奶牛性别鉴定的研究与应用

选取牛雄性性别决定基因SRY (sex region of Y chromosome),根据基因序列设计特异引物,应用PCR技术对5头荷斯坦奶牛DNA样品进行扩增,鉴定其性别;并对设计的引物灵敏度进行检测;对已有的公、母各20头荷斯坦奶牛DNA样品进行PCR盲检,获取奶牛高灵敏度特异性引物,用于奶牛性别鉴定。结果表明,4头公牛DNA样品可以扩增出目标条带(66 bp),1头母牛DNA样品无法扩增出条带,阴性对照扩增无条带;最佳引物灵敏度为1.6 pg/μL,可以很好地满足性别鉴定需要。40头个体中,20头个体DNA样品可以扩增出条带,其余20头个体DNA样品无法扩增出条带,检测结果与实际性别对比准确率为100%。试验结果表明,设计的引物灵敏度比较好,能够满足奶牛性别鉴定的需要。     

美洲狼尾草不育系、恢复系及杂种F_1的RAPD分析

利用 RAPD技术对美洲狼尾草不育系 2 3A、2 3DA、85 DA,恢复系 3B- 6及其相应的 3个F1杂交种基因组 DNA进行了多态性分析 ,摸索出一套适合美洲狼尾草 DNA提取、PCR扩增方法。对随机选取的 2 7个引物进行扩增 ,结果有 5个引物扩增出多态性条带 ,其中引物S369扩增的条带不仅重复性好 ,而且清晰 ,为美洲狼尾草亲本材料及其杂交种鉴定和纯度分析提供了一种快速、准确的检测手段。     

一种快速鸡血样DNA提取方法的研究

本试验优化了鸡血样DNA提取方法,通过分光光度仪检测浓度达到216.35±100.02 ng/μL,OD260/OD280值1.83±0.28,与血液基因组提取试剂盒提取的DNA比较,差异显著(P0.05)。DNA样品经琼脂糖凝胶电泳检测带型清晰、整齐,无拖尾现象。结果显示,本法提取的鸡血样DNA在纯度和浓度上能够满足鸡分子基因检测的需求。     

美洲狼尾草不育系、恢复系及杂种F1的RAPD分析

利用RAPD技术对美洲狼尾草不育系23A、23DA、85DA,恢复系3B-6及其相应的3个F1杂交种基因组DNA进行了多态性分析,摸索出一套适合美洲狼尾草DNA提取、PCR扩增方法.对随机选取的27个引物进行扩增,结果有5个引物扩增出多态性条带,其中引物S.扩增的条带不仅重复性好,而且清晰,为美洲狼尾草亲本材料及其杂交种鉴定和纯度分析提供了一种快速、准确的检测手段.     

美洲狼尾草不良系、恢复系及杂种F1的RAPD分析

利用RAPD技术对美洲狼尾草不育系23A，23DA，85DA，恢复系3B－6及其相应的3个F1杂交种基因组DNA进行了多态性分析，摸索出一套适合美洲狼尾草DNA提取，PCR扩增方法，对随机选取的27个引物进行扩增，结果有5个引物扩增出多态性条带，其中引物S369扩增的条带不仅重复性好，而且清晰，为美洲狼尾草亲本材料及其杂交种鉴定的纯度分析提供了一种快速，准确的检测手段。     

贝类派琴虫LUX荧光PCR检测方法的建立

为满足贝类派琴虫病的快速检测需要,本研究选择派琴虫保守的核糖体DNAITS-2区域设计引物,通过对反应体系和反应条件的优化,首次建立了LUX荧光PCR检测派琴虫的方法。试验表明,所建立方法检测质粒模板DNA的动态范围为1.0×101-1.0×108,敏感性为10拷贝质粒DNA。采用模拟阳性样品试验,可检测到100拷贝质粒DNA。而且与贝类的包拉米原虫、隐孢子虫等其它寄生性原虫无交叉反应,也不受组织DNA的干扰。50份采集样品的检测结果与RFTM培养方法一致。本研究所构建的派琴虫LUX荧光PCR检测方法具有快速、灵敏、特异等优点,可满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需要。     

