抗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌鼠源化噬菌体抗体库的构建及筛选

用灭活的甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌免疫小鼠后,取出小鼠脾脏提取总RNA,以RT-PCR扩增小鼠抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,以重叠延伸PCR(SOE-PCR)法将VH和VL拼接成ScFv基因,克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E中,转化大肠杆菌E.coli TG1,构建鼠源抗金黄色葡萄天然噬菌体抗体库。研究结果表明,构建的鼠源性抗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌抗体库库容为3.2×106,多样性良好,共筛选出8个阳性克隆。说明已成功构建抗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌抗体库,为筛选有效治疗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌奠定了基础。     

抗苏云金芽孢杆菌Cry1B毒蛋白质单链抗体的筛选与鉴定

利用人源化噬菌体抗体库筛选抗Bt Cry1B毒蛋白质的单链抗体(Single-chain antibodies,scFv)。将扩增后的噬菌体抗体库与固相化包被的Cry1B毒蛋白质特异性结合,经4轮"吸附-洗脱-扩增"后,富集特异性识别Cry1B毒蛋白质的噬菌体单链抗体。从最后一轮筛选中随机挑取单菌落进行单克隆ELISA鉴定,对阳性克隆进行PCR扩增、DNA电泳鉴定及测序,成功筛选获得8个阳性噬菌体scFvs,经鉴定均有完整外源基因片段插入。挑取阳性值最高的scFv(1E2)建立了基于单链抗体的Cry1B毒蛋白质间接竞争ELISA检测方法。结果表明,Cry1B毒蛋白质对噬菌体scFv(1E2)的抑制中浓度(IC50)为1.075μg/ml,最低检测限(IC10)为0.013 4μg/ml,线性检测范围在0.5μg/ml至4.0μg/ml之间。     

斑点叉尾天然单链(ScFv)噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

以健康未经免疫的斑点叉尾为试验材料,取其新鲜外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增重链Fd和轻链cDNA,以纯化的VH、VL基因为模板,以与VH基因3′-端和VL基因-5′端序列互补的Linker—Primer Mix为引物,将VH、VL随机拼接为ScFv。通过酶切连接,依次将PCR产物插入质粒p3MH相应位点,热激法转化大肠杆菌XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM 13,构建噬菌体单链抗体库。测定库容并酶切鉴定。斑点叉尾天然单链(ScFv)噬菌体抗体库成功构建为进一步筛选特异性抗体及从斑点叉尾病变组织中提取特异性抗原用于免疫治疗奠定了基础。     

抗速灭威噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定

以速灭威抗原免疫的小鼠为实验对象,取其脾细胞,RT-PCR扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,重叠延伸PCR拼接单链抗体(ScFv)基因,克隆入噬菌粒表达载体pCANTAB5E并转化大肠杆菌TG1,成功构建了库容约7.6×105的抗速灭威噬菌体ScFv库。对该文库进行了5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集筛选,获得了6个特异性较强的抗速灭威噬菌体ScFv阳性克隆。其研究结果为速灭威特异性抗体的大量制备奠定了一定的基础。     

PCV2 Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建及淘选

用重组的PCV2Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,从免疫小鼠脾细胞中提取总RNA,经反转录后,扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,利用Overlap PCR方法将VH基因和VL基因组装成单链抗体(ScFv)基因,将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB-5E中,并将重组载体转化至感受态大肠杆菌TG1中,获得PCV2Cap蛋白的单链抗体文库,经测定抗体库库容为3.58×106。通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建鼠源PCV2Cap蛋白的噬菌体单链抗体库。4轮生物淘选后,经ELISA方法检测,最终获得3株能与Cap蛋白特异性结合的噬菌体克隆。     

抗人整合ανβ3单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体的构建和表达

为构建抗人整合素ανβ3单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面表达,采用PCR方法从整合素ανβ3单抗E10ScFv载体中,扩增重链可变区VH和轻链可变区VL基因。将VH基因与人重链恒定区CH1基因连接,VL基因与人CK基因连接,分别构建了鼠/人嵌合重链FD基因和轻链基因,将其克隆入pComb3,构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,用辅助噬菌体VCSM13超感染,间接ELISA及竞争抑制ELISA检测鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体活性。结果成功构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面展示了可结合人整合素ανβ3抗原的鼠/人嵌合Fab抗体。     

