河南华溪蟹2种C型凝集素原核表达及多克隆抗体的制备

C型凝集素是一类模式识别受体蛋白,在先天性免疫中发挥重要作用。为了深入探明河南华溪蟹(Sinopotamon honanense)2种C型凝集Sh Lec21和Sh Lec23在先天性免疫中的作用,研究将Sh Lec21和Sh Lec23基因部分编码区序列连接至p GEX-4T-1,构建了重组表达载体p GEX-4T-1-Sh Lec21与p GEX-4T-1-Sh Lec23。随后将重组表达载体转至BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导,表达重组Sh Lec21-GST与Sh Lec23-GST融合蛋白并纯化。再以纯化蛋白作为抗原免疫日本大耳兔,第4次免疫后分离抗血清,并采用ELISA法检测抗体效价。结果显示,在28℃,0.2 mmol/L IPTG,诱导10 h条件下,可获得Sh Lec21-GST和Sh Lec23-GST重组融合蛋白以包涵体形式高效表达;制备的兔抗河南华溪蟹Sh Lec21-GST与Sh Lec23-GST多克隆抗体效价均在1∶100 000以上。研究成功对河南华溪蟹Sh Lec21与Sh Lec23进行了原核表达,首次制备了高效价的抗河南华溪蟹Sh Lec21与Sh Lec23多克隆抗体,为后续研究Sh Lec21与Sh Lec23基因在河南华溪蟹先天性免疫中的作用提供了有力的工具。     

恶性疟原虫3D7株AP核酸内切酶的原核表达及多克隆抗体的制备

为研究恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)3D7株AP核酸内切酶(AP endonuclease)的功能,通过PCR的方法扩增PF3D7_0305600(292~1 137 bp),构建克隆载体。测序正确后,将该片段插入到pET-28a和p GEX-4T-1,构建重组表达载体p ET-28a-Ae、p GEX-4T-1-Ae。将表达载体转入BL21-Codon Plus表达重组蛋白r-Ae-His和r-Ae-GST,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,r-Ae-His免疫家兔制备多克隆抗体,并用ELISA检测抗血清效价,Western blot检测抗体特异性。结果表明:表达的r-Ae-His分子量约为39 ku,r-Ae-GST分子量约为60 ku。制备的多克隆抗体能够特异性地识别天然蛋白,可用于恶性疟原虫3D7株AP核酸内切酶的后续研究。     

延边白鹅IFN-γ基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备抗延边白鹅IFN-γ蛋白的多克隆抗体,以已制备的pMD-IFN-γ质粒为模板,通过PCR扩增到延边白鹅IFN-γ基因,经TA克隆和BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切,将目的基因亚克隆至pGEX-4T-1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达,将经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确的重组蛋白用GST标签纯化试剂盒纯化,以纯化的重组蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体并进行ELISA检测。结果显示,成功构建了原核表达载体p GEXIFN-γ,表达的重组蛋白以包涵体形式存在,分子质量约为43 ku,制备的小鼠抗IFN-γ多克隆抗体效价为1∶16 000。     

恶性疟原虫肝素结合蛋白质PF3D7_1104400的原核表达与多克隆抗体的制备

为研究肝素结合蛋白质PF3D7_1104400的功能以及其作为疟疾疫苗候选抗原的可行性,通过PCR方法扩增目的基因,并将其与p ET-28a和p GEX-4T-1表达载体连接构建重组表达质粒。将构建成功的重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21-Condon Plus(DE3)-RIPL中诱导表达,利用亲和层析的方法纯化His-tag和GSTtag重组蛋白质。用His-tag重组蛋白质免疫家兔制备多克隆抗体,以该抗体为一抗,利用Western blot检测该抗体的特异性以及PF3D7_1104400蛋白质在虫体内是否表达。结果表明:成功构建重组表达质粒PF3D7_1104400-p ET和PF3D7_1104400-p GEX,诱导表达并纯化出特异性好、纯度高的重组蛋白。制备的多克隆抗体能够特异性识别虫体天然蛋白,PF3D7_1104400蛋白质在恶性疟原虫体内全长表达。     

