玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63nsdAmgh基因的验证

玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63是分离自马铃薯疮痂病自然衰退土壤中的一株拮抗菌。该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)等多种重要的植物病原真菌都具有较强的抑制作用。nsdA(negative regulator of Streptomyces differentiation)基因是从天蓝色链霉菌中发现的与抗生素合成相关的负调控基因。根据天蓝色链霉菌A3(2)的序列设计引物,PCR扩增出Men-myco-93-63nsdAmgh基因,经斑点杂交法验证,nsdAmgh确实在该生防菌中存在。该基因的发现有助于进一步了解该生防菌产生抗生素调节的分子机制,也为抗生素高产菌株的获得提供了新的靶标。     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗逆性的初步研究

通过平板培养测定菌落形成单位数(cfu值),研究玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63的抗逆性。结果表明:菌株在pH 5~11范围内均可生长,pH 6~9为适宜菌株生长的范围;该菌株有较强的耐盐性,0.4%~0.8%NaCl对菌株的生长有一定的促进作用;40℃和50℃处理10~60 min对孢子的存活影响较小,55℃处理30~60min和60℃处理10~60 min对孢子的存活影响较大;玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63与80%多菌灵、10%吡虫啉相容性较好,两种农药对菌株的EC50分别为2.31 mg/mL和8.82 mg/mL,而菌株与70%甲基托布津、4.5%高效氯氰菊酯和10%苯醚甲环唑相容性较差,EC50分别为0.25、0.10、0.86 mg/mL。     

玫瑰黄链霉菌Men myco 93 63固体发酵培养基的优化

研究玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63固体发酵培养基优化条件。采用单因素试验筛选的适宜得到固体基质为硅藻土,m(硅藻土)∶V(种子液)=2∶1,对菌落形成单位数有影响的因素为葡萄糖、蛋白胨、复合维生素和复合微量元素。在此基础上,通过响应面法对4个因素的组合进行优化,优化后这4个因素的质量分数最佳组合为葡萄糖2.2%、蛋白胨0.7%、复合维生素1.0‰、复合微量元素1×10-5。在此条件下,菌落形成单位数有了很大提高,达到1.7×108cfu/g。     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63有效成分的初步提取与纯化

为了解玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63的代谢产物和其生物活性,对该菌株进行摇瓶培养,从菌丝中提取到一种对棉花黄萎病菌有明显抑制作用的有效成分。经过XAD-1600型大孔吸附树脂,ODS C18硅胶中压柱分离得到黄白色粉末。HPLC检测后,初步断定该物质是一类非常相似的物质组成的混合物,并且极有可能具备互变异构的特性。     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63原生质体形成 和再生条件的初探

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63在温室及大田试验中都对棉花黄萎病菌表现出很强的拮抗作用,是一株很有应用潜力的生防菌株。不论是菌丝体本身还是其代谢产物都对多种植物病原菌有很强的抑制作用。对该生防菌株进行深入研究,尤其是分子水平的研究尤为重要。笔者通过研究影响链霉菌原生质体形成的多种条件和因素,包括培养基的选择、培养时间、甘氨酸浓度、溶菌酶浓度、酶解时间等,最终成功的制备出了生防菌Men-myco-93-63的原生质体,初步确定了其形成条件:TSB培养基一级培养24h,用SGGP作为二级培养基培养菌丝体40h(补加甘氨酸2%),将菌丝体加入2mg/ml溶菌酶37℃水浴60min后即可得到原生质体,涂在再生培养基R5上再生培养,再生数可达4.8×106个/ml。为该生防菌原生质体的转化、基因表达等研究奠定了重要的基础。     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中3个调控基因的检测

玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63及其发酵液对多种重要植物病原菌均表现出很强的抑制作用,在植物病害生物防治方面有很大的应用潜力。根据天蓝色链霉菌A3(2)调控基因tcrA、sarA和scrX序列设计引物,扩增Men-myco-93-63基因组DNA,分别获得705bp、1 472bp和473bp的片段,经测序和比对,上述片段与天蓝色链霉菌A3(2)的tcrA、sarA和scrX基因在核苷酸序列和氨基酸序列上同源性均为99%,因此,推测玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中很可能含有这些调控基因。Men-myco-93-63中这3个调控基因的初步检测为玫瑰黄链霉菌功能基因的获得、菌株的遗传改良和代谢调控途径的研究提供了重要依据。     

生防菌株Men-myco-93-63发酵培养基优化条件的研究

研究了碳源、氮源和无机盐对玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63发酵的影响,并用正交的方法优化了发酵培养基配方。最适碳源为葡萄糖和淀粉组合;最适氮源为花生饼粉和玉米浆组合;试验的8种无机盐中KH2PO4、CaCO3、NaCl为可提高发酵单位的3种无机盐。正交试验优化后确定的发酵培养基的配方为葡萄糖2.4%,淀粉0.8%,花生饼粉1.5%,玉米浆0.8%,KH2PO40.02%,NaCl 0.4%,CaCO30.3%,为大规模发酵生产奠定了基础。     