胰腺癌人源噬菌体单链抗体库的构建及初步筛选

提取胰腺癌患者的外周淋巴细胞总RNA,以RT-PCR技术分别扩增出人源抗体H链和L链的可变区基因,采用SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成scFv片段,然后将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,并电转化至感受态TG1菌,经辅助噬菌体M13K07拯救,获得胰腺癌人源噬菌体单链抗体库。结果表明,从外周血淋巴细胞中获取可变区基因,利用噬菌体抗体库技术制备人源抗胰腺癌单链抗体的策略是可行的。     

抗猪瘟病毒单链抗体基因的构建及其推导的蛋白质三级结构的分子模拟

为利用抗猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)单链抗体基因(ScFv)建立CSFV病原快速检测方法,以抗猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株总RNA为模板,通过RT-PCR扩增重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),以柔性多肽(Gly4Ser)3为接头(Linker),经重叠延伸反应将VH、VL基因拼接为完整的CSFV-ScFv基因,并进行克隆、测序分析。结果显示,所克隆单链抗体基因全长732 bp,包括363 bp的VH、45 bp的Linker和324 bp的VL,为VH-Linker-VL结构,编码的氨基酸序列含有明确的互补决定区(CDR)和框架区(FR)以及特征性的半胱氨酸残基,并与多种鼠源单链抗体基因高度同源,具有重组功能性鼠源抗体可变区特征。对CSFV-ScFv基因所编码蛋白质三级结构进行预测,显示其形成口袋样形状的空间构象,理论上具有良好的抗原结合活性。表明本研究成功构建了CSFV-ScFv基因。     

抗HepG2核糖体展示抗体库的构建

[目的]构建鼠源抗HepG2核糖体展示抗体库。[方法]以培养的HepG2肝癌细胞4次免疫Balb／c小鼠,取脾脏分离总RNA,逆转录合成第一条链,PCR扩增重链可变区和轻链k,经linkerDNA连接形成VH／k核糖体展示抗体库。将VH／k与pMD18-T载体的连接产物转化E．coliTGI,蓝白斑筛选,挑取白色菌落,提取质粒,PCR鉴定,并测序。[结果]VH和k链得到正确的扩增,长度分别为399和6476p,VH／k连接产物正确,连接产物长度为10936p：[结论]所采用的引物及反应条件能够扩增出目的基因,成功构建了鼠源抗Hepc2核糖体展示抗体库,为进行核糖体展示体外筛选抗HepG2特异性单链抗体奠定基础。     

抗 ICOSL 核糖体展示单链抗体库的构建

[目的]构建出鼠源抗ICOSL核糖体展示抗体库。[方法]通过RT—PCR从人B淋巴瘤细胞Daudi的总RNA中扩增出ICOSL胞外区基因,并将此基因插入到原核表达载体pET28a中进行表达。以表达纯化的ICOSL蛋白为抗原免疫Balb／c小鼠,取小鼠脾脏提取总RNA,通过RT—PCR扩增小鼠的重链可变区和Linker（VH—linker）序列,以及轻链可变区和Linker（VK—linker）序列。经重组PCR将两段基因连接起来,将VH／K与pMD19一T载体链接产物转化E．coliDH50L,PCR鉴定并测序。[结果]VH和κ链得到正确的扩增,长度分别为421和689bp,V14／κ连接产物正确,连接产物长度为1079bp。[结论]所采用的引物及反应条件能够扩增出目的基因,成功构建了鼠源抗ICOSL核糖体展示抗体库,为进行核糖体展示体外筛选抗IcosL特异性单链抗体奠定基础。     