猪肌生成抑制素功能区编码基因的原核表达与纯化

根据猪肌生成抑制素基因设计1对引物,PCR扩增出猪肌生成抑制素功能区编码基因片段,将该片段克隆至pGEM-T载体中。重组克隆质粒经序列分析,克隆序列与目的基因序列完全一致。重组克隆质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,目的基因片段克隆到表达质粒径pGEX-4T-1,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,融合蛋白占菌体可溶性总蛋白的18%以上。     

番鸭细小病毒VP3基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得针对番鸭细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体,根据已发表的该病毒基因序列设计一对引物,利用PCR扩增出VP3基因,将其克隆到原核表达载体p ET-32a,转化感受态细胞BL21(DE3)。经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测重组蛋白。将重组蛋白切胶免疫BALB/c小鼠,制备抗番鸭细小病毒部分结构蛋白的多克隆抗体。结果显示成功获得VP3基因,构建的原核表达重组质粒成功表达预期的重组蛋白,免疫小鼠获得的多克隆抗体能与番鸭细小病毒及VP3蛋白反应。表明制备的多克隆抗体可用于MDPV的检测,并为进一步研究MDPV奠定了基础。     

微小隐孢子虫Ⅰ型跨膜蛋白Cgd7_4560的亚细胞定位及其对HCT-8细胞的黏附特性

型跨膜蛋白在顶复门寄生虫入侵宿主细胞过程中发挥重要作用。试验对微小隐孢子虫Ⅰ型跨膜蛋白Cgd7_4560进行生物信息学分析,选取抗原性强的序列,采用PCR方法扩增出微小隐孢子虫DNA Cgd7_4560部分基因。将该片段分别连接到p ET-28a和p GEX-4T-1载体,构建重组表达质粒p ET-28a-Cgd7_4560和p GEX-Cgd7_4560,并将其转化到大肠埃希氏杆菌BL21 (Condon plus),IPTG诱导表达获得重组蛋白。SDSPAGE和Western blot分析,His标签重组蛋白为31 ku,GST标签重组蛋白为53 ku。用His标签重组蛋白免疫家兔,间接ELISA方法检测血清抗体效价达到1∶16 000,成功制备多克隆抗体。采用Western blot方法验证该抗体能够特异性的识别虫体天然蛋白,间接免疫荧光分析该蛋白在子孢子头端,间接ELISA结果表明GSTCgd7_4560能与HCT-8细胞黏附,为其功能研究奠定了基础。     

太平洋鳕抗冻基因AFP4的原核表达及多克隆抗体的制备

为进一步研究太平洋鳕Gadus macrocephalus抗冻蛋白AFP4的功能,通过RT-PCR方法克隆得到太平洋鳕4型抗冻蛋白基因(AFP4)的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建原核表达载体并优化表达条件,利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的效价,用Western-blot法分析重组蛋白的免疫原性。结果表明:AFP4基因编码区长度为375 bp,编码125个氨基酸;将AFP4基因的ORF与载体p ET-32a连接,构建重组体p ET-32a-AFP4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中;经诱导、表达和条件优化,发现该重组体在37℃、0.01 mmol/L IPTG条件下诱导3 h获得最大的表达量;对该重组蛋白进行纯化,利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测该抗体效价为1∶1 600 000;Western blot分析显示,重组蛋白可以与兔抗AFP4多克隆抗体发生特异性结合,表明该重组蛋白具有免疫原性。本研究结果可为深入研究太平洋鳕AFP4蛋白功能提供理论依据。     

鸡瘦素受体胞外域成熟肽重组蛋白质的表达以及多克隆抗体的制备

根据鸡瘦素受体基因(LEPR)编码区序列(Gen Bank:NM_AB033383)设计并合成2对引物,以鸡肝脏c DNA为模板扩增鸡LEPR胞外域2段c DNA序列。然后将这2段序列克隆到表达载体pRSET-A的Bam H I和Hind III酶切位点之间,构建重组表达载体(pR-LEPR1和pR-LEPR2)并转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。转化菌在IPTG诱导后分别表达了分子量为2.62×104的LEPR1和分子量为2.86×104的LEPR2重组蛋白质。经凝胶NiNTA纯化后的重组蛋白质与矿物油佐剂混合免疫生长鸡,经过3次免疫之后,获得高效价的抗LEPR1和抗LEPR2抗血清。     