绵羊粪便中植物基因组DNA的提取及其PCR检测

本试验采集了16只圈养绵羊的新鲜粪便,利用试剂盒法(酚-氯仿法)对粪便基因组DNA进行了提取。电泳检测结果表明:从绵羊粪便中获得的DNA纯度较高,完整性好。以提取的基因组DNA为模板,利用文献报道的2对通用引物(r D5-ITS2/rb1-ITS2和rbc LZ1/rbc L19b)以及自行设计的羊草ITS特异性引物(ITS-LC)、碱茅ITS特异性引物(ITS-PD)和芦苇rbc L特异性引物(rbc L-PA)进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳分析结果表明,5对引物均能获得成功扩增,并得到目的条带。进一步对羊草、碱茅和芦苇进行序列测定,并将测序结果通过Gen Bank数据库进行Blast比对。结果表明:DNA相似性分别为95%、94%和98%,可以证明扩增产物分别属于羊草、碱茅和芦苇的某个片段。     

牛乳中无乳链球菌PCR快速检测方法的建立

根据GenBank公布的的SIP基因序列,设计一对特异性引物,通过对PCR方法的优化,建立了牛无乳链球菌性乳房炎的快速PCR检测方法。用建立的PCR检测方法对患牛乳中无乳链球菌总DNA进行扩增．获得大小为945bp的DNA片段。特异性试验表明,停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DNA均未扩出条带;敏感性试验表明,该对引物能够检测到的最低DNA浓度为1．25ng;重复试验表明该方法具有良好的重复性和稳定性。     

超细型细毛羊基因组DNA的AFLP检测研究

利用AFLP标记对超细型细毛羊品系纯度进行检测,旨在为评价该品系细毛羊的遗传特性,采用TaqⅠ和EcoRⅠ双酶切,利用6对引物对24只细毛羊基因组DNA进行分析,共获得226个AFLP标记,1对引物获得的标记数在29~50之间,新吉超细型细毛羊相似系数AFLP研究结果为0.914~0.982,本研究为评价新吉超细型细毛羊遗传稳定系数提供了相关的参数。     

基因组特异性引物扩增细菌转录产物标记后用于DNA芯片分析

DNA芯片能够在一个载体上同时分析至少两种实验条件下,上千个基因的表达.但是,DNA芯片分析时要求有足够的RNA来产生探针,尤其是在进行细菌RNA杂交时(50μg细菌总RNA约含2μg mRNA).我们研制出一种以计算机为基础推测最小引物数量的方法,这些引物与假定基因组的全部基因都能特异性配对.例如,通过这个推测方法获得37个寡核苷酸片段,能够扩增出结核分枝杆菌基因组的全部基因.我们检测了基因组特异性引物(Genome directed primers,GDPs)的有效性,并在DNA芯片上检测基因表达时与随机引物进行了比较性研究.我们用这两种引物制备荧光标记探针,并在芯片上与960个位点的细菌基因杂交.与随机引物比较,GDPs更敏感、特异,尤其是在从哺乳动物RNA样品中检测结核杆菌RNA的时候.     

适于滞育期蚕卵的基因组DNA提取方法

家蚕以卵滞育,蚕卵保存时间长,取样方便,但是DNA含量较低,抽提较为困难,利用不多。从处于滞育期(丙2胚子前)的蚕卵中快速高效地获取基因组DNA,对于提高家蚕研究效率具有实用价值。本试验对两种SDS法和一种CTAB法的抽提效果进行比较,结果表明SDS-II提取效果较好,单粒蚕卵提取基因组DNA即可用作PCR模板,5粒蚕卵获得DNA可以基本满足分子生物学研究需要。     

蒙古马肠道细菌总DNA提取方法的比较

本试验采集蒙古马新鲜粪便样品,采用酚－氯仿抽提法和2种细菌基因组DNA提取试剂盒法进行样品中细菌基因组DNA的提取。通过DNA浓度和纯度的测定,并将其作为模板扩增细菌16S rDNA V3区特异性片段对提取效果进行比较,从而找出更适合蒙古马粪便中细菌基因组DNA的提取方法。结果显示,3种提取方法得到的基因组DNA均能用于PCR扩增的模板,其中B试剂盒法提取的DNA数量较多,且纯度高,更适合用于提取蒙古马肠道微生物细菌基因组DNA及后续的蒙古马肠道微生物多样性等分子生物学试验。     

全血中DNA的5种不同提取方法比较研究

比较几种从血液中提取DNA方法所需要的时间、样本量、提取的DNA纯度、产量以及成本等。结果表明,几种方法所提取的DNA质量都能达到分子生物学的试验要求,但在DNA的纯度、产量、试验时间和价格等方面存在差别。实验人员可根据自己的实验要求、实验室以及经济条件等选择适当的方法。     