IgM型单克隆抗体之scFv库的建立与筛选

从一个抗脂磷酸聚糖IgM型单克隆抗体细胞的mRNA中经RT-PCR克隆重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),然后将VH、Linker和VL连接成scFv,并克隆到载体pCANTAB-5E,转Escherichia coliTG1感受态细胞,构建了单链抗体库。通过辅助噬菌体M13KO7感染后,使单链抗体展示在噬菌体衣壳蛋白pIII的N端,得到噬菌体展示的抗体库。将抗体库用于"淘洗—富集—扩增"3轮以后,得到针对脂磷酸聚糖特异性的噬菌体抗体。测序结果表明,该scFv的VH基因序列全长390 bp,编码127个氨基酸;VL基因序列全长341 bp,编码113个氨基酸。二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有4个框架区(FR)、3个抗原互补决定区(CDR)及抗体特征性的2个半胱氨酸残基。     

抗人整合素ανβ3单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体的构建和表达

为构建抗人整合素ανβ3单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面表达,采用PCR方法从整合素ανβ3单抗E10ScFv载体中,扩增重链可变区VH和轻链可变区VL基因.将VH基因与人重链恒定区CH1基因连接,VL基因与人CK基因连接,分别构建了鼠/人嵌合重链FD基因和轻链基因,将其克隆入pComb3,构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,用辅助噬菌体VCSM13超感染,间接ELISA及竞争抑制ELISA检测鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体活性.结果成功构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面展示了可结合人整合素ανβ3抗原的鼠/人嵌合Fab抗体.     

Cry2A毒素抗独特型单链抗体库的构建

为了降低苏云金杆菌Cry2A毒素的免疫检测成本,开发廉价、无毒试剂盒,采用整体抗体免疫和噬菌体展示技术的路线,设计和构建了Cry2A抗独特型单链抗体库。以Protein A纯化的Cry2A兔多克隆抗体为免疫原,对雌性Balb/c系小鼠进行了免疫。在优化的包被原浓度下,用ELISA法测定小鼠血清效价及抗独特型抗体组分。选取效价最高的小鼠,取脾脏提取总RNA,RT-PCR法合成c DNA第一链。设计简并引物,利用PCR法扩增小鼠VH、Vκ基因,再用SOE-PCR法进行单链抗体基因的拼接。SOE-PCR产物和p IT2载体经双酶切后连接,电转入感受态E.Coli. TG1完成建库,并用多克隆噬菌体ELISA对抗体库与免疫原的结合能力进行了鉴定。结果表明,免疫鼠血清的效价在1∶1.6×105到1∶6.4×105倍之间。免疫鼠血清可对Cry2A与其兔多克隆抗体的结合最高可产生17. 6%的抑制,证明Ab2β和Ab2γ型抗独特型抗体的存在。最终构建了库容为1.2×107的Cry2A抗独特型单链抗体库,该抗体库与免疫原的结合信号/背景比值为6. 04。     

抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇噬菌体单链抗体库的构建与鉴定

从抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON毒素)杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL基因片段,再经重叠延伸PCR拼接扩增得到单链抗体基因(ScFv),克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上。然后转化感受态大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,构建成抗DON毒素噬菌体单链抗体库,库容约为1.1×105,滴度为1.3×108pfu。随机选取10个克隆进行双酶切鉴定,结果显示均有ScFv基因片段插入。抗DON毒素单链抗体库的构建,为进一步富集筛选并表达抗DON毒素单链抗体奠定了基础。     

硫代磷酸酯类杀虫剂ScFv抗体库的构建与初步筛选

旨在构建硫代磷酸酯类杀虫剂单链抗体(ScFv)库,并对其进行初步筛选。采用RT-PCR法从牛血清蛋白(BSA)人工抗原免疫的Balb/C小鼠脾细胞中克隆出VH和VL基因,通过重叠延伸PCR方法将VH和VL基因拼接在一起,构建ScFv基因,与表达载体pCANTAB 5E连接后,在大肠杆菌中诱导表达。采用亲和富集法,经6轮淘筛后用酶联免疫吸附分析(ELISA)测定其活性。得到滴度为2.2×106 pfu/mL噬菌体库,ELISA检测呈阳性。说明成功表达并筛选得到鼠源抗硫代磷酸酯类杀虫剂ScFv抗体库。     

