序列保守区设计合成１ 对引物,反转录合成ｃ Ｄ Ｎ Ａ 链,经 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增,回收扩增后的 Ｄ Ｎ Ａ 片段,用ｋｌｅｎｏｗ 酶处理,与 Ｐｕ ｃ１ ９ ／ Ｓｍ ａ Ｉ 连接构成重组质粒,转化宿主菌大肠杆菌 Ｊ Ｍ１ ０ ９ ,筛选出含有插入片段的重组质粒,用 Ｐ Ｃ Ｒ 及酶切分析鉴定,结果表明获得了带有鸡 Ｉ Ｌ－ １β片段的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆;再经序列分析测定,得知此片段长为２７０ｂｐ ,与人及小鼠 Ｉ Ｌ—１β基因核苷酸序列同源性分别为４５ ％ 和３０ ％ 。     

鸡IL—1βcDNA片段的克隆及序列分析

本文以鸡外周血单个核细胞总ＲＮＡ为模板,据已报道的８种哺乳动物ＩＬ－１β核酸序列保守区设计合成１对引物,反转录合成ｃＤＮＡ链,经ＰＣＲ扩增,回收扩增后ＤＮＡ片段,用ｋｌｅｏｎｏｗ酶处理,与Ｐ＾ｕｃ１９／ＳｍａＩ连接构成重组质粒,转化宿主菌大肠杆菌ＪＭ１０９,筛选出含有插入片段的重组质粒,用ＰＣＲ及酶切分析鉴定,结果表明获得了带有鸡了ＩＬ－１β片段的ｃＤＮＡ克隆,再经序列分析测定,得知此片段长为２７     

辣椒GMS育性相关候选基因的克隆及表达分析

【目的】对辣椒差减文库中挑选出的4个育性相关候选基因进行克隆与表达分析,探讨其与辣椒细胞核雄性不育的关系。【方法】通过半定量RT-PCR技术分析候选EST在辣椒可育株和不育株中的表达情况。利用RACE技术获得4个育性相关基因的cDNA 全长,结合生物信息学方法进行序列比对和蛋白理化性质分析。采用半定量RT-PCR检测基因在不同器官（花药、子房、花瓣、萼片和叶片）和花药小孢子不同发育时期（四分体时期、单核早中期、单核靠边期和双核期）的表达量。【结果】根据比对注释结果,将4个基因分别命名为CaSEP1、CaPROF、CaOle e 6和CaPCP。CaSEP1全长1 108 bp,编码221个氨基酸,含有一个MADS结构域和一个K结构域;CaPROF全长767 bp,编码131个氨基酸,含有一个PROF结构域;CaOle e 6全长523 bp,编码85个氨基酸,含有一个Ole e 6结构域;CaPCP全长563 bp,编码66个氨基酸。氨基酸序列比对及系统发育树分析表明,CaSEP1与番茄SEP1的氨基酸序列相似性最高,并且亲缘关系最近;CaPROF与茄科作物烟草和番茄的前纤维蛋白相似性较高,且与番茄的前纤维蛋白亲缘关系最近;CaOle e 6与番茄中的对应蛋白存在一定的相似性,亲缘关系也最近;CaPCP则与茶树中的对应蛋白相似性最高,亲缘关系最近。表达分析显示,CaSEP1在可育株花药、子房、花瓣等花器官中表达量一致,且高于萼片和叶片;CaPROF在可育株花药中的表达明显高于叶片,在其他器官中不表达;CaOle e 6在可育株花药中的表达明显高于其他器官;CaPCP只在可育株的花药中表达。CaSEP1在可育株小孢子不同发育时期表现为先逐渐升高,至单核靠边期达到最高,而后在双核期表达量明显下降,在不育株中则表现为伴随着小孢子发育表达量逐渐升高;该基因在四分体时期两材料的表达量相当,在单核早中期和单核靠边期可育株中的表达量明显高于不育株,而双核期可育株中的表达量比不育株低;CaPROF、CaOle e 6和CaPCP均在可育株小孢子发育后期（主要为单核靠边期和双核期）表达,在不育株花药发育的各个时期均不表达。【结论】4个候选基因的序列比对和表达分析结果表明它们与辣椒雄蕊育性关系密切,为揭示雄性不育机理和调控辣椒育性提供了重要信息。     

mRNA差异显示分离西瓜核雄性不育基因的相关cDNA片段

【目的】揭示西瓜核雄性不育发生的分子机理。【方法】应用mRNA差异显示技术,研究西瓜核雄性不育材料Se18不育株和可育株雄花花蕾中基因表达的差异。【结果】获得了西瓜细胞核雄性不育两用系不育相关特异cDNA片段T12C/B0315S-359和育性相关特异cDNA片段T12C/B0315F-175、T12G/B0318F-260。经过序列比较,T12C/B0315S-359与美洲杨树一段未知的cDNA序列同源性较高(82%);T12C/B0315F-175与葫芦科植物中编码细胞色素C装配蛋白的ycf5基因高度同源(98%);T12G/B0318F-260与植物中硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxinperoxidase,TPx)基因高度同源(84%)。【结论】经序列分析初步认为,这3个片段与西瓜细胞核雄性不育的发生有重要相关性。     

