非洲猪瘟病毒P30蛋白原核表达及间接ELISA检测方法建立

【目的】建立快速、准确检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)抗体的间接ELISA方法。【方法】根据GenBank收录的ASFV分离株全基因组中的CP204L基因序列,在不影响氨基酸序列的前提下进行密码子优化,克隆到pCold TF冷休克表达载体,构建重组质粒pCold TF-p30。利用大肠杆菌原核表达系统进行IPTG诱导表达并对诱导时间和诱导浓度进行优化。用His标签镍柱对重组蛋白P30进行纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,用纯化后的P30重组蛋白作为抗原,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法并对反应条件进行优化,检验该方法的特异性、灵敏性和重复性,并用该方法与商品化试剂盒进行对比。【结果】重组质粒成功转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后以可溶性蛋白形式表达,在约82 ku处有目的蛋白特异性条带。当16℃诱导12 h时蛋白表达量最高,不同IPTG浓度诱导无明显差异。Western blotting结果显示,P30重组蛋白可与ASFV阳性血清产生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。建...     

猪传染性胃肠炎病毒N蛋白原核表达和间接ELISA检测方法的建立

试验构建了pET28a-TGEV-N重组表达质粒,完成TGEV N蛋白的表达和纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,表明表达产物N蛋白可被猪TGEV阳性血清识别。用TGEV N蛋白作为诊断抗原,建立了检测TGEV血清抗体的间接ELISA检测方法,该方法批内、批间重复试验变异系数均小于5%;检测血清的特异性为100%,假阳性率为0,假阴性率为5%,与7种常见猪病血清无交叉反应。针对临床血清,用该方法检测结果与中和试验结果相比,符合率为100%。该方法能够快速、有效地检出TGEV抗体,重复性和特异性好,为标准化诊断试剂盒的开发奠定了基础。     

丝状支原体山羊亚种LPPA蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立

【目的】建立基于丝状支原体山羊亚种(Mmc)膜脂蛋白LPPA的间接ELISA方法。【方法】扩增Mmc LPPA基因并将其克隆至pCold-Ⅰ载体,构建重组质粒pCold-Ⅰ-LPPA,测序鉴定正确后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经IPTG诱导表达后纯化得到Mmc LPPA重组蛋白,采用SDS-PAGE验证该重组蛋白是否表达,并采用Western blotting和传统经典的琼脂扩散血清学试验分析其与Mmc阳性血清的反应原性。以该重组蛋白为包被抗原,建立Mmc重组LPPA蛋白的间接ELISA抗体检测方法,对该方法进行反应条件优化后开展特异性、重复性试验,并将其初步应用于184份山羊血清样本。【结果】通过PCR扩增得到Mmc LPPA基因,成功构建了重组质粒pCold-Ⅰ-LPPA,经诱导表达后得到Mmc LPPA重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,获得了大小约23 ku的LPPA重组融合蛋白;琼脂扩散及Western blotting试验证明该蛋白反应原性良好。ELISA方法反应条件优化结果显示,LPPA抗原蛋白的包被浓度为2.0μg/100μL,血清稀释度为1∶300,3%BSA封闭...     

14型蓝舌病病毒VP7蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立蓝舌病(bluetongue,BT)的血清学诊断方法,本研究通过得到14型蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)的s7基因,并在大肠杆菌表达系统中进行表达,原核表达得到VP7蛋白,并对表达的包涵体VP7蛋白进行纯化,Western blot分析表明,纯化的VP7蛋白具有良好的抗原性。以纯化的VP7蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。该方法与羊痘阳性血清,羊口蹄疫阳性血清和羊的小反刍兽疫阳性血清均无交叉反应,与中和试验比较,两者符合率为90%,ELISA批内和批间重复性试验显示,D值的变异系数小于10%。说明本方法具有良好的特异性和重复性。本研究在国内首次建立了14型BTV抗体间接ELISA方法,可用于BTV感染的流行病学调查以及疫苗接种动物的抗体水平监测,为以后相关BTV ELISA检测试剂盒研发提供技术平台。     

山羊痘病毒G9蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

山羊痘病毒(GTPV)G9是一种膜蛋白,是潜在的优势抗原,为建立检测山羊痘的间接ELISA方法,本研究克隆GTPV G9基因并原核表达了重组G9蛋白,利用该蛋白作为包被抗原,经各反应条件优化建立了检测GTPV抗体的间接ELISA方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了评估.结果显示,原核表达的重组G9蛋白约为39...     

