禽腺联病毒Rep基因在昆虫细胞中的表达

根据禽腺联病毒Rep基因序列设计2对引物,分别扩增出Rep78和Rep52基因,将其克隆至杆状病毒双表达载体pFastBacDual,获得重组穿梭质粒pFastBacDual-Rep,将其转化到E.coli DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组病毒表达质粒rBacmid-Rep。在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-Rep。SDS-PAGE结果分析表明,Rep78、Rep52均获得了表达,Western blot结果显示表达的重组蛋白能够与Rep52多抗反应,具有良好的反应原性。结论:禽腺联病毒的非结构蛋白Rep78、Rep52基因在昆虫细胞中获得了成功表达。     

禽腺联病毒VP基因在昆虫细胞中的表达

为同时在昆虫细胞中按照合适比例表达禽腺联病毒的3个结构蛋白质,首先根据禽腺联病毒VP基因序列设计引物,扩增VP基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转移载体pFastBac-VP,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-VP,在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-VP。SDS-PAGE结果分析表明,3个结构蛋白质VP1、VP2和VP3均获得了表达,分子量正确,且比例为1∶1∶10。Western blot结果显示,表达的重组蛋白质能够与VP3多抗反应。以上结果说明禽腺联病毒的3个结构蛋白质均在昆虫细胞中获得了成功表达。     

J亚群禽白血病病毒SUJ及兔IgGFc基因在腺病毒表达系统中的融合表达

为获得J亚群禽白血病病毒(ALV-J)囊膜蛋白gp85和兔IgGFc的融合蛋白,通过腺病毒表达系统融合表达ALV-J SUJ和兔IgGFc(r IgGFc)基因。将pc DNA3.1-SUJ-r IgGFc用XhoⅠ、KpnⅠ进行双酶切,获得SUJ-r IgGFc基因,将其克隆至p Shuttle-CMV质粒,构建穿梭载体p Shuttle-CMV-SUJ-r IgGFc,重组质粒转化含p Adeasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞,获得重组腺病毒质粒p Ad-SUJ-r IgGFc,最后转染人293T细胞。表达的融合蛋白可被ALV-J单克隆抗体JE9以及羊抗兔IgG识别,重组蛋白的分子量大小约9.5×104,且与JE9及羊抗兔IgG都有很好的反应性;免疫共沉淀试验结果显示融合蛋白可与DF1细胞膜蛋白混合物反应并获得差异蛋白。该融合蛋白可与ALV-J宿主细胞蛋白发生特异性反应。     

番鸭细小病毒VP3基因在昆虫细胞中的表达与鉴定

为使番鸭细小病毒VP3基因在昆虫细胞中正确表达,根据已发表的该病毒的VP3基因序列设计1对引物。以PCR方法扩增VP3基因;构建转移载体p Fast Bac1-VP3,转化DH10Bac感受态细胞,得到重组Bacmid DNA;转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒r Bac-VP3。通过间接免疫荧光、Western-blot试验、SDS-PAGE分析目的片段在昆虫细胞中的表达情况。成功构建了转移载体p Fast Bac1-VP3,获得重组杆状病毒r Bac-VP3,VP3基因在杆状病毒表达系统中成功表达,得到大小约58 ku的蛋白。     

口蹄疫病毒VP31基因在昆虫细胞中的表达

研究了口蹄疫病毒(FMDV)VP31基因在昆虫细胞中的表达.结果表明:利用重组杆状病毒在昆虫细胞中成功表达了AsiaⅠ型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP31基因,目的基因经亚克隆插入到含有一段蜂毒溶血肽序列的转移载体pMelBac B中,构建出穿梭质粒pMel-VP31.将含有目的基因的穿梭载体与线性化的杆状病毒骨架共转染昆虫Sf9细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.重组病毒经扩增后感染Sf9细胞,用Western-blot和间接夹心ELISA检测,证实VP31蛋白获得了表达.     

蛋鸡J亚群禽白血病病毒gp85基因遗传进化分析

为了解福建省蛋鸡J亚型禽白血病病毒(ALV-J)的遗传进化关系,对来自福建省蛋鸡场发病蛋鸡中分离鉴定的3株ALV-J的gp85基因进行克隆与测序,并与国内外18株ALV-J参考株的基因序列进行分析。结果表明:3株蛋鸡分离株的gp85基因与亚群2的国内蛋鸡分离株(CL09DP02、GL09DP01和HuB09JY03)以及原型株HPRS-103的亲缘关系较近,达97.8%~99.6%,表明福建省蛋鸡ALV-J株很可能与国内部分蛋鸡ALV-J分离株有着共同的来源。     

tva受体基因起始密码子突变对鸡感染A亚群禽白血病病毒的影响

【目的】探索tva受体基因起始密码子突变(tva c.3G>A)对鸡感染A亚群禽白血病病毒(Avian leukemia virus subgroup A, ALV-A)的影响。【方法】利用Sanger测序和RT-PCR验证我国黄羽肉鸡存在tva c.3G>A突变。利用流式细胞术检测tva c.3G>A突变对鸡体外感染RCASBP(A)-GFP荧光报告病毒的影响。通过ALV-A体内攻毒试验,探究tva c.3G>A突变对鸡体内感染ALV-A的影响。利用直接测序方法对我国黄羽肉鸡品系tva c.3G>A突变位点进行基因分型。【结果】Sanger测序和RT-PCR结果鉴定我国黄羽肉鸡品系tva基因编码区第3位碱基由G突变为A,该突变引起tva基因起始密码子序列由ATG突变为ATA。流式细胞术检测结果显示野生型tva c.3G/G鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast, CEF)对RCASBP(A)-GFP易感,纯合突变型tva c.3A/A CEF抗RCASBP(A)-GFP感染,表明tva c.3G>A突变导致鸡体外抗RCA...     

高致病性血清4型禽腺病毒hexon基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

为获得杆状病毒表达的重组高致病性血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAd V-4)六邻体蛋白(