家蚕Bmugt3基因cDNA序列的克隆、表达与序列分析

【目的】克隆分析家蚕Bmugt 3基因cDNA序列,并对其在家蚕不同组织中的表达进行检测。【方法】以家蚕ak1和873为供试材料,采用生物信息学方法和RT-PCR技术,对家蚕Bmugt3基因cDNA序列进行克隆和组织表达谱研究,并通过XbaⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒,将Bmugt 3亚克隆至具有2个反向T7启动子,用于体外诱导合成双链RNA(dsRNA)的L4440载体。【结果】克隆得到了家蚕Bmugt 3基因1675bp的cDNA序列,编码462个氨基酸,编码蛋白的分子质量为52.3ku,等电点6.5;多序列比对显示,Bmugt 3基因缺失了C末端的跨膜结构域;聚类分析结果显示,其与家蚕phenol-UGT基因聚合在同一分支上。Bmugt 3基因主要在家蚕丝腺中表达。【结论】Bmugt 3基因是组织特异性表达基因,可能在家蚕类黄酮素的代谢中起作用。     

棉蚜HSP70基因cDNA片段的克隆和序列分析

【目的】克隆棉蚜HSP70基因cDNA片段,并分析其基因序列。【方法】采集黄色型和绿色型棉蚜,实验室饲养4~5代形成单克隆系,温度处理后提取总RNA备用。根据已知昆虫HSP70基因的保守性区域,设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增棉蚜HSP70基因的部分序列,测序后进行核苷酸和推导的氨基酸序列分析。【结果】RT-PCR扩增得到一条长度783 bp左右的HSP70基因cDNA片段。测序结果显示,所得cDNA片段长度为783bp(GenBank登录号为:EU109426),且黄色型和绿色型棉蚜的核苷酸序列一致,编码261个氨基酸残基。由棉蚜该片段推导的氨基酸序列与其他昆虫的同源性较高。【结论】获得了棉蚜HSP70基因783 bp的cDNA片段,该片段编码261个氨基酸残基。     

文冠果嫁接研究

[目的]研究影响文冠果嫁接成活率的主要因子,提高文冠果的嫁接成活率。[方法]对接穗采集地的温度、接穗保存时间、保存措施及嫁接手法进行了对比试验,[结果]接穗保存措施、嫁接人员操作技术和嫁接手法直接影响文冠果嫁接成活率。在一定时间和温度范围内,接穗保存时间和采集地温度对文冠果嫁接成活率影响不显著。[结论]为文冠果的选优繁优提供技术参考。     

文冠果造林技术研究

结合陕西省富县的生态环境特点,对文冠果造林技术进行了研究,结果表明,黄土高原文冠果造林宜采用＂阳向缓坡造林地＋鱼鳞坑整地＋轻蘸浆埂上栽植＋秋季截杆造林＂技术。该研究对文冠果在西北地区的推广应用具有重要的指导意义。     

文冠果的研究进展

综述了文冠果在繁殖技术、引种选育、生理学以及化学成分等方面的研究进展,提出了目前文冠果研究方面的不足.     

文冠果人工林根际土壤真菌和根系内生真菌群落多样性1）

文冠果（Xanthoceras sorbifolia Bunge）根际土壤和根系内生真菌的多样性与土壤养分变化具有相关性。以人工文冠果林为研究对象,采集根际土壤和细根并提取DNA,采用Illumina Miseq高通量测序技术分析真菌rDNA的ITS1区域,同时测定了根际土壤的N、P和有机质等因子,以分析文冠果林根际土壤真菌和根系共生真菌与环境因子的关系。结果表明：①测序共获得clean reads有238．8104万个（土壤209．2113万个,根系295．9910万个）;在97％的相似度水平下,共获得1115个操作分类单元（ OTUs）：根际土壤真菌1028个,根系共生真菌514个,其中有59个OTUs鉴定为菌根真菌。在10～12年生林中,病原真菌数量较高,主要为镰刀菌属（ Fusa rium）、链格孢属（ Atl ernaria）及青霉属（ Penicillium）,可能与林地土壤肥力退化有关。②不同林龄文冠果根际土壤理化性质差异显著,1～2年生林土壤肥力较高,全氮、速效氮、全磷、速效磷质量分数分别为110．00、345．6、230．00、5．18 mg· kg－1,均高于5～7年生林和10～12年生林。随土壤肥力降低根内真菌OTUs个数递减。③1～2年生林根际土壤和根系内生真菌丰富度指数Chao1、均匀度指数ACE均最高。真菌群落多样性指数Simpson与全氮、速效磷质量分数呈正相关关系。可见,不同林龄文冠果人工林真菌群落存在差异,文冠果根际真菌群落与土壤环境因子之间具有相关性。     