狂犬病病毒核蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

将狂犬病病毒核蛋白(N)与麦芽糖结合蛋白(MBP)在大肠杆菌中融合表达。采用Western blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测该重组融合蛋白的抗原性,并建立了间接ELISA方法检测狂犬病病毒特异性抗体。ELISA结果与快速荧光抑制试验(RFFIT)检测的中和抗体进行比较,RFFIT检测的中和效价与ELISA检测的OD值相关性很好(r=0.943 6),并且ELISA的敏感性和特异性分别为93.4%和100%。     

非洲猪瘟病毒I226R蛋白原核表达及检测I226R抗体间接ELISA方法的建立

本实验室前期构建了缺失I226R基因的非洲猪瘟病毒(ASFV)减毒株SY18△I226R,将其高、低单剂量(分别为10⁷TCID₅₀和10⁴TCID₅₀)接种家猪21 d后,对致死剂量ASFV SY18毒株的攻击,免疫猪均能达到100%保护,具有作为ASF疫苗候选株的潜力。为了能够有效区别家猪感染ASFV野毒株和SY18△I226R减毒株,本试验从ASFV SY18株基因组中扩增得到I226R基因片段,克隆到原核表达载体pET32a,将重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞后诱导表达,纯化后获得I226R蛋白(pI226R)。以纯化的pI226R为包被抗原,以不同缺失毒免疫猪或自然毒感染康复猪血清为检测对象,建立了针对pI226R抗体的间接ELISA检测方法。结果显示,pI226R重组质粒在BL21(DE3)细胞中经IPTG诱导表达,获得的蛋白大小为28 kDa。以pI226R为包被抗原的间接ELISA检测结果显示,该方法对阴性猪血清和SY18△I226R疫苗候选株接种猪血清检测的D_45...     

犬冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

以犬冠状病毒(CCV)TN449株为对象,对CCV核衣壳蛋白(N蛋白)编码基因进行克隆和原核表达,通过使用纯化的重组N蛋白,建立了CCV抗体间接ELISA检测方法。结果显示,重组N蛋白具有良好的CCV抗原反应性;经优化ELISA反应条件,确定重组N蛋白最佳包被浓度为1.0μg/m L、待检血清的最佳浓度为1∶100、阴阳性判定临界值为0.418;通过对比检测犬瘟热等多种犬病阳性血清,未发生交叉反应,证实该间接ELISA方法特异性好;用建立的间接ELISA方法对本室保存的50份CCV阳性血清和阴性血清进行复检,证实其符合率为100%。     

牛星状病毒神经型与肠道型ORF2蛋白原核表达及间接ELISA的建立与初步应用

通过GenBank中登录号(神经型BufAstV-GX-NN-ORF2-14、肠道型BufAstV-GX-NN-ORF2-12)合成神经型ORF2-14-1与肠道型ORF2-12-1基因序列,运用PCR技术扩增神经型ORF2-14与肠道型ORF2-12目的片段的基因并克隆到pET-32a(+)载体,成功构建了重组质粒神经型pET-32a-ORF2-14与肠道型pET-32a-ORF2-12,经鉴定正确后转化BL21(DE3)感受态细胞中成功诱导表达,纯化后的重组蛋白利用SDS-PAGE、Western blot进行鉴定。以纯化的神经型pET-32a-ORF2-14与肠道型pET-32a-ORF2-12重组蛋白为诊断抗原,成功建立牛星状病毒(bovine astrovirus, BoAstV)神经型与肠道型的间接ELISA抗体检测方法。运用建立的间接ELISA对2019-2020年广西省部分地区采集的712份牛血清进行BoAstV抗体的检测,结果显示肠道型共检出170份抗体阳性血清,BoAstV抗体阳性率为23%;神经型共检出124份抗体阳性血清,BoAstV抗体阳性率为17%;其中,2...     

