松墨天牛NCOA7基因的克隆及分析

【目的】本文探究了松墨天牛核受体共激活因子7基因的功能和作用方式。【方法】采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法获得了松墨天牛NCOA7基因的cDNA全长序列,命名为MaNCOA7(GenBank登录号:KU240004);通过RT-qPCR分析得出松墨天牛MaNCOA7基因在卵、幼虫、蛹、成虫4个虫态、幼虫脂肪体等6个组织和成虫鞘翅等10个部位的表达模式。【结果】MaNCOA7基因的cDNA序列全长为3345 bp,其中开放阅读框(ORF)长2970 bp,编码989个氨基酸,由此推测的蛋白分子质量为111 220.4ku,等电点为5.11。MaNCOA7的氨基酸序列与赤拟谷盗相似性最高,为83.6%,与赤拟谷盗处在系统发育树的同一个分支上;没有信号肽和跨膜区,属于亲水性氨基酸,含有丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)磷酸化位点数分别为62、21、11个。MaNCOA7基因在幼虫虫态表达量最高,在卵虫态表达量最低;在幼虫6个组织中均有表达,且有显著差异(P0.05),其中在幼虫脂肪体中表达量最高,在幼虫马氏管中表达量最低;在成虫10个部位中均有表达,且有显著差异(P0.05),其中在成虫鞘翅的表达量最高,在成虫马氏管的表达量最低。【结论】推测MaNCOA7基因在松墨天牛幼虫脂肪体中参与调控某些代谢过程或组织器官的生理功能,并可能参与了松墨天牛羽化过程中鞘翅和前胸背板的骨化过程。     

松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶基因克隆与表达

谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶(glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase,GFAT)是己糖胺通路(HBP)的限速酶,参与几丁质的合成和蛋白质的糖基化。本研究利用RACE克隆了松墨天牛GFAT基因(Ma GFAT),Gen Bank登录号为KT362367,其长度为2624 bp,开放阅读框为2061 bp,编码686个氨基酸。序列对比分析显示Ma GFAT与赤拟谷盗相似性最高,为88%,在系统发育树上位于同一分支。采用RT-q PCR方法检测Ma GFAT在松墨天牛不同组织及不同发育时期的表达情况,结果表明:Ma GFAT在各虫态中,成虫中的表达量最高;在成虫部位中,翅的表达量最高;在幼虫各组织中,体壁的表达量最高。本文为研究GFAT结构与功能的关糸奠定基础,为阐明GFAT在松墨天牛几丁质合成中的作用提供参考。     

松墨天牛中性肽链内切酶2基因的鉴定与表达

为了探讨M13家族中的中性肽链内切酶2基因在昆虫中的表达特性,以松墨天牛为研究对象,从cDNA文库中筛选到松墨天牛中性肽链内切酶2基因,命名为MaNep2(GenBank:KU245762)。该序列长为2 471bp,其中编码序列为2 280bp,共编码759个氨基酸。由此预测的蛋白质二级结构主要由α-螺旋与无规则卷曲组成,其次是延伸链与β-转角。MaNep2基因编码蛋白定位于细胞质,为跨膜蛋白,跨膜区长度为23个氨基酸(C~(25) LTLSTAVAFVIGISLVVALATV~(47)),并存在一个低复杂度区域:I~(423) SAGSLSIASGAL~(435)。通过DNAMAN软件比对发现MaNep2与山松甲虫和赤拟谷盗同源性最高,为82%,且存在4个保守结构域序列:NAFY(553-556)、HEITH(594-598)、ENIAD(656-660)、CXXW(756-759);用MEGA4.0构建系统发育树,显示松墨天牛与山松甲虫处在同一分支。qPCR分析表明:MaNep2的表达与松墨天牛的变态发育相关,各虫态不间断表达,幼虫期表达表现先上升后下降,化蛹期间表达表现为先下降后上升,羽化期间表达表现为先上升后下降,并在初羽化的成虫中表达量达到最大值;幼虫和成虫头部表达量最高,且在马氏管中均有表达;成虫的足、翅、触角和卵巢中也都有表达。     

