抗Cry1F毒素单链抗体的筛选及初步应用

对扩增的Tomlinson I噬菌体抗体库进行3轮特异性富集,挑取单菌落,采用ELISA、PCR及测序比对分析鉴定阳性噬菌体单链抗体(sc Fv);以宿主替换的方式将阳性噬菌体sc Fv基因导入Escherichia coli HB2151中进行可溶性表达,sc Fv过柱纯化后,建立针对Cry1 F毒素的IC-ELISA检测方法。以Cry1 B、Cry1 C、Cry1 Ab、Cry1 Ac作为竞争抑制物,分析sc Fv的特异性,以Cry1 F毒素在玉米中的添加回收试验评价检测方法的实用性。结果显示,从第3轮富集库中筛选到了11株具有Cry1F毒素结合活性的噬菌体sc Fv菌株,经PCR鉴定都含有目的条带,对其中2株(H1、G9)进行测序,证实为人源化的sc Fv。选取G9号阳性噬菌体sc Fv进行可溶性表达,纯化后收集到的sc Fv浓度为256μg/ml。建立的IC-ELISA检测方法检测灵敏度(IC10)为5.99 ng/ml,抑制中浓度(IC50)为0.410μg/ml,线性检测范围(IC20~IC80)为0.107~0.713μg/ml。sc Fv(G9)对Cry1B、Cry1C具有一定结合活性,交叉反应率分别达到了20.92%和15.59%,但不识别Cry1Ab和Cry1Ac,交叉反应率均低于0.1%。添加回收试验结果表明,基于sc Fv(G9)建立的IC-ELISA检测方法稳定性和重复性都比较好。     

Cry2A毒素抗独特型单链抗体库的构建

为了降低苏云金杆菌Cry2A毒素的免疫检测成本,开发廉价、无毒试剂盒,采用整体抗体免疫和噬菌体展示技术的路线,设计和构建了Cry2A抗独特型单链抗体库。以Protein A纯化的Cry2A兔多克隆抗体为免疫原,对雌性Balb/c系小鼠进行了免疫。在优化的包被原浓度下,用ELISA法测定小鼠血清效价及抗独特型抗体组分。选取效价最高的小鼠,取脾脏提取总RNA,RT-PCR法合成c DNA第一链。设计简并引物,利用PCR法扩增小鼠VH、Vκ基因,再用SOE-PCR法进行单链抗体基因的拼接。SOE-PCR产物和p IT2载体经双酶切后连接,电转入感受态E.Coli. TG1完成建库,并用多克隆噬菌体ELISA对抗体库与免疫原的结合能力进行了鉴定。结果表明,免疫鼠血清的效价在1∶1.6×105到1∶6.4×105倍之间。免疫鼠血清可对Cry2A与其兔多克隆抗体的结合最高可产生17. 6%的抑制,证明Ab2β和Ab2γ型抗独特型抗体的存在。最终构建了库容为1.2×107的Cry2A抗独特型单链抗体库,该抗体库与免疫原的结合信号/背景比值为6. 04。     

胰腺癌人源噬菌体单链抗体库的构建及初步筛选

提取胰腺癌患者的外周淋巴细胞总RNA,以RT-PCR技术分别扩增出人源抗体H链和L链的可变区基因,采用SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成scFv片段,然后将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,并电转化至感受态TG1菌,经辅助噬菌体M13K07拯救,获得胰腺癌人源噬菌体单链抗体库。结果表明,从外周血淋巴细胞中获取可变区基因,利用噬菌体抗体库技术制备人源抗胰腺癌单链抗体的策略是可行的。     

抗鸡传染性支气管炎病毒单链抗体间接ELISA筛选方法的建立

建立一种筛选特异性单链抗体的间接ELISA优化方法.用鸡传染性支气管炎病毒IBV-M41株接种SPF鸡胚,纯化后作为抗原包被96孔板进行间接ELISA,从本实验室构建的原核表达质粒pOPE101-XPscFv/JM109(DE3)中筛选出针对IBV-M41株的scFv,并对各反应参数进行探索,优化筛选方法.通过敏感性实...     