基于AFLP分子标记分析陕西省保存主要家蚕品种的遗传多样性及亲缘关系

采用AFLP分子标记技术分析陕西省保存的53个代表性家蚕品种的遗传多样性,为合理利用品种资源,选育适合西北蚕区饲养的优良家蚕品种提供理论依据。用供试品种滞育期的蚕卵提取基因组DNA,选用重复性较好的14对引物组合进行AFLP扩增,共获得535个条带,其中有472个条带呈多态性,多态性比率为88.22%。采用UPGMA方法对供试品种间的亲缘关系进行聚类分析,53个品种间的遗传距离为0.072 8～0.601 9,主要分为中系、日系和欧系3大类群,其中:日系和欧系品种遗传距离较近,与传统的家蚕系统按来源地分类的结果吻合;4个陕西地方一化三眠蚕品种明显有别于其它家蚕品种而归为一个特殊类群,提示其具有独特的种质特性。此外,采用滞育期的蚕卵提取家蚕基因组DNA,可以克服取样的时间限制,满足实验需要。     

牛凝固血基因组DNA提取方法的比较及优化

为筛选出一种从牛凝固血中高效获得基因组DNA的方法,本研究选择64个凝固血样,分别进行匀浆破碎和手动剪碎的预处理,结合酚-氯仿抽提和试剂盒提取方法,提取基因组DNA,并选择抗凝血作为参照,对试验耗时、DNA数量和质量进行比较。结果表明:通过对牛凝血块进行匀浆破碎预处理,不仅缩短了蛋白酶K的消化时间,而且获得了高质量基因组DNA,浓度和纯度均达到抗凝血提取效果(P0.05)。酚-氯仿提取法相比试剂盒法,虽然得到更多量的DNA,但是DNA质量下降,而且试验耗时增加。本研究证实,匀浆破碎预处理后的牛凝固血样可以作为高质量基因组DNA的样本来源,并可替代抗凝血,解决生产中抗凝血不易获得和采集的问题。     

一种东北虎全血DNA抽提的方法

以8只东北虎全血为材料，用CTAB自配细胞裂解液和细胞沉淀液，采用改进的方法提取基因组DNA。结果表明，提取的基因组DNA纯度高，用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA，主带清晰、无拖尾现象。     

家蚕核型多角体病毒多角体的快速提取方法

本文采用一种新的病毒多角体提取方法,对BmNPV和PcrNPV的多角体进行了提取,提取出的多角体分别用光学和电子扫描两种显微镜进行观察并拍照.同时从提取出的BmNPV多角体中提取其基因组DNA并电泳检测.发现DNA纯度较好.结果表明,可以用此方法大量制备病毒多角体.     

提取家蚕肠道微生物总DNA的2种方法的比较研究

为寻找提取家蚕中肠道微生物总DNA的方法,比较研究了2种方法:①直接提取家蚕中肠道内容物的总DNA,再选择性研究其中来源于微生物的DNA;②先分离家蚕中肠道的微生物,再提取其总DNA.结果表明,方法②所得到的DNA数量较少,但纯度较高;方法①的数量多,种类齐,但杂质多.2种方法分别适合于不同的研究目的.     

湖北省家蚕微粒子病流行规律分析

采用回归分析的方法,对湖北省及6个下属蚕种场1993—2012年蚕种生产检验数据进行统计分析,发现蚕种生产量与超毒率存在正相关的关系,并建立数学模型,推导不同蚕种场较安全的蚕种生产规模临界值,避免因蚕种生产量过大导致微粒子病暴发的危险。     

家蚕浓核病毒中国(镇江)株基因组的克隆及重组质粒转染家蚕对浓核病毒的拯救

家蚕浓核病毒中国(镇江)株(BombyxmoriDensovirus Zhenjiang Strain,BmDNV-ZJ)包含VD1和VD2共2种基因组DNA。以BmDNV-ZJ感染家蚕中肠总DNA为模板,采用PCR方法扩增得到2种DNA,并将其克隆到质粒pGEM-T构建了重组质粒pGEM-VD1和pGEM-VD2。采用DEAE-dextran转染技术,将2种重组质粒分别导入家蚕幼虫体内,能使家蚕幼虫发病,免疫双向扩散和免疫酶组化法检测都能检出阳性反应,但转染pGEM-VD2重组质粒的家蚕幼虫发病率较低。通过重组质粒转染方法,可以使BmDNV-ZJ感受性品种和抵抗性品种都发病,但感受性品种的发病率较高。将重组质粒转染发病蚕的中肠匀浆,取上清液经口接种健康蚕幼虫,也能使其发病。上述结果表明,携带BmDNV-ZJ DNA的重组质粒在家蚕幼虫体内拯救出了感染性的病毒粒子。