松墨天牛ADP核糖基化因子1基因的序列及表达特性分析

为了探讨Ras基因超家族中ADP核糖基化因子1基因(ARF1)在昆虫生长发育进程中以及在温度胁迫下的表达特性,以松墨天牛为研究对象,从已构建的cDNA文库中筛选到松墨天牛ARF1基因,命名为MaARF1(Gen Bank:KY368168),对其进行序列分析以及不同虫态和不同温度胁迫下的表达特性分析。结果显示,MaARF1基因编码区序列长为549 bp,编码182个氨基酸。预测蛋白质二级结构主要由α螺旋与β片层组成,其次是无规则卷曲和β转角。通过DNAMAN软件比对发现,MaARF1与赤拟谷盗ARF1蛋白氨基酸序列完全一致,二者同源性为100%,且存在1个十四酰基化位点(G~2)和5个保守域(G_1 box—G_5 box)。通过RT-qPCR分析表明,MaARF1的表达量与松墨天牛的完全变态发育相关,各虫态不间断表达,幼虫期在2龄幼虫(L2)、5龄幼虫(L5)中表达量较高,蛹化期间(L5—P0)表达量表现为上升趋势,并在第2天蛹(P2)中达到最大值,羽化期间(P10—A0)表达量表现为下降趋势;MaARF1在不同温度胁迫下均有表达,低温与高温都会导致表达量下调,温度越高或越低,表达量下调越显著。因此,MaARF1可能主要影响松墨天牛蛹化和羽化这2个变态发育关键点,从而影响整个变态发育历程,同时其也可能参与了松墨天牛体内依赖温度的Ca~(2+)信号途径。     

赤拟谷盗章鱼胺受体3(TcOctβR3)cDNA克隆、表达及功能

【目的】章鱼胺信号系统在调节昆虫行为和生理过程中具有至关重要的作用。赤拟谷盗(Tribolium castaneum)作为一种模式昆虫,被广泛用于解析昆虫生长发育及生理等调控机制的研究工作。本研究以赤拟谷盗为对象,旨在明确章鱼胺受体在调节赤拟谷盗行为和生理方面的功能。【方法】根据Gen Bank登录的相关序列信息(XP_008198078),利用RT-PCR技术克隆赤拟谷盗章鱼胺受体基因Tc OctβR3的c DNA序列。利用在线生物信息学分析软件预测该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列以及跨膜结构域等信息,基于邻接法构建该基因与其他昆虫相关序列的系统发育树,明确系统进化关系。分别提取赤拟谷盗各发育阶段(卵、幼虫、蛹和成虫)、不同组织(中枢神经系统、脂肪体、中肠、后肠、马氏管、精巢和卵巢)以及饥饿胁迫后的RNA,以赤拟谷盗核糖体蛋白S3(Tc RPS3)为内参基因,采用实时定量PCR技术分析该基因在赤拟谷盗不同发育阶段、不同组织以及在饥饿胁迫下的表达模式。运用哺乳动物异源表达系统在人胚胎肾细胞HEK293中瞬时表达Tc OctβR3,进而利用第二信使c AMP含量测定技术分析Tc OctβR3与配体的结合能力。最后,通过体外合成赤拟谷盗Tc OctβR3的双链RNA,利用RNA干扰以及轨迹球行为分析等技术探究该基因的生理功能。【结果】序列分析结果表明,赤拟谷盗Tc OctβR3开放阅读框全长1 305 bp,编码434个氨基酸,序列中含有G蛋白偶联受体典型的7个跨膜结构域。基于邻接法构建的系统发育树表明,该基因编码的蛋白质与小蜂甲(Aethina tumida)的OctβR3亲缘关系最近。实时定量PCR分析结果表明,Tc OctβR3在赤拟谷盗各发育阶段均有表达,尤其在低龄幼虫期转录水平最高,而在其他发育阶段表达量无显著差异;在赤拟谷盗不同组织中,Tc OctβR3在中枢神经系统的表达量显著高于其他组织;赤拟谷盗幼虫在经饥饿处理24 h的过程中,Tc OctβR3的表达量呈先下降后上升的趋势,且在处理6 h的表达量最低,为对照的0.47倍,在16 h表达量最高,为对照的1.80倍,最后恢复到正常水平。通过HEK293细胞异源表达Tc OctβR3后,c AMP测定结果表明章鱼胺(OA)呈浓度依赖性地激活Tc OctβR3,其EC50为8.68×10-7 mol·L-1,萘甲唑啉(NA)的激动活性最高,其有效中浓度EC50为8.56×10-8 mol·L-1。4种供试生物胺激动剂活性强弱为:萘甲唑啉酪胺(TA)章鱼胺多巴胺(DA)。进一步采用RNA干扰技术的分析结果表明,注射ds RNA能有效抑制Tc OctβR3的表达,沉默效率高达61.5%,但干扰该基因表达后不会影响赤拟谷盗成虫的爬行速度和产卵量。【结论】Tc OctβR3在赤拟谷盗中枢神经系统可能发挥重要作用,能调节幼虫对饥饿胁迫的响应。明确了Tc OctβR3的分子生物学特性,可为将来以其为靶标筛选高效激动剂和抑制剂提供理论依据。     