抗O型口蹄疫病毒猪源单链抗体的筛选

为获得抗O型口蹄疫病毒(FMDV)高亲和力猪源单链抗体(scFv),建立抗原抗体(Ag-Ab)共表达细菌展示文库,抗原为FMDV结构蛋白VP1、抗体为高免猪抗体文库。采用细菌展示与流式细胞术结合方法,筛选出14株抗FMDV的scFv。将筛选获得scFv构建至pET28a载体中,经E. coli Rosetta表达,目的蛋白长度约为30ku,与scFv分子质量相符。Western blot结果表明,14株scFv均可与VP1特异性结合。ELISA结果表明,14株scFv均可与灭活O型FMDV特异性结合。应用共表达细菌展示技术,可避免抗原制备,简化操作流程,适用范围广泛;应用流式细胞仪筛选抗体库,可实现准确、快速、高通量筛选。抗FMDV猪源scFv研究可填补同源基因工程抗体空白,为进一步筛选中和抗体奠定基础。     

基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定

【目的】通过设计并优化生物素-亲和素标记磁珠筛选策略,建立针对Cry1Ac毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法,为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法,经过4轮筛选后,对每轮筛选后抗Cry1Ac毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定,通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Cry1Ac的阳性克隆,并对其进行PCR鉴定和DNA测序,确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。利用纯化后的scFv-A12作为“捕获抗体”,Anti-Cry1Ac兔多克隆抗体作为“检测抗体”,建立针对Cry1Ac的双抗夹心ELISA检测方法。【结果】以生物素化的Cry1Ac蛋白为包被原,利用噬菌体抗体库对其进行了4轮液相筛选。结果显示,相对产出率随着筛选轮数的增加而提高,第4轮较第1轮提高了42倍;单克隆噬菌体ELISA鉴定抗Cry1Ac噬菌体抗体,以试验孔OD450/阴性孔 OD450大于2.1为阳性标准,从第4轮筛选后的培养皿中随机挑选了300个菌落,经单克隆ELISA鉴定出6个阳性克隆,分别命名为hsCry1Ac-C5、hsCry1Ac-D8、hsCry1Ac-C12、hsCry1Ac-A12、hsCry1Ac-F9和hsCry1Ac-F4。其中,hsCry1Ac-A12具有相对较高的亲和力。对上述6个阳性克隆进行菌液PCR检测发现,在935 bp处均有明显的目的条带,通过对其进行测序和氨基酸序列比对,最终得到4株不同氨基酸序列的阳性克隆。hsCry1Ac-A12在成功替换宿主菌HB2151后,经1 mmol•L-1 IPTG诱导表达,于30℃条件下培养过夜。其表达产物经His Trap HP镍亲和柱纯化后SDS-PAGE检测,hsCry1Ac-A12蛋白分子量约为30 kD。通过方阵滴定对抗体浓度进行优化后,利用单链抗体为“捕获抗体”,多抗为“检测抗体”,建立了Cry1Ac双抗夹心ELISA检测方法。在1.25-2.43 μg•mL-1线性检测范围内,线性回归方程为Y=0.2522X+1.2832(R2=0.9564),检测限为1.08 ng•mL-1。【结论】利用磁珠液相筛选方法,建立了针对Cry1Ac毒素的双抗夹心ELISA检测方法,为快速、准确检测转基因食品中Cry1Ac提供了一种新的检测模式。     

抗苏云金芽孢杆菌Cry1B毒蛋白质单链抗体的筛选与鉴定

利用人源化噬菌体抗体库筛选抗Bt Cry1B毒蛋白质的单链抗体(Single-chain antibodies,scFv)。将扩增后的噬菌体抗体库与固相化包被的Cry1B毒蛋白质特异性结合,经4轮"吸附-洗脱-扩增"后,富集特异性识别Cry1B毒蛋白质的噬菌体单链抗体。从最后一轮筛选中随机挑取单菌落进行单克隆ELISA鉴定,对阳性克隆进行PCR扩增、DNA电泳鉴定及测序,成功筛选获得8个阳性噬菌体scFvs,经鉴定均有完整外源基因片段插入。挑取阳性值最高的scFv(1E2)建立了基于单链抗体的Cry1B毒蛋白质间接竞争ELISA检测方法。结果表明,Cry1B毒蛋白质对噬菌体scFv(1E2)的抑制中浓度(IC50)为1.075μg/ml,最低检测限(IC10)为0.013 4μg/ml,线性检测范围在0.5μg/ml至4.0μg/ml之间。     