边缘无形体MSP2的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立可检测边缘无形体（Anaplasma marginale）的血清学检测方法,该研究根据GenBank收录的边缘无形体MSP2基因序列（登录号：EU526889）,构建重组质粒pET28a-MSP2,原核表达获得pET28a-MSP2重组蛋白,将纯化后的蛋白作为抗原,建立间接ELISA检测方法。结果显示,该研究建立的间接ELISA方法,抗原最佳包被浓度、血清最佳稀释度和酶标二抗最佳工作浓度分别为8μg/mL、1∶400和1∶2 000,特异性、灵敏性和重复性良好。本试验成功表达并纯化了边缘无形体的MSP2蛋白,并建立了边缘无形体抗体间接ELISA方法,为边缘无形体的监测和诊断提供参考。     

Prokaryotic Expression of PEB1A Protein of Campylobacter jejuni and Establishment of an Indirect ELISA

In order to develop an indirect ELISA method to detect Campylobacter jejuni antibody, PEB1A gene of Campylobacter jejuni was cloned and amplified by PCR, the prokaryotic expression vector pET32a-PEBIA was constructed, and then transferred into the expression strain E.coli BL21 (DE3), and obtained about 47 ku of soluble protein. Western blotting result showed that the expressed recombinant protein had good biological activity, an indirect ELISA method for detecting antibody against Campylobacter jejuni was developed using expressed PEB1A protein as coating antigen,and detected its specificity, sensitivity, repeatability, respectively. The results showed that the established method for detection of Campylobacter jejuni antibody critical value was 0.3424. This method only specifically reacts with Campylobacter jejuni positive sera, and had no cross-reactivity with other antiserum and strong specificity. In addition, the coefficients of variations in both inter-and intra-assay were less than 5% indicating that it had good repeatability and stability. The establishment of this method could be applied to the rapid detection of Campylobacter jejuni in serum, and provided basis for further prevention and control of Campylobacter jejuni diarrhea.     

空肠弯曲菌PEB1A蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

为了建立检测血清中空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）抗体的间接ELISA方法,试验通过PCR扩增并克隆空肠弯曲菌PEB1A基因,构建原核表达载体pET32a-PEB1A,将该表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,诱导表达获得约47 ku的可溶性目的蛋白,通过Western blotting证明所表达的重组蛋白具有良好的生物学活性。以纯化后的重组蛋白作为包被抗原,建立空肠弯曲菌抗体间接ELISA方法,对其特异性、敏感性、重复性进行检测。结果表明,本试验建立的空肠弯曲菌抗体间接ELISA检测方法临界值为0.3424,本方法仅与空肠弯曲菌阳性血清发生特异性反应,与其他抗血清无交叉反应,具有较强的特异性,批内、批间的重复性试验变异系数均<5%,具有较好的重复性和稳定性。该方法的建立可应用于血清中空肠弯曲菌抗体的快速检测,为进一步防制空肠弯曲菌腹泻提供依据。     

绵羊肺炎支原体P6058aa-928aa蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

【目的】 建立基于绵羊肺炎支原体表面脂蛋白P60的间接ELISA方法。【方法】 利用生物信息学软件对P60蛋白进行抗原性分析,筛选出抗原性最佳的区域,扩增目的基因后构建重组表达载体并进行基因测序,将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导抗原性最佳蛋白表达并进行诱导时间优化;利用SDS-PAGE分析该蛋白分子质量大小及其表达形式。以重组蛋白作为抗原,绵羊肺炎支原体阳性血清作为抗体,通过Western blotting方法分析其反应原性。以重组蛋白为包被抗原,建立抗原性最佳蛋白的间接ELISA抗体检测方法,用该方法对20份阴性血清进行检测,计算阴阳临界值;检测该方法的特异性、敏感性和重复性,并用建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份绵羊临床血清样本进行检测。【结果】 经DNAStar分析,P60蛋白第58－928位氨基酸区域的平均抗原指数在0.8~1.7之间,亲水指数为0~2.0,证明该区域(P60_58aa-928aa)抗原性和亲水性较强;通过PCR扩增得到P60_58aa-928aa基因,并构建重组表达载体,通过基因测序证明该重组表达载体与预期结果一致。SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导浓度为1 mmol/L,诱导10 h时蛋白表达量较高,蛋白分子质量为42 ku,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达;Western blotting结果表明,构建的重组蛋白具有良好的反应原性。对ELISA各条件进行优化结果显示:抗原包被浓度为0.5 μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1∶100,最佳孵育时间为1.5 h,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶4 000,判定阴阳性血清的临界值为0.36。对口蹄疫病毒(FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、布氏杆菌(Brucella)、牛支原体(Mb)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)的标准阳性血清的检测均为阴性,证明该方法特异性较强;敏感性试验结果表明,血清稀释度为1∶2 048时仍为阳性;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均<10%,证明该方法具有较好的重复性。利用所建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份羊血清检测结果表明,二者的阳性符合率为81.6%,阴性符合率为92.6%,总符合率为88.0%。【结论】 本研究建立的间接ELISA方法可用于临床样本的检测,为绵羊肺炎支原体的疫苗免疫效果评价和疾病诊断提供了较为可靠的方法。     