松墨天牛葡萄糖-6-磷酸异构酶基因克隆及序列分析

[目的]克隆松墨天牛(Monochamus alteratus)葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)基因cDNA序列,探究其分子特征,为深入研究松墨天牛GPI的分子功能打下基础.[方法]采用RACE技术克隆松墨天牛GP基因cDNA序列,并对该序列及其编码氨基酸序列进行生物信息学分析.[结果]克隆并鉴定松墨天牛GPI基因,命名为MaGPI(GenBank登录号:KU323592),该基因序列长1038bp,共编码279个氨基酸.同源比对分析发现,松墨天牛与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的同源性最高,达90%,而与其他昆虫的同源性在76%以上.系统发育进化树分析结果表明,松墨天牛与赤拟谷盗在同一分支,与家蚕(Bombyx mori)相隔最远.MaGPI为亲水蛋白,含有5个功能位点:活性位点、变构位点、活性部位盖子和两个多肽结合位点.[结论]明确了MaGPI的核苷酸序列及编码蛋白特征,为进一步研究MaGPI的分子功能提供依据.     

丁香对赤拟谷盗蛹和成虫的致死作用

桃金娘科植物丁香Syzygium aromaticum可以作为药材、香料.研究了其干燥花蕾粉末对赤拟谷盗蛹和成虫的致死作用.结果表明:丁香对赤拟谷盗蛹羽化有明显的抑制作用,蛹因不能羽化而死亡;对赤拟谷盗成虫有致死作用并且致死时间随着赤拟谷盗成虫寿命的不同而不同;赤拟谷盗成虫的耐饥能力强.     

水菖蒲活性物质β-细辛醚对赤拟谷盗的熏蒸作用

为了确定水菖蒲活性成分β-细辛醚对赤拟谷盗的熏蒸效果,采用密封熏蒸方法测定了β-细辛醚对赤拟谷盗幼虫、蛹和成虫的熏蒸作用.结果表明:β-细辛醚对赤拟谷盗3种虫态均有一定的熏蒸作用,且对赤拟谷盗低龄幼虫的熏蒸效果要比高龄幼虫明显;当β-细辛醚熏蒸浓度为200μL/L时,熏蒸48 h后蛹的校正死亡率为34.32%;β-细辛醚对赤拟谷盗成虫熏蒸120 h后的LC50为116.48μL/L.     