牛病毒性腹泻病毒纳米抗体文库的构建与鉴定

通过构建牛病毒性腹泻病毒(BVDV)驼源重链抗体文库,并鉴定抗体文库的多样性,为筛选抗BVDV特异性重链抗体奠定基础。利用灭活的BVDV免疫双峰驼,多次免疫后测定血清抗体滴度,采集免疫后的血液并分离其外周淋巴细胞,抽提RNA,用RT-PCR法扩增重链抗体可变区(VHH)片段;将其克隆至载体pCANTAB5E,电转大肠杆菌TG1获得VHH抗体基因库,检测抗体库库容量,随机挑取克隆测序验证抗体文库多样性。结果表明,所构建的抗体文库的库容量为4.32×105;测序和聚类分析表明,抗体文库多样性丰富。利用辅助噬菌体救援后,得到噬菌体展示文库,测定滴度达1.3×1012 cfu/mL。     

天然鼠源噬菌体抗体库的构建及抗羊抑制素基因工程单抗的筛选

 【目的】构建单链抗体（ScFv）噬菌体表面展示文库,从中筛选抗羊抑制素单抗并进行表达,建立制备羊抑制素单抗的新方法。【方法】用未经免疫的多种小鼠脾细胞作为基因来源,采用噬菌体抗体库技术,构建天然噬菌体表面抗体文库。用羊抑制素对其进行3轮吸附-洗脱-富集,筛选抗羊抑制素单抗,用ELISA检测其抗原结合活性。【结果】构建了天然鼠源噬菌体抗体库,为筛选和制备各种单链抗体提供了一个平台。用羊抑制素对其进行筛选,制备抗羊抑制素单抗,经ELISA检测,55/96克隆具有与羊抑制素结合活性,阳性率为57%。【结论】制备的羊抑制素可溶性ScFv及其表面展示噬菌体抗体有很好的抗原结合活性,为羊抑制素单抗的制备提供了一种新的方法。     

Cry2Aa毒素结合十二肽的筛选与鉴定

利用Cry2Aa毒素蛋白对噬菌体展示随机十二肽库进行4轮筛选,并从第4轮筛选产物中随机挑选20个单克隆,进行单克隆ELISA、PCR扩增、DNA电泳及测序,鉴定这些克隆与Cry2Aa毒素的结合活性。结果显示,这20个克隆均能与Cry2Aa毒素发生特异性结合,并推导出8条不同的序列。挑取阳性值最高的克隆GT(氨基酸序列为GTPWHHHRHLIV)建立了基于十二肽的Cry2Aa毒蛋白的间接竞争ELISA检测方法。该方法的抑制中浓度(IC50)为1.139 0μg/ml,最低检测限IC10为0.021 1μg/ml,线性检测范围为0.047 8~22.691 0μg/ml(Y=23.09 lgx+48.692,R2=0.996 3)。噬菌体展示肽库筛选方法为快速、准确地检测Cry2 Aa毒蛋白提供了新的途径。     

磁珠筛选抗Cry2Aa人源化单链抗体及检测方法的建立

为了建立转基因成分的快速检测方法,利用亲和磁珠偶联Cry2Aa毒素蛋白从人源化噬菌体抗体库Tomlinson I中液相淘选特异性单链抗体(sc Fv)。通过4轮"扩增-吸附-洗脱",从洗脱产物计数板上随机挑取单克隆进行初步鉴定。选取相对结合活性最好的阳性克隆建立间接竞争ELISA,确定其检测范围。筛选后第4轮相对产出率较第1轮提高了4.07×106倍;单克隆ELISA鉴定出8个含有完整外源基因片段的阳性克隆,测序后获得3个不同序列的阳性克隆。D5克隆的噬菌体上清对Cry2Aa的检测灵敏度(IC10)为6.632 ng/ml,线性范围为0.016~2.881μg/ml。该克隆对Cry2Aa具有良好的特异性和板内板间重现性。     

猪蛔虫卵可溶性抗原单链抗体库的构建及初步筛选

为进一步研制抗猪蛔虫的高特异性、高亲和力的基因工程抗体奠定基础,以猪蛔虫未成熟虫卵可溶性抗原免疫BALB/C小鼠,提取小鼠脾脏总RNA,以RT-PCR技术分别扩增出H链和L链可变区基因,以SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成ScFv片段,然后将ScFv片段克隆至pCANTAB-5E载体,并转化至感受态TG1菌,经...