白羽半番肉鸭坦布苏病毒的分离鉴定及结构蛋白基因分析

自肝脏表现不规则出血的白羽半番肉鸭脏器中分离获得1株病毒(命名为ZZ40株),经(RT-)PCR检测为鸭坦布苏病毒,可被鸭坦布苏病毒高免阳性血清特异性中和。应用鸭坦布苏病毒特异性引物从该株病毒基因组中成功获得结构蛋白基因片段,该片段与近年来我国分离的禽源坦布苏病毒株核酸序列同源性均在99.1%以上,而与蚊媒源坦布苏病毒MM-1775株同源性仅为88.6%;分子进化分析表明该株病毒与BYD-1等近年来的鸭坦布苏病毒分离株共处于一个进化分支。以上结果表明,我国白羽半番肉鸭存在坦布苏病毒感染,且该分离毒株的抗原性与我国早期分离于种(蛋)鸭的坦布苏病毒差异不明显。     

1例雏鸭坦布苏病毒病的诊断

[目的]分析雏鸭发病原因,为临床上诊断雏鸭坦布苏病毒病提供依据。[方法]通过对发病雏鸭进行疫情调查,将采集的病料进行病毒分离,对采集的病料和分离的鸡胚尿囊液进行RT—PCR鉴定。[结果]对病料和鸡胚尿囊液进行鸭坦布苏病毒RT-PCR检测结果均呈阳性。[结论]分离的病毒是鸭坦布苏病毒,此次雏鸭发病的原因是鸭坦布苏病毒感染。     

鸭坦布苏病毒江西分离株全基因组序列分析

为了解江西省鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)的遗传变异情况,对2013年江西省某蛋鸭场分离获得的1株鸭坦布苏病毒(命名为YF株)进行基因组分子特征及遗传进化分析。序列分析表明,该株病毒基因组全长10 990nt,未出现核苷酸插入或缺失及基因重组的变异情况,与已报道的DTMUV分离株的核苷酸同源性均在98.5%以上,且亲缘关系与当前鸭群中优势病毒亚群非常近。以上结果表明,近年来江西鸭群中流行的鸭坦布苏病毒遗传比较稳定,未发生变异。     

鸭坦布苏病毒病、鸭圆环病毒病与鸭疫里默氏杆菌混合感染的诊断

为确诊贵州省三穗县某鸭场62日龄花边鸭发病原因,通过临床症状观察及对采集的10只病鸭进行病理剖检、细菌分离鉴定、病毒PCR/RT-PCR检测。结果表明：分离到4株鸭疫里默氏杆菌,对头孢类药物高度敏感,对大环内酯类和氨基糖苷类药物耐药;通过病毒特异性引物扩增出鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒条带。该鸭场病鸭由鸭坦布苏病毒、鸭圆环病毒和鸭疫里默氏杆菌混合感染所致。     

鸭坦布苏病毒病、鸭圆环病毒病与鸭疫里默氏杆菌混合感染的诊断

为确诊贵州省三穗县某鸭场62日龄花边鸭发病原因,通过临床症状观察及对采集的10只病鸭进行病理剖检、细菌分离鉴定和病毒PCR/RT-PCR检测。结果表明:分离到4株鸭疫里默氏杆菌,对头孢类药物高度敏感,对大环内酯类和氨基糖苷类药物耐药;病毒特异性引物扩增出鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒条带。该鸭场病鸭由鸭坦布苏病毒、鸭圆环病毒和鸭疫里默氏杆菌混合感染所致。     

鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定与基因变异分析

[目的]2012年10月徐州地区某鸭场的樱桃谷种鸭突然发生产蛋下降,疑似鸭坦布苏病毒病.为了确诊病因,本试验进行了剖检与病原的分离鉴定.[方法]将病料匀浆处理后尿囊腔接种SPF鸡胚,分离病毒,接种BHK细胞培养,应用RT-PCR扩增病毒全基因,测序并进行基因进化分析.[结果]分离到一株鸭坦布苏病毒,命名为DTMUV XZ-2012株.该病毒株能适应鸡胚,无血凝活性,在BHK-21细胞上第5代的病毒滴度为5×104 PFU·mL-1.测序结果表明该病毒株基因组全长为10 990 nt,编码的多聚蛋白含3 426个氨基酸.DTMUV XZ-2012株与BYD株、YY5株和JS_2010株等分离株的全基因同源性为98.5％ ～99.3％.与最早分离的BYD株等相比,XZ-2012株的基因变异主要分布于E基因、NS1基因、NS2基因和NS5基因,提示该病毒在自然界的流行存在一定的免疫压力.[结论]本试验成功分离鉴定了一株鸭坦布苏病毒,为鸭坦布苏病毒候选疫苗株的筛选及病毒分子流行病学研究提供了参考信息.     