丁香对赤拟谷盗蛹和成虫的致死作用

桃金娘科植物丁香Syzygium aromaticum可以作为药材、香料。研究了其干燥花蕾粉末对赤拟谷盗蛹和成虫的致死作用。结果表明：丁香对赤拟谷盗蛹羽化有明显的抑制作用,蛹因不能羽化而死亡;对赤拟谷盗成虫有致死作用并且致死时间随着赤拟谷盗成虫寿命的不同而不同;赤拟谷盗成虫的耐饥能力强。     

松墨天牛核糖体蛋白（RPS15A）cDNA的克隆及农药胁迫对其表达的影响

【目的】研究不同类型农药胁迫下松墨天牛核糖体蛋白基因表达的变化,为靶标防治松树重要害虫松墨天牛提供理论依据和参考。【方法】从构建的松墨天牛cDNA文库中获得表达序列标签(EST),用Blast程序从GenBank数据库中查找同源序列,克隆得到松墨天牛的一个核糖体蛋白基因;用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测11种农药胁迫下该基因的表达。【结果】从松墨天牛cDNA文库中获得1条EST序列与昆虫核糖体蛋白S15A(RPS15A)同源的基因,命名为MaRPS15A。MaRPS15AcDNA长504bp,含有5′、3′非编码区和长393bp的开放阅读框,编码130个氨基酸,预测的蛋白质分子质量为14.75ku,理论等电点为9.95。MaRPS15A与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)核糖体蛋白RPS15A的相似性为98%,与其他昆虫核糖体蛋白RPS15A的相似性大于88%。除溴氰菊酯外,其他农药胁迫导致MaRPS15A相对表达量下降。【结论】成功克隆了松墨天牛核糖体蛋白基因MaRPS15A(GenBank登录号:KJ930032)。大多数农药抑制了MaRPS15A的表达,表明松墨天牛受到了不利影响。     

11种杀虫剂对松墨天牛肌肉LIM蛋白基因表达的影响

松墨天牛（MonochamusalternatusHope）是松树的重要蛀干害虫,也是松材线虫（Bursaphelenchusxylophilus）的主要传播媒介。试验从松墨天牛文库中分离得到肌肉LIM蛋白基因的部分cDNA序列,长度为871 bp,命名为MaLIM（GenBank：KJ872589）;与赤拟谷盗（Tribolium castaneum）和家蚕（Bombyxmori）氨基酸相似性分别为77%和75%。用RT-qPCR测定了11种杀虫剂对MaLIM相对表达量的影响,结果表明,杀虫剂处理后MaLIM基因的表达量均有所下降,仅为对照的0.03~0.53。     

11种杀虫剂对松墨天牛肌肉LIM蛋白基因表达的影响

松墨天牛(MonochamusalternatusHope)是松树的重要蛀干害虫,也是松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)的主要传播媒介。试验从松墨天牛文库中分离得到肌肉LIM蛋白基因的部分cDNA序列,长度为871 bp,命名为MaLIM(GenBank:KJ872589);与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)和家蚕(Bombyxmori)氨基酸相似性分别为77%和75%。用RT-qPCR测定了11种杀虫剂对MaLIM相对表达量的影响,结果表明,杀虫剂处理后MaLIM基因的表达量均有所下降,仅为对照的0.03~0.53。     