新疆木垒县文冠果物候特征研究

[目的]主要对新疆木垒县文冠果果园的25～35 a生文冠果果树生物学特性、文冠果的物候期、开花结果习性、果实类型、树体结构等进行观察研究。[方法]采用测量法测定文冠果生育状况,即每棵树的树体结构、果实种类、种子数量。用称重法测定种子重量和单株产量。[结果]因倒春寒、春季持续低温等气候因素的影响,文冠果树芽萌动期、芽膨大期等物候期出现明显的差异,但是果实成熟期和落叶期基本一致;该园文冠果果实类型有3种:结3裂果的树占总株数88%～90%;结3裂果、4裂果的树占7%～8%;结3裂、4裂、5裂果的树占3%～4%;采取修剪技术可使文冠果产量明显提高。[结论]木垒县文冠果种植园管理粗放,产量较低,果实质量也不高,因此应制定科学合理的栽培技术和管理措施。     

文冠果组织培养的玻璃化控制研究

以文冠果的茎段为材料,通过外植体取材、培养条件、细胞分裂素质量浓度、培养基中钙质量浓度4个方面控制文冠果组织培养中的玻璃化问题。结果表明:沙藏后的种子萌发的小植株的玻璃化程度较轻于多年生植株;玻璃化程度随着光照的增加而降低,最适光照为6 000 lx;随着细胞分裂素6-BA质量浓度的增加玻璃化程度加剧,其最适质量浓度为1 mg/L;随着钙质量浓度的增加玻璃化程度抑制,当钙质量浓度为880 g/L时,效果最为明显。综合以上4个方面,基本可以控制玻璃化对文冠果组培苗的影响,从而为文冠果组织培养的产业化提供了可能。     

文冠果无性繁殖技术的研究进展

综述了国内近30年在文冠果的嫁接繁殖、扦插繁殖、组织培养等繁殖技术方面的研究进展,分析现有的技术途径的效果,明确文冠果繁殖的技术中存在的问题,同时提出今后文冠果无性繁殖技术研究的重点和发展方向,为文冠果的研究和推广应用提供参考。     

干旱荒漠区文冠果扦插繁殖技术研究

[目的]探讨干旱荒漠区文冠果的扦插繁殖技术,为文冠果的扦插繁殖、驯化栽培及园林绿化应用提供理论依据。[方法]在干旱荒漠区以文冠果和ABT2号生根粉为试材,通过采用ABT2生根粉处理文冠果嫩枝插穗、硬枝插穗、根插插穗研究了ABT2生根粉不同质量浓度对文冠果嫩枝、硬枝、根插扦插生根率的影响。[结果]文冠果嫩枝扦插、硬枝扦插、根插均以ABT2生根粉质量浓度250 mg/L处理最好,扦插平均生根率分别为48.96%、35.00%、92.86%,根插生根率明显高于嫩枝扦插和硬枝扦插。[结论]在干旱荒漠区文冠果扦插繁殖以ABT2生根粉质量浓度250 mg/L处理插穗,采取根插为最好的繁殖方法。     

文冠果开花座果研究进展

文冠果是中国特有的木本油料树种,具有较高的经济和生态效益.但文冠果座果率低,产量不稳,影响其大规模开发利用.该文综述了对文冠果开花座果规律的研究,分析了落花落果规律以及原因,并提出保花保果措施和方法,如树体管理、水分和养分管理、化学技术措施等.旨在为生产中提高文冠果的座果率提供理论依据.     

分光光度法测定文冠果壳总皂苷含量研究

[目的]建立文冠果壳总皂苷含量的测定方法,以期推动废弃物文冠果壳综合利用。[方法]根据文冠果壳苷与香草醛-高氯酸作用后具有的特征吸收,确定最佳显色条件,用分光光度计测定文冠果壳苷的含量。[结果]测试波长为456nm,香草醛浓度5%,高氯酸体积0.8ml,反应温度80℃,反应时间30min。测定文冠果壳苷含量为0.24mg/g。[结论]该测定方法简单,可行。