三黄鸡STING胞外区基因克隆及原核表达

[目的]克隆鸡干扰素基因刺激蛋白(STING)胞外区基因并进行原核表达,为了解STING蛋白的生物学功能及探讨禽类的固有免疫机制打下基础.[方法]采用RT-PCR扩增鸡STING胞外区基因,与原核表达载体pGEX-4T-1连接构建重组表达质粒,再转化BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行12% SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析.[结果]三黄鸡STING胞外区基因全长951 bp,与原核表达载体pGEX-4T-1可成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-STING,转化BL21 (DE3)感受态细胞后经1.0 mmol/L IPTG诱导表达4h,12% SDS-PAGE电泳检测得到一个带GST标签约62 ku的融合蛋白,采用抗GST多克隆抗体进行Western blotting鉴定,约在62 ku处可见一条明显的蛋白印迹条带,表明目的蛋白原核表达正确,且特异性较高.[结论]从三黄鸡外周血淋巴细胞中克隆获得的STING胞外区基因片段可在原核细胞中高效表达,且纯化后的融合蛋白可用于制备鸡STING多克隆抗体.     

白桦BplMYB46转录因子的原核表达和重组蛋白的纯化

从白桦的转录组中发现一个MYB类转录因子Bpl MYB46,将其与拟南芥的MYB类转录因子进行氨基酸序列比对分析,并将其构建到原核表达载体p GEX-4T-2上,获得重组表达载体p GEX-4T-2-Bpl MYB46,然后导入原核表达菌株BL21中,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导重组蛋白的表达。结果显示:Bpl MYB46属于R2R3-MYB类转录因子;在IPTG终浓度为0.4 mmol/L,30℃条件下诱导4 h后p GEX-4T-2-Bpl MYB46原核蛋白表达量最高,主要为包涵体形式;利用尿素梯度透析法和电洗脱法纯化蛋白,发现电洗脱法成功获得浓度和纯度较高的重组蛋白。     

牛微小隐孢子虫子孢子表面抗原p23基因的克隆及原核表达

从已构建的牛微小隐孢子虫子孢子cDNA文库中,用PCR方法扩增出子孢子表面抗原p23基因,将其插入到编码谷胱肽转移酶(GST)的质粒(pGEX-4T-2)多克隆位点,构建原核表达载体pGEX-p23。重组质粒经EcoRI/Sal I酶切、测序鉴定后转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达蛋白。结果成功构建了pGEX-p23原核表达载体,经IPTG诱导,转化的大肠杆菌表达出分子质量为47kDa的GST融合蛋白,且该蛋白能与抗p23抗体发生特异性结合反应。本研究为进一步研究p23的生物学功能和临床应用奠定了基础。     

烟草H2A的序列分析、原核表达载体构建及诱导表达

[目的]对H2A进行序列分析及蛋白结构域分析,并将其克隆入p GEX4T-1原核表达载体进行诱导表达。[方法]以p GADT7-Rec-H2A质粒为模板,通过PCR扩增烟草H2A(3~140 Aa),将其插入原核表达载体p GEX-4T-1中,并将重组载体转入BL21(DE3)中,诱导其表达。[结果]构建了烟草H2A基因全长和p GEX4T-1载体大片段连接的融合表达载体,并成功地诱导其表达。[结论]该研究为运用Pull Down确定Nt Tkr与候选蛋白之间的体外互作进而确定Nt Tkr与蛋白互作的关键结构域奠定了试验基础。     

鸭瘟病毒UL6基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备鼠抗鸭瘟病毒(DPV)UL6基因的多克隆抗体,采用PCR方法扩增出UL6基因,连接原核表达载体p ET-32a(+),构建表达质粒p ET-UL6,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃经1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况,将目的蛋白免疫Balb/c小鼠,利用ELISA方法检测特异性抗体效价。结果显示,构建的原核表达质粒经IPTG诱导能正确表达,且表达的重组蛋白能与DPV阳性血清反应,制备的多克隆抗体效价可达1∶16 000。表明,制备的多克隆抗体具有良好的免疫原性,可以用于UL6基因的表达检测。     