鸭瘟病毒胸苷激酶基因的原核表达及其蛋白间接ELISA检测方法的建立

本研究旨在以表达纯化的鸭瘟病毒胸苷激酶(thymidine kinase,TK)重组蛋白作为包被抗原,建立检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法。根据GenBank上收录的鸭瘟病毒TK基因序列设计出1对引物,采用PCR扩增出鸭瘟病毒TK基因。将TK基因与原核表达载体pET-32a连接,通过PCR、双酶切和测序鉴定,将阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导表达。采用切胶纯化的方法纯化蛋白,Western blotting分析鉴定表达产物。用纯化的TK重组蛋白作为包被抗原,并优化其他条件,最终建立检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法。结果显示,重组质粒构建成功,经Western blotting检测得到目的蛋白,TK重组蛋白能被阳性血清识别,说明该重组蛋白具有较好的抗原性。确定了最佳反应条件:酶标二抗的最佳稀释度为1:200,最佳抗原、抗体的稀释度分别为1:400和1:200,抗原抗体作用时间为60 min,最佳封闭液为5% BSA,最佳封闭时间为60 min,最佳显色时间为10 min。结果表明,该方法具有良好的稳定性及较高的敏感性,为鸭瘟的检疫、监测和防制工作提供了一种有效的手段。     

Prokaryotic Expression of Thymidine Kinase Gene of Duck Plague Virus and Establishment of an Indirect ELISA Based on the Protein

In the study,an indirect ELISA was developed using the purified thymidine kinase (TK) protein as antigens to detect the antibody of duck plague virus (DPV).The TK gene of DPV was amplified by PCR using specific primers designed according to the sequence of TK gene in GenBank.Using gene recombination technology,the TK gene was cloned and inserted into prokaryotic expression vector pET-32a and the recombinant plasmid was identified by PCR,double enzyme digestion and sequence analysis.The positive recombinant plasmid was then transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced by IPTG.The expressed protein was purified by gel extraction and analyzed by Western blotting.Then an indirect ELISA was established to detect DPV antibody by using the purified recombinant TK as the coating antigen.The other assay conditions were also optimized.The recombinant plasmid was constructed successfully and Western blotting detected the target protein,TK recombinant protein could be recognized by positive serum,and the result indicated that the recombinant protein had good antigenicity.The optimum reaction conditions were as follow:The optimal dilution of enzyme labelled antibody was 1:200,the optimal dilutions of antigen and antibody were 1:400 and 1:200,reaction time was 60 min,most prefer blocking solution was 5% BSA,closed for 60 min,chromogenic time was 10 min.The method had good stability and high sensitivity,and it could provide a reliable method for the clinical detection,immunization surveillance,and prevention and cure of DP.     

巴泰病毒G1189aa-239aa肽段的原核表达、纯化及间接ELISA方法的建立

本研究旨在获得高纯度巴泰病毒（Batai virus,BATV） G1蛋白强抗原性肽段,并建立一种用于检测BATV羊血清抗体的间接ELISA方法。首先对G1蛋白51个氨基酸编码的189－239位氨基酸强抗原肽段进行密码子优化,基因合成后构建重组表达质粒pET-32a-G1_189aa-239aa,转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达。优化表达条件获得大量rHis-G1_189aa-239aa肽段,利用镍柱亲和层析方法进行纯化,并用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定。通过Western blotting对rHis-G1_189aa-239aa肽段进行抗原特异性分析,以rHis-G1_189aa-239aa肽段为抗原,羊BATV阳性血清作为抗体,通过方阵滴定优化反应条件,建立BATV间接ELISA检测方法。SDS-PAGE结果显示,rHis-G1_189aa-239aa肽段在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在,分子质量为24.5 ku,在0.1 mmol/L的IPTG诱导5 h后rHis-G1_189aa-239aa肽段表达量达到峰值。通过镍柱亲和层析纯化后,测得蛋白浓度为0.296 mg/mL。Western blotting结果显示,rHis-G1_189aa-239aa肽段特异性较好。以rHis-G1_189aa-239aa肽段为抗原建立的间接ELISA方法,通过条件优化确定最佳抗原包被浓度为2.5 μg/mL,血清和二抗稀释度为1∶60和1∶10 000。样品D_{450 nm}值≥0.367为阳性,D_{450 nm}值≤0.319为阴性。该方法与山羊痘病毒和布鲁氏杆菌的阳性血清均无交叉反应,批内和批间的变异系数均<10%,阳性血清最高可稀释至1 600倍,该方法具有特异性强、灵敏性高和重复性好的特点。利用本方法对云南地区的120份羊血清样本进行检测,血清阳性率为21.67%。本研究获得了特异性强和纯度较高的rHis-G1_189aa-239aa肽段,建立了间接ELISA方法,可应用于羊BATV血清流行病学调查,为疫病防控及致病机制研究奠定基础。     