Cry2Aa毒素结合十二肽的筛选与鉴定

利用Cry2Aa毒素蛋白对噬菌体展示随机十二肽库进行4轮筛选,并从第4轮筛选产物中随机挑选20个单克隆,进行单克隆ELISA、PCR扩增、DNA电泳及测序,鉴定这些克隆与Cry2Aa毒素的结合活性。结果显示,这20个克隆均能与Cry2Aa毒素发生特异性结合,并推导出8条不同的序列。挑取阳性值最高的克隆GT(氨基酸序列为GTPWHHHRHLIV)建立了基于十二肽的Cry2Aa毒蛋白的间接竞争ELISA检测方法。该方法的抑制中浓度(IC50)为1.139 0μg/ml,最低检测限IC10为0.021 1μg/ml,线性检测范围为0.047 8~22.691 0μg/ml(Y=23.09 lgx+48.692,R2=0.996 3)。噬菌体展示肽库筛选方法为快速、准确地检测Cry2 Aa毒蛋白提供了新的途径。     

抗红斑丹毒丝菌的rSpaA蛋白猪源单链抗体库构建及单链抗体淘选

从免疫过rSpaA的猪的脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT–PCR技术反转录合成cDNA。设计兼并引物扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片段,采用重叠延伸PCR方法,将VH和VL通过Linker连接成重组单链抗体(以下简写为sc Fv)的基因片段。将sc Fv的基因连接至噬菌粒载体p Comb3Xss,将重组载体电转化至宿主菌XL1-Blue,并经辅助噬菌体M13KO7拯救,获得猪源噬菌体单链抗体库,库容约为2.5×106。以rSpaA为靶抗原,经免疫亲和筛选,获得8株特异性较好的阳性克隆。本研究结果可为制备抗红斑丹毒丝菌的重组sc Fv提供新途径,并为猪丹毒的免疫检测和综合防制提供材料基础。     

抗速灭威噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定

以速灭威抗原免疫的小鼠为实验对象,取其脾细胞,RT-PCR扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,重叠延伸PCR拼接单链抗体(ScFv)基因,克隆入噬菌粒表达载体pCANTAB5E并转化大肠杆菌TG1,成功构建了库容约7.6×105的抗速灭威噬菌体ScFv库。对该文库进行了5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集筛选,获得了6个特异性较强的抗速灭威噬菌体ScFv阳性克隆。其研究结果为速灭威特异性抗体的大量制备奠定了一定的基础。     

Cry2Aa毒素对小菜蛾的杀虫机理

为研究苏云金杆菌Cry2Aa毒素的生物活性及杀虫机理,先利用浸叶法测定了商品化的Cry2Aa毒素对小菜蛾的杀虫活性,并用石蜡包埋切片后进行免疫组化分析,再用ELISA法测定了Cry2Aa毒素与小菜蛾刷状缘膜囊泡(BBMV)的结合曲线,最后通过Ligand blot法和肽指纹质谱对小菜蛾BBMV与Cry2Aa毒素的结合蛋白进行了分离与鉴定。结果表明,Cry2Aa毒素对小菜蛾的半数致死浓度(LC_(50))为27.90μg/ml。Cry2Aa毒素与小菜蛾中肠上皮细胞存在结合,与小菜蛾BBMV的表观结合亲和力为266.6 nmol/L。小菜蛾BBMV与Cry2Aa毒素存在5条主要结合条带,其中分子量2.45×10~5上方的主结合条带酶解后得到ATYSEGPNGSVR片段,通过数据库比对分析,匹配到一个分子量为3.32×10~5的小菜蛾未鉴定蛋白,其功能注释为脂质运载蛋白。     

苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白的体外表达及纯化

根据大肠杆菌密码子偏好性对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cry2Aa基因进行优化,并合成全长基因,将cry2Aa基因克隆到表达载体pET-44a上,转化到大肠杆菌Rosetta中进行诱导表达,优化表达条件,采用亲和层析和SDS-PAGE胶回收纯化,Western blot鉴定回收产物.结果表明,IPTG浓度为0.50 mmol/L、27℃诱导4h时Cry2Aa蛋白表达量最高,SDS-PAGE胶回收Cry2Aa纯化蛋白所得的产量高于亲和层析法.     

Protein A磁珠检测朊病毒方法的建立

建立Protein A磁珠法检测朊病毒,将朊病毒抗体IH2包被后的Protein A磁珠与蛋白酶K消化过的攻毒小鼠脑组织匀浆液混合,经免疫沉淀缓冲液温和洗脱杂蛋白,再经0.2M甘氨酸将目的蛋白洗脱并且利用聚丙酰胺凝胶电泳检测。通过聚丙酰胺凝胶电泳检测出25KD的目的蛋白带,经与正常未消化的朊蛋白条带相比较,证实检测出朊病毒。Protein A磁珠具有高效特异的与抗体IgG结合的特点,与多克隆抗体混合后可有效结合IgG。该方法较免疫组织化学和Western-blot技术简便快速,且磁珠可以回收再使用,使成本低廉。     

检测犬源狂犬病毒中和抗体ELISA方法的建立

为了有效监测犬免疫狂犬病疫苗后的保护效力,以狂犬病毒(Rabies virus,RV)糖蛋白的主要优势抗原表位区G3蛋白(RV G3)作为包被抗原,建立了一种检测狂犬病毒中和抗体效价的间接ELISA方法.通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量为8 mg/L,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的稀释度为1∶3 000.特异性试验表明,该抗原不与犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬细小病毒阳性血清发生交叉反应;批内和批间重复性试验的平均变异系数都小于10%;敏感性达1∶1 280.此方法检测134份血清样品的结果与美国SYNBIOTICS试剂盒相比,总符合率达95.6%.     

间接ELISA检测抗犬瘟热病毒抗体方法的建立

以大肠杆菌表达的犬瘟热病毒(CDV)重组核蛋白(GST-NP)经纯化后作为包被抗原,通过方阵ELISA滴定确定GST-NP的适宜包被浓度为1.31 μg·mL-1,并由此建立检测抗CDV抗体的间接ELISA方法.通过对已知抗CDV阳性血清及抗其他病毒血清的试验,表明所建立的间接ELISA可特异检测动物血清中的抗CDV抗体.另外,通过不同样品的重复试验以及不同批次的检测试验,证明该方法在用于检测CDV抗体时具有很好的重复性和稳定性.     

抗苦马豆素抗体ELISA检测方法的建立

【目的】建立一种敏感性高、特异性强的抗苦马豆素(Swainsonine,SW)抗体的ELISA检测方法。【方法】用SW人工抗原(SW-BSA)免疫小鼠,制备抗SW血清,通过ELISA法进行血清抗SW抗体效价检测,比较以SW-OVA或SW为包被抗原的检测结果,分析包被抗原浓度、封闭剂等对测定结果的影响,以确定测定的最佳条件。【结果】以SW-OVA为包被抗原的检测结果明显优于以SW为包被抗原;抗苦马豆素抗体的最佳测定条件为:以1.0μg/mL SW-OVA作为包被抗原,于4℃包被过夜或37℃包被2 h,选用15 g/L的明胶作为封闭剂,酶标抗体的工作浓度为1∶1 500。【结论】建立的抗苦马豆素抗体ELISA检测方法,特异性强、稳定性高,为进一步研究苦马豆素人工抗原的免疫原性等奠定了基础。     