花绒寄甲Prx6基因的确定和表达分析

【目的】获得花绒寄甲过氧化物还原酶6基因(Prx6),分析其在花绒寄甲发育和衰老过程中相对表达量的变化,以进一步揭示花绒寄甲衰老的分子机制。【方法】基于花绒寄甲成虫转录组数据库获得Prx6基因,并对其进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术,分析Prx6在花绒寄甲发育和衰老阶段的表达量。【结果】从花绒寄甲成虫转录组数据库中获取了2个Prx6基因,分别命名为Prx6-1和Prx6-2,其开放阅读框长度依次为654和672bp,分别编码218和224个氨基酸。多序列比对和系统发育分析表明,这2个基因均属于1-Cys家族,并且与鞘翅目的赤拟谷盗Prx6-1和Prx6-2的同源性最高,分别为71%和82%。发育阶段的定量结果表明,Prx6-1在2龄幼虫、蛹和初孵成虫体内的表达量较高,在6龄幼虫体内的表达量最低;Prx6-2在2龄和4龄幼虫体内表达量较高,在6龄幼虫体内表达量最低。在成虫衰老过程中,2个Prx6基因表达量整体上呈现出随羽化后时间的延长而增加的趋势。【结论】花绒寄甲Prx6基因影响其发育,特别是在2龄和6龄幼虫期。在花绒寄甲衰老过程中,2个Prx6基因的表达量随其羽化后时间的延长而升高。     

砂地柏精油的熏蒸杀虫活性初探

用砂地柏精油处理玉米象，赤拟谷盗，粘虫和小菜蛾的成虫或三龄幼虫。结果表明：砂地柏精油对上述４种试虫都有较强的熏蒸活性，且对鳞翅目的的粘虫和小采蛾三龄幼虫的熏蒸活性明显高于对鞘翅目的玉米象和赤拟谷盗成虫，对小菜蛾三龄幼虫的熏蒸活性最高，其毒力次序为小菜蛾〉粘虫〉赤拟谷盗〉玉米象。     

香料油作为潜在谷物保护剂

国立新加坡大学生物科学院S.H.HO和Y.Hauang报道。从肉豆蔻和大蒜提取的香料油对赤拟谷盗和玉米象进行生物活性的研究。从肉豆蔻种子和大蒜提取的香料油,对玉米象成虫以及赤拟谷盗成虫和幼虫具有毒力作用。对防治玉米象成虫、肉豆蔻油既有触杀也有重蒸作用,并且其防治效果要优于赤拟谷盗成虫。然而,大蒜油对赤拟谷盗成虫更具有毒杀作用。比较这两种香料油,虽然对防治玉米象成虫,肉豆蔻油要比大蒜油有效,但它不能像大蒜油那样去防治赤拟谷盗幼虫。同时,这两种香料油可减少赤拟谷盗卵的孵化;肉豆蔻油也能减少其幼虫的存活率。当食物用这两种香料油处理,玉米象和赤拟谷盗的第一代减少。进一步做营养试验表明,肉豆蔻油能抑制这两种仓虫的生长、取食和对食物的利用。     

4种植物精油对赤拟谷盗的控制作用研究

采用索氏提取法,以乙醚为提取溶剂提取大蒜、辣椒粉、柑桔皮、臭椿树皮的植物精油,研究其对赤拟谷盗的控制作用。结果表明:臭椿树皮、辣椒粉、大蒜3种植物精油对赤拟谷盗的成虫均有较强的驱避作用,柑桔皮精油对赤拟谷盗成虫具有一定的引诱作用;4种植物精油对赤拟谷盗成虫的触杀作用较弱;4种植物精油对赤拟谷盗当代种群均有一定的抑制作用,其作用大小顺序依次为柑桔皮精油>大蒜精油>臭椿树皮精油>辣椒粉精油;4种精油对赤拟谷盗成虫无明显的熏蒸作用,而对赤拟谷盗幼虫均有显著的熏蒸效果。     

松墨天牛肌钙蛋白T基因全长cDNA克隆及分析

采用c DNA末端快速扩增(RACE)方法获得了松墨天牛(Monochamus alternatus)肌钙蛋白T基因c DNA,全长1531bp,命名为Ma Tn T(Gen Bank:KJ756400).该基因开放阅读框(ORF)为1020 bp,编码339个氨基酸,等电点为9.26,推测的编码蛋白质分子质量为37.29 ku.同源比对结果表明:Ma Tn T与褐飞虱(Nilaparvata lugens)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)等12种昆虫肌钙蛋白氨基酸同源性为87%-88%;构建的系统发育树显示Ma Tn T处于独立分支;Ma Tn T没有信号肽和跨膜螺旋,属于亲水性氨基酸,二级结构包含了螺旋和不规则卷曲两种形式,含有丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)磷酸化位点数分别为8、9、3个.RT-q PCR检测表明,Ma Tn T基因在幼虫、蛹和成虫中均有表达;在成虫触角和足中表达量最高.     