生防链霉菌Men-myco-93-63遗传转化体系的建立和优化*

玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63是分离自马铃薯疮痂病(S.scabies)自然衰退土壤中的一株拮抗菌.该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、瓜类白粉病菌(Sphaerotheca fuziginea Poll.)等多种重要的植物病原菌具有很强的抑制作用,有良好的生防应用潜力.为了对玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中一些功能基因进行研究,得到高产抗生素的工程菌株,首先应对该菌的遗传转化条件进行优化.作者分别以基因整合型质粒pSET152和基因破坏型质pKC1139为出发质粒,ET12567(PUZ8002,pSET152/pKC1139)为供体,Men-myco-93-63孢子和菌丝体为受体,选取MS、PDA、TSB琼脂培养基、燕麦培养基为不同的培养基进行接合转移试验.结果表明MS培养基为接合转移的最适培养基,经验证,已成功地将质粒pSET152/pKC1139转入到了Men-myco-93-63中.以孢子为受体时,孢子预萌发条件为50℃热激10 min,37℃温育2.5 h,转化效率是10-7～10-6.以菌丝体为受体时,转化效率是10-7～10-6,但菌丝培养过程中容易出现污染.另外,抗生素的覆盖时间对接合转移效率的影响较明显,16～18 h覆盖效果最好.     

玫瑰黄链霉菌Men myco 93 63抗南方根结线虫相关酶活性及其防效

根据雌虫会阴花纹特征将采集地河北省定州市西南合村黄瓜棚的根结线虫鉴定为南方根结线虫,并研究对多种植物病原菌具有较强抑制作用的玫瑰黄链霉菌Men myco 93 63对南方根结线虫的防效及其产生的与防治线虫相关的酶。结果表明,Men myco 93 63发酵液对根结线虫二龄幼虫的校正致死率达到100%,粗酶液对线虫的校正致死率达到94.87%。Men myco 93 63具有较强的胶原蛋白酶产生能力,也可产生丝氨酸蛋白酶和蛋白酶,发酵液中蛋白酶的活力达到473.363 7 U/mL。推测胶原蛋白酶、蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等酶类在该生防菌对南方根结线虫的防治中起重要作用。温室盆栽试验结果表明,玫瑰黄链霉菌Men myco 93 63发酵液及其固体发酵物对根结线虫均有防效;其中,发酵液5倍稀释液对根结线虫的防效最好,达到39.99%。     

生防链霉菌Men-myco-93-63nsdBmgh基因的克隆及序列分析

为了获得生防链霉菌Men-myco-93-63中nsdB基因,根据天蓝色链霉菌A3(2)负调控基因nsdB序列设计引物,扩增Men-myco-93-63基因组DNA,获得1 121 bp的片段,经NPA-PCR对其两端进行延伸,拼接后得到2 073 bp的全长序列,命名为nsd Bmgh.经Southern杂交验证,该...     

拮抗链霉菌Men-myco-93-63及其发酵液对棉花黄萎病菌生长的影响

本研究采用抑菌圈法和菌落生长法测定桔抗链霉菌 Ｍ ｅｎ－ｍｙｃｏ－ ９３－ ６３（５２３）及其发酵液对棉花黄萎病菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）Ｔ－９和河北省强致病力菌株Ｖ－ｈ菌体生长的影响。结果表明：链霉菌Ｍｅｎ－ｍｙｃｏ－９３－６３及其发酵液对棉花黄萎病菌菌体具有强烈的抑制作用,明显降低了棉花黄萎菌的生长量。同时发现,拮抗链霉菌及其发酵液对不同致病菌株表现不同的抑菌效果;Ｍｅｎ－ｍｙｃｏ－９３－６３发酵稀释液可使Ｖ．ｄａｈｌｉａｅ出现融菌现象。     

响应面法优化小链霉菌产抗生素发酵条件

利用响应面法对分离于大连海域的番茄溃疡病生防菌株小链霉菌(Streptomycete parvus)PH33菌株产抗生素的发酵条件进行优化。首先通过二水平设计的Plackett-Burman试验分析7种因素中对小链霉菌产抗生素能力影响最主要的3种;然后运用爬坡路径法对这3种因子进行试验,获得这3种重要因子的最适范围。最后通过响应面分析得到3种重要影响因子的相互作用及最优条件。最终条件为发酵温度30.97℃、初始pH值6.91、每250mL三角瓶装液量101.08mL。优化后抑菌圈直径由29mm提高到38mm,提高31.03%。结果表明,数理统计试验设计和分析的方法可成功地用于小链霉菌产抗生素发酵条件优化且效果显著。     