一株鸭坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

2010年我国爆发了使蛋鸭产蛋量急剧下降、由一种鸭黄病毒引起的疾病,通过对来自山东某发病鸭场的病料进行分离,得到实验室分离株Du/CH/LSD/110128。对其进行全基因组序列测定分析,确定该株病毒全基因组含有一个开放阅读框,编码一个由3 426个氨基酸组成的多聚蛋白。将试验测得株Du/CH/LSD/110128株与黄热病毒(Yellow fever virus)、登革热病毒(Dengue virus)、伊利乌斯脑炎病毒(Ilheus virus)、西尼罗病毒(West Nilevirus)、巴格扎病毒(Bagaza virus)和其他一些已公布序列的坦布苏病毒进行核酸同源性比较和遗传进化树分析,发现Du/CH/LSD/110128株与巴格扎病毒亲缘关系较近但介于病毒种的水平上,与其他株坦布苏病毒核酸同源性在87%以上,可以确定Du/CH/LSD/110128株属于新型鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus)。     

鸭坦布苏病毒江门株的分离鉴定及其E基因系统进化分析

从2011年江门新会区某养鸭场产蛋下降鸭群中分离出1株鸭坦布苏病毒,命名为JM株。经RT-PCR检测、透射电镜形态学观察及动物回归试验,证明该病毒是引起该场蛋鸭群产蛋下降的病原。对该病毒E基因进行序列对比、进化分析后发现,JM株与我国华东地区最早发生的鸭坦布苏病毒亲缘关系最近,核苷酸相似性达99.1%以上,表明该病毒可能来自华东地区。     

鸡源坦布苏病毒（SN01株）的分离与鉴定

采用SPF鸡胚与vero细胞传代接种法,从江苏某蛋鸡场临床表现为产蛋下降、卵泡萎缩、全身多器官出血为主要特征的发病鸡肝脏、卵巢病料组织中分离一株病毒。该分离毒不能凝集鸡和鹅红细胞, 并对乙醚、氯仿敏感;病毒核酸为RNA;PCR结果排除了分离毒为禽流感病毒、新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒;用坦布苏病毒特异引物扩增为阳性, 序列测定与分析结果显示分离毒与GenBank上登录和实验室保存的坦布苏病毒E基因序列同源性在99%以上。上述结果表明分离毒（SN01）可能是一种新的坦布苏病毒,属于黄病毒科坦布苏病毒属,暂称为鸡源坦布苏病毒。     

鹅源坦布苏病毒SHYG株的分离与鉴定

【目的】分离鹅源坦布苏病毒,并研究其对雏鹅的致病性。【方法】用RT-PCR方法对江苏省3个鹅场送检的产蛋期病鹅样品进行检测;对坦布苏病毒核酸阳性的样品进行病毒分离,测定分离病毒的生物学特性和E蛋白基因序列。【结果】这些样品中坦布苏病毒呈阳性;从病料中分离鉴定一株病毒,命名为SHYG。E蛋白基因序列同源性比对显示其与中国鸭源坦布苏病毒同源性达到99.3%;生物学特性研究表明该病毒可致Vero细胞病变,对小鼠无致病性,接种2周龄雏鹅出现精神沉郁、腹泻、神经症状甚至死亡;组织学变化可见肝脏淤血、胆小管扩张、脂肪变性;肺淤血、炎性渗出及含铁血黄素沉着,脾脏网状内皮细胞空泡化,肾出血,脑充血、胶质细胞增生。【结论】坦布苏病毒SHYG株对雏鹅有较强的致病性。     