黄粉甲翅芽生长因子基因的克隆及表达分析

翅芽生长因子(imaginal disc growth factor,IDGF)是一类调节昆虫发育和生长的因子。利用RACE克隆技术,克隆获得黄粉甲(Tenebrio molitor)IDGF基因,其c DNA序列长1 465 bp,开放阅读框为1 296 bp,可编码431个氨基酸,预测理论分子量为48.25 ku,等电点为7.63。氨基酸序列同源比对分析发现,黄粉甲IDGF与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)和蔗根非耳象(Diaprepes abbreviatus)的IDGF相似性分别为89%、71%。系统发育树分析表明,黄粉甲IDGF与赤拟谷盗IDGF进化关系最近。荧光定量PCR分析表明,在不同发育阶段,IDGF基因在幼虫1龄和2龄中的表达量明显高于其他发育阶段。在蛹期不同组织中,IDGF基因在脂肪体中的表达量最高。被管氏肿腿蜂(Scleroderma guani)寄生后,IDGF基因的转录水平未受影响,表明寄生不能调控该基因的转录表达。     

3种扁谷盗对不同波长光趋性研究

【目的】研究锈赤扁谷盗Cryptolestes ferrugineus成虫、土耳其扁谷盗Cryptolestes turcicus和长角扁谷盗Cryptolestes pusillus雌成虫对不同波长光的趋性。【方法】室内应用光行为反应装置测试3种扁谷盗羽化1、11、21和31日龄(雌)成虫对试验波长303、320、330、340、351、368、400、445、460、480、520、525、545、560、575和580 nm的趋光率。【结果】锈赤扁谷盗羽化1、11、21和31日龄成虫趋光率最高的刺激光波长分别为351、351、400、480 nm,对锈赤扁谷盗成虫诱集效果较好的光波长有351、400和445 nm,随着日龄的增加,对锈赤扁谷盗成虫诱集率大于20%的光波数增加;土耳其扁谷盗羽化1、11、21和31日龄趋光率分别为16%~51%、11%~46%、7%~37%和4%~28%,雌成虫趋光率最高的刺激光波长分别为351(368)、368、330和351 nm,对土耳其扁谷盗雌成虫诱集效果较好的光波长有368、351和303 nm;长角扁谷盗羽化1、11、21和31日龄趋光率分别为1.11%~75.56%、18.89%~70.00%、33.33%~62.22%和22.22%~71.11%,雌成虫趋光率最高的刺激光波长分别为575、320、400(445)和320(560)nm,对长角扁谷盗雌成虫诱集效果较好的光波长有320、575和330 nm。【结论】锈赤扁谷盗成虫的趋光性随着日龄的增加而增强,土耳其扁谷盗雌成虫的趋光性随着日龄的增加而下降,长角扁谷盗雌成虫的趋光性随着日龄的增加略为下降。     

拥挤度和光照条件对赤拟谷盗成虫逃逸行为的影响

【目的】研究赤拟谷盗成虫逃逸活动规律和赤拟谷盗种群控制方法。【方法】以赤拟谷盗成虫为研究对象,分析赤拟谷盗成虫逐日逃逸现象,研究拥挤度、光照条件对其逃逸行为的影响。【结果】全黑暗和自然光周期条件下,赤拟谷盗成虫的逐日逃逸数量与拥挤度呈正相关;拥挤度达到50头/皿以上时,赤拟谷盗成虫逃逸行为频繁,且黑暗条件下的逃逸数量显著小于光照条件。【结论】光照对赤拟谷盗成虫的逃逸行为具有刺激作用,拥挤度的增加,有助于成虫逃逸。