猪瘟病毒石门株NS3蛋白的原核表达及其抗体检测间接ELISA的建立

为配合猪瘟新型疫苗的研发,建立了猪瘟病毒NS3蛋白抗体检测间接ELISA,以期达到有效区分新型疫苗免疫猪与自然感染猪(包括常规疫苗接种猪)的目的。以接种猪瘟病毒(CSFV)石门株的PK-15细胞为模板提取总RNA,经特异性PCR扩增获得长度为2 049bp的CSFV NS3基因,将其克隆至插入了具有自聚集自切割功能短肽的原核表达载体pET-32a(+),在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中优化表达CSFV石门株NS3基因。Western blot分析表明重组蛋白NS3具有反应原性。将纯化的重组蛋白NS3作为包被抗原建立检测CSFV NS3抗体的间接ELISA,以美国爱德士(Idexx)猪瘟病毒抗体检测试剂盒抗体检测结果为标准,对502份血清样品进行检测。结果表明,所建立方法的特异性为96.9%,敏感性为89.7%,总符合率为95.8%,为猪瘟新型疫苗的推广应用提供了血清学检测方法。     

羊种布鲁氏菌wzt基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

为建立检测血清中布鲁氏菌抗体的间接ELISA方法,本试验采用PCR技术从羊种布鲁氏菌QY1菌株中扩增得到wzt基因片段,连接到pET-30a载体上,构建质粒pET-30a-wzt,将鉴定正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,经原核表达系统对其进行表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析后,用亲和层析镍柱纯化wzt重组蛋白备用。以wzt重组蛋白为检测抗原,逐步优化条件后建立布鲁氏菌间接ELISA检测方法。结果显示,试验成功构建了pET-30a-wzt原核表达载体,并在BL21（DE3）宿主菌中表达;SDS-PAGE和Western blotting结果表明,重组蛋白约为35 ku,表达形式为上清,条带单一、无杂带,有很好的反应原性和特异性。ELISA优化试验确定了最佳包被浓度为15 μg/mL,血清最佳稀释度为1：80,酶标抗体的最佳稀释度为1：5 000;通过检测24份阴性样品确定临界值,当样品D_{450 nm}值≥ 0.30为阳性,样品D_{450 nm}值<0.30时为阴性;特异性试验表明,该方法不与小肠耶尔森菌、大肠杆菌发生交叉反应;批内及批间变异系数均<10%;用该方法对120份血清样本进行检测,并与虎红凝集试验进行相符性验证,符合率为96%。本试验建立的间接ELISA方法为布鲁氏菌病的检测提供了可靠的技术手段。     

狂犬病病毒中和抗体ELISA技术的建立

将狂犬病病毒(RV)糖蛋白(G蛋白)中和抗原表位串联表达的重组蛋白作为抗原,建立了检测RV中和抗体的间接ELISA技术。结果表明,最佳抗原包被量为2μg/孔,被检血清最佳稀释倍数为1:200。该方法与快速荧光灶抑制试验(RFFIT)的阳性符合率为88%,阴性符合率为96%。特异性试验表明,该抗原不与犬腺病毒I型、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬冠状病毒阳性血清发生交叉反应,具有良好的特异性。板内和板间重复性试验的平均变异系数分别为2.7%和4.2%,具有良好的重复性,为动物RV中和抗体检测提供了简单快捷的检测方法。