基于磁珠和时间分辨荧光免疫分析的微囊藻毒素LR单链抗体筛选与鉴定

【目的】从鼠源合成噬菌体抗体库中,快速分离获得微囊藻毒素LR单链抗体。【方法】采用磁珠筛选和负筛选方法,设计两轮微囊藻毒素LR单链抗体的筛选方案。用噬菌体产出投入比和多克隆噬菌体免疫分析,对每轮筛选后微囊藻毒素LR特异性噬菌体的富集效果进行鉴定。再将第2轮筛选获得的次级库提取单链抗体基因,转入可溶性表达载体;诱导表达后,采用时间分辨荧光免疫法,对单个噬菌体克隆鉴定并测序。【结果】两轮筛选的噬菌体产出投入比分别为4.8×10-8和2.88×10-6。第2轮筛选后的次级库,经多克隆噬菌体免疫分析得到的荧光信噪比,比原始抗体库提高了22.8倍。最终鉴定得到5株不同的阳性噬菌体克隆,其中最佳的克隆对微囊藻毒素LR的检测灵敏度（IC10）为13 ng•mL-1,抑制中浓度（IC50）为435 ng•mL-1,线性范围在31—5 952 ng•mL-1。【结论】本研究筛选到的单链抗体,有潜力应用于微囊藻毒素LR的免疫学检测或免疫亲和柱的制备,同时也探索了一种高效的微囊藻毒素LR单链抗体的库筛选、鉴定方法。     

鸡源黄病毒卵黄抗体间接ELISA检测方法的建立

为在检测产蛋鸡黄病毒抗体水平过程中减少应激,以鸡源黄病毒FQ-C1株为包被抗原,建立检测鸡源黄病毒卵黄抗体的间接ELISA方法.确定的优化条件是包被抗原浓度为5.7 ng·μL-1,卵黄抗体以1∶160倍稀释,羊抗鸡IgG酶标抗体以1∶3 200稀释.经特异性、敏感性检验表明该方法特异性强、敏感性高,适合于产蛋鸡免疫后的抗体检测.     

抗犬细小病毒单链抗体库构建及其亲和力检测

为获得高亲和力抗犬细小病毒单链抗体,构建抗犬细小病毒(CPV)细菌展示单链抗体文库。研究提取犬脾脏总RNA,反转录c DNA,以此为模板,分别扩增犬抗体VH和VL编码序列,插入克隆载体p Tlinker。利用SfiⅠ酶切位点将sc Fv基因构建至细菌展示载体p BSD中,将重组质粒电转化入E.coli DH5α构建p BFD-sc Fv细菌展示库。通过标记FITC的VP2蛋白,利用流式细胞术筛选12株阳性sc Fv。将12株sc Fv基因分别插入p ET-28a,构建重组表达质粒p ET28a-sc Fv。转化到E.coli Rosetta中诱导表达,获得约28 ku目的蛋白。经ELISA检测,纯化sc Fv对VP2蛋白P/N值均大于2.1,其中sc Fv-23、sc Fv-33、sc Fv-34对VP2蛋白亲和力较强。研究通过免疫本动物源动物,在获得高价抗体同时,避免传统单克隆抗体的免疫排斥现象;结合流式细胞术和细菌展示技术可对单链抗体文库高效、快速筛选。抗犬细小病毒同源单链抗体研究在填补市场同源基因工程抗体空白的同时,可为研制具有中和活性全长抗体奠定基础。     

抗恩诺沙星噬菌体单链抗体库的构建及鉴定

本研究以兽药恩诺沙星为对象,构建噬菌体抗体库,为低成本、快速制备目的抗体提供新的途径。以恩诺沙星-鸡卵清蛋白(ENR-OVA)为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫,取其脾细胞提取总RNA,并分别扩增全套抗体轻、重链基因,通过重叠延伸PCR技术,以编码柔性多肽(Gly3Ser)4的基因为接头,将轻重链基因组装为完整的scFv基因,将之克隆入pCANTAB5E载体,转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体M13KO7对其进行超感染,构建噬菌体抗体库并进行富集、筛选和鉴定;构建了库容量约为2.2×106的抗恩诺沙星噬菌体单链抗体库,并筛选出26株阳性克隆,为表达单链抗体、建立免疫检测方法奠定基础。