猪流产衣原体CP/12株omp-1基因的克隆与表达

为观察重组MOMP蛋白的免疫活性，揭示omp-1基因(编码MOMP蛋白)在猪流产衣原体诊断和防治中的作用，用PCR法扩增猪流产衣原体omp-1基因，将特异性扩增片段克隆入pMD18-T载体，测序比较分析序列后确认为目的基因，与GenBank中4株流产衣原体omp-1基因和氮基酸序列的相似性均达99％，与其他各型衣原体代表株的相似性为71％～88％，氨基酸序列也有较大差异。将omp-1基因亚克隆到pET-32a表达载体上，再对重组表达载体转化BL21(DE3)表达宿主菌，以IPTG诱导该重组菌，结果显示该重组菌表达了融合蛋白；用猪流产衣原体多克隆抗体对表达的重组MOMP蛋白进行Western blot试验，结果显示该重组MOMP蛋白具有结合特异性抗体的活性。     

植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆及原核表达

根据Gen Bank中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)基因组序列设计引物,利用PCR技术扩增了植物乳杆菌QL-14的谷氨酸脱羧酶编码基因gad B,克隆至表达载体p GEX-4T-3,转化大肠杆菌(Escherichia coli)后进行原核表达,对表达条件进行了优化并对表达蛋白质进了纯化。结果表明,扩增目的gad B基因的开放阅读框(ORF)全长1 407 bp,编码469个氨基酸,氨基酸序列与植物乳杆菌WCFS1同源性为99.6%。通过优化诱导表达条件,得到纯化蛋白质GAD大小为53.6 ku,等电点为5.58,比活力为9.9 U/mg。     

单增李斯特菌Hly基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得单增李斯特菌溶血素(Listeriolysiono,LLO)蛋白及其多克隆抗体。根据单增李斯特菌溶血素蛋白的基因Hly序列设计了一对特异性引物,扩增出Hly基因,克隆入原核表达载体p ET-32a,并转化于大肠杆菌BL21中,在诱导剂IPTG的作用下重组LLO蛋白成功表达。SDS-PAGE结果表明重组蛋白分子量约为69.3 ku,且主要以包涵体形式表达LLO蛋白。将重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,获得兔抗LLO抗体。Western-blot检测到一条约69.3 ku的特异性条带,表明该抗体具有较强的特异性。单增李斯特菌溶血素基因Hly在大肠杆菌中已成功表达,且制备的多克隆抗体可用于LLO蛋白的检测。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7toxB基因的分片段克隆和表达

根据Gen Bank已有tox B基因全长序列,分别设计6对引物扩增tox B基因,克隆到质粒p GEX-4T-1,构建重组菌BL21(plys)(p GEX-4T-1-tox B),IPTG诱导表达重组蛋白质,用Western blot鉴定重组蛋白质免疫原性。tox B基因片段大小分别为1 531 bp、1 590 bp、1 609 bp、1 603 bp、1 525 bp和1 690 bp,重组蛋白质分子量分别为8.1×104、8.3×104、8.4×104、8.3×104、8.0×104和8.7×104。以兔源EHEC O157∶H7抗血清为一抗,Western blot分析结果显示6个重组蛋白质均具有良好的免疫原性。     

大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因设计引物,PCR扩增得到MCP基因编码框全长序列1 392 bp,将其克隆到原核表达载体p ET-32a中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-MCP,并在大肠杆菌BL21中得到了表达,融合表达的重组蛋白分子量约为70 ku,与预期大小一致,主要以包涵体的形式存在。对IPTG浓度,诱导温度等诱导表达条件进行优化,确定0.5 mmol/L的IPTG于37℃的条件下诱导6 h重组蛋白的表达量最佳。纯化GSIVMCP重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了GSIV-MCP多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000。Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接荧光免疫结果表明,该多克隆抗体可与由GSIV感染引起细胞病变的EPC细胞(GICB)发生特异性的结合。研究为建立GSIV免疫诊断方法以及为研究GSIV MCP基因编码蛋白的功能奠定了前期基础。     

牛eIF5基因原核表达与蛋白纯化

研究应用PCR方法扩增牛e IF5基因编码序列,通过Eco RⅠ和SalⅠ酶切位点将其定向插入p GEX-4T-1载体,构建原核表达重组质粒p GEX-4T-1-e IF5,并转化大肠埃希菌BL21。酶切和测序鉴定正确后,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)大量诱导表达,利用GST-Sepharose 4B亲和珠纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定。结果表明,原核表达载体p GEX-4T-1-e IF5构建成功,Western Blot证实融合蛋白大量表达,纯化后获得GSTe IF5融合蛋白,为深入研究牛e IF5蛋白功能奠定基础。