木霉菌发酵培养基响应面优化

为了优化木霉菌YHWG5102发酵培养基,以对水稻纹枯病的抑菌圈直径大小为优化的指标,在单因素试验的基础上进行Plackett-Burman试验和中心组合试验设计,采用响应面法建立发酵培养基的优化模型。结果表明,得到最优培养基配方:23.44 g/L葡萄糖、26.07 g/L玉米浆、0.81 g/L K2HPO4。经试验验证,在此培养基条件下,木霉菌YHWG5102抑菌圈直径达27.19 mm,比优化前提高约42%。     

玫瑰孢链霉菌NRRL11379产达托霉素前体物A21978C的发酵培养基优化

[目的]对玫瑰孢链霉菌NRRL 11379进行发酵培养基优化,寻找产物A21978C较好的发酵培养基配方。[方法]从16种发酵培养基中筛选较好的培养基,通过单因子试验和正交试验进行优化。[结果]得到玫瑰孢链霉菌NRRL 11379产达托霉素前体物A21978C组分的最佳发酵培养基为:葡萄糖1%、可溶性淀粉4%、黄豆粉1%(、NH4)2SO40.3%、MOPS 6%、K2SO40.8%、NaCl 0.1%。[结论]优化后的产量约为60 mg/L,比优化前提高9.2倍。     

链霉菌702产抑真菌物质发酵培养基优化及动力学研究

用响应面分析方法对链霉菌702产抑真菌物质发酵培养基成分进行了优化研究,并对优化后链霉菌发酵动力学进行了分析。通过优化得到玉米淀粉和蛋白胨的最适浓度分别为16.83 g/L、8.64 g/L,在优化后的培养基中链霉菌702产抑真菌物质效价达到1214.52μg/ml,比优化前789.41μg/ml提高了53.85%。动力学分析表明,所选动力学模型能较好地反映链霉菌702合成抑真菌物质的发酵过程,链霉菌702发酵产抑真菌物质过程属于部分偶联型。     

黄麻链霉菌NF0919菌株发酵培养基的优化

以黄麻链霉菌(Streptomyces corchorusii)NF0919菌株发酵液对草莓炭疽病菌(Glomerella cingulata)的抑菌率为效价指标。通过单因素试验筛选出NF0919菌株发酵用最佳的碳源、无机盐和氮源,在此基础之上,再通过正交试验和二次通用旋转组合设计试验,对NF0919菌株发酵培养基进行优化。结果表明:与发酵初始培养基相比,优化后得到的最佳培养基发酵液对草莓炭疽病菌的相对毒力效价提高了13.77倍。筛选得到的最佳发酵培养基组成为:10.2%马铃薯淀粉、2.6%棉籽蛋白、0.1%CaCO3、0.05%K2HPO4、0.05%MgSO4。     

玫瑰黄链霉菌活性代谢产物诱导黄瓜白粉病抗性

为研究玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活性代谢产物RM对黄瓜幼苗的诱导抗病性,通过筛选不同浓度RM对黄瓜白粉病的防效,得出最佳诱导抗性浓度;采用试剂盒对RM诱导后接种白粉病菌的黄瓜幼苗进行防御酶活性以及活性氧含量变化情况的检测。试验结果表明,RM对黄瓜白粉病的最佳诱抗浓度为100 mg/L,施用RM后过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性提高,过氧化氢(H_2O_2)含量升高。     

响应面法优化链霉菌702产抑真菌物质生料发酵培养基

用响应面分析方法对链霉菌702产抑真菌物质生料发酵培养基进行了研究。实验首先利用部分重复因子试验筛选出链霉菌702发酵产抑真菌物质的关键因素为玉米淀粉和蛋白胨,其次利用最陡爬坡试验逼近最大响应区,最后利用中心组合设计及响应曲面分析确定关键因素的最佳浓度。通过优化得到玉米淀粉和蛋白胨的最适浓度分别为16.83 g/L、8.64 g/L,在优化后的培养基中链霉菌702产抑真菌物质效价达到1 214.52μg/mL,比优化前789.41μg/mL提高了53.85%。     

白色链霉菌产ε-聚赖氨酸发酵条件优化研究

通过各单因素试验并结合正交试验分析,结果确定白色链霉菌最佳产ε-聚赖氨酸条件为葡萄糖5%、硫酸铵1.5%、酵母膏0.7%、初始pH6.8、接种量10%、发酵温度30℃和发酵时间72h,在该条件下所得的发酵液中ε-聚赖氨酸含量达0.60g/L。     

产转谷氨酰胺酶茂源链霉菌的诱变育种及发酵培养基优化

研究了茂源链霉菌在不同条件下的产转谷氨酰胺酶特性。结果表明:茂源链霉菌的最适产酶温度为32℃,最适pH为7.5。通过紫外诱变茂源链霉菌的转谷氨酰胺酶产量提高了36.8%。茂源链霉菌可利用还原性淀粉作为发酵碳源,将淀粉转化为葡萄糖,葡萄糖的液相色谱图出峰时间为6.9 min。采用玉米秸秆作为发酵产转谷氨酰胺酶的碳源,产量虽不及高氏1号培养基,但转谷氨酰胺酶的产量较为理想。