种番鸭源禽坦布苏病毒分离鉴定及基因组序列分析

种番鸭是否感染禽坦布苏病毒颇受国内学者关注。本研究于国内外首次自表现产蛋下降的种番鸭卵巢中分离获得1株病毒（命名为WYZLJ-1359株）,经RT-PCR方法鉴定为禽坦布苏病毒。经比较分析该病毒与我国其他禽源分离株全基因组序列表明,种番鸭源分离株WYZLJ-1359主要分子特征未出现变异,与2010年以来我国分离的其他禽源分离毒株的核苷酸序列同源性均在98.4％以上,且亲缘关系非常近,遗传距离均在1.8％以下,远低于与2000年以前分离的坦布苏病毒分离株之间的遗传距离。以上结果表明,我国禽坦布苏病毒感染的宿主在不断增加,但病毒在不同品种家禽的传播过程中遗传较为稳定,基因组未出现基因的缺失或插入等变异现象。     

中国农科院成功研制“鸭坦布苏病毒病活疫苗”

近日,中国农业科学院上海兽医研究所科研人员率先从发病鸭场分离鉴定出引起雏鸭高热、食欲不振、生长迟缓、产蛋率下降乃至停止新发鸭传染病的病原,将之命名为“坦布苏病毒（ Tembusu vi＿rus,TMU灾）”,并成功研制出“鸭坦布苏病毒病活疫苗（ FX2010—180p株）”。     

鸭坦布苏病毒囊膜 E蛋白的原核表达

利用 RT-PCR 方法扩增鸭坦布苏病毒分离株（WR 株）全长 E 蛋白基因,克隆到 pEASY-T3载体中,经Bam HI和XhoI酶切后将目的片段连接入pET-32a载体,构建原核表达重组质粒pET-E。表达质粒转化入感受态细胞 BL21（DE3）后,经IPTG 诱导后表达出鸭坦布苏病毒 E 蛋白,并以包涵体的形式存在,Western-blotting试验呈阳性,表明 E蛋白有很好的反应原性。     

鸭坦布苏病毒与新城疫混合感染的分离鉴定

鉴于上海某鸭场成年种鸭出现产蛋率下降、死亡率升高的现象,为有效解决此问题,通过鸭/鸡胚接种,进行了血凝及血凝抑制实验,对分离的病毒进行了鉴定,最终基本确诊为鸭新城疫和鸭坦布苏病毒混合感染,其发病原因是由于新城疫病毒引起鸭群抵抗力下降,导致并发坦布苏病毒感染。     

鸽源鸭甲肝病毒1型的分离与鉴定

为对1株鸽源鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)进行分离与鉴定,通过细菌分离排除法和病毒分离方法获得致鸭胚死亡病毒(暂命名为FJ-12-20株)。该病毒无血凝活性,可被DHAV-1引物所扩增,但不能被鸭坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒和鹅细小病毒特异引物所扩增,病毒液攻击樱桃谷鸭和番鸭可引起死亡,并出现了典型的鸭肝炎病变,重新分离获得病毒株。将DHAV-1特异性扩增产物回收后克隆,序列分析表明FJ-12-20株与参考株DHAV-1的同源率为93.5%～99%,与DHAV-2和DHAV-3参考株的同源率均为78.4%。遗传进化分析表明FJ-12-20株与DHAV-1关系密切,它们在进化树中共处一分支。     

鸭瘟病毒的分离与初步鉴定

采集疑似鸭瘟病毒自然感染的病死番鸭的肝脾等组织,应用番鸭胚成纤维细胞(MDEF)进行病毒分离,通过对分离毒的血凝特性(HA)测定、间接免疫荧光试验(IFA)荧光定量PCR、PCR产物测序和动物回归试验等初步鉴定。结果显示:通过MDEF从疑似病料中分离到4株病毒(DPVfj1、DPVfj2、DPVfj3、DPVfj4),均不能凝集鸽红细胞;IFA结果排除了分离毒为鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭副粘病毒和禽坦布苏病毒;鸭瘟病毒荧光PCR试剂盒检测分离毒核酸均为鸭瘟阳性;鸭瘟病毒(JQ673560)gJ蛋白基因序列特异引物进行PCR扩增均为阳性,且PCR产物序列与鸭瘟病毒参考株gJ蛋白基因序列相似度均大于99%;动物回归试验显示,分离毒人工感染30日龄番鸭和同居感染5日龄雏番鸭均可复制出与自然感染一致的临床表现及病理变化,并能回收到病毒。上述结果表明4株分离毒均为鸭瘟病毒强毒株。     

坦布苏病毒感染诱导雏鸭体内未折叠蛋白反应

[目的]检测坦布苏病毒在雏鸭体内诱导未折叠蛋白反应的信号通路(PERK、IRE1和ATF6),为揭示坦布苏病毒致病机制提供理论基础.[方法]取1日龄SPF雏鸭,腹腔接种坦布苏病毒(JS804株),于接种后12、24、36和48 h从对照组和攻毒组各取5只剖杀,分别取肝脏、心脏和脑组织,利用组织总RNA提取试剂盒提取各个...     

安徽农业大学王桂军教授课题组首次在我国鹅群中发现新型鸭坦布苏病毒变异株

正鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus, DTMUV)自2010年在我国首次报道以来,已迅速传遍我国各大水禽养殖地区,给水禽养殖业带来重大经济损失。鸭坦布苏病毒在多年来不断发生变异,给防治带来困难。近日,安徽农业大学王桂军教授课题组一项研究发现一种新型的强毒力鸭坦布苏病毒在我国出现,并首次在雏鹅中传播。王桂军教授课题组在临床研究中发现感染鸭坦布苏病毒的鹅群表现出明显的神经症状。     

鸭胚成纤维细胞上坦布苏病毒受体蛋白的鉴定

[目的]拓展对坦布苏病毒受体的认知,为研究其在鸭体内的感染机制打下基础.[方法]取9日龄SPF鸭胚制备鸭胚成纤维细胞(DEF),待细胞长成单层后提取DEF膜蛋白,利用免疫共沉淀试验筛选出DEF膜蛋白中可与坦布苏病毒结合的蛋白,经病毒辅覆蛋白结合分析(VOPBA)验证后通过LC-MSMS质谱分析进行鉴定;同时人工合成鸭热休克蛋白70基因(HSP70)序列的开放阅读框(1905 bp),构建重组质粒pET32a-HSP70并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,以重组蛋白免疫小鼠制备抗鸭HSP70血清,与DEF细胞共孵育后接种坦布苏病毒,并采用实时荧光定量PCR检测抗血清对病毒感染的抑制作用.[结果]DEF膜蛋白中分子量约70 kD的蛋白可与坦布苏病毒结合,经LC-MSMS质谱分析和序列比对可确定该蛋白即为鸭热休克蛋白70(HSP70).含重组质粒pET32a-HSP70的BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导4 h后,SDS-PAGE检测发现在分子量约85 kD处出现目的蛋白条带,获得的重组鸭HSP70蛋白主要以包涵体形式进行表达,且能与His标签抗体发生特异性反应.以重组鸭HSP70蛋白免疫小鼠获得的抗鸭HSP70血清可封闭DEF细胞上的HSP70,而竞争性抑制坦布苏病毒感染.[结论]HSP70是坦布苏病毒感染DEF细胞的受体,可作为新的靶点用于抗坦布苏病毒药物设计.     

一种引起种(蛋)鸭产蛋骤降新病毒的分离与初步鉴定

自表现产蛋骤降的病死种鸭中无菌采集卵巢以番鸭胚分离到病毒,经对分离的病毒(WR株)进行形态学观察、理化特性测定,发现该病毒有囊膜,直径为30～50nm;对氯仿处理敏感;在pH值为7.2条件下,不凝集鸡、鸭和鹅红细胞。人工感染开产麻鸭能复制出与自然感染病例相同的临床症状和病理变化,并能回收到病毒。应用RT PCR技术对分离毒进行检测,可扩增到约1kb特异性条带。经测序分析表明,所获得的核苷酸序列第9-777位与坦布苏病毒(TMUV)的同源性最高,为88.7%;遗传进化分析表明WR株病毒与坦布苏病毒、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、以色列火鸡脑膜炎病毒(ITV)、恩塔亚病毒(NTAV)具有相似的祖先,但在系统发生树上处于单独的进化分支。由此推测,WR株病毒不属于现有黄病毒科黄病毒属任何一种,为黄病毒属中的新成员,为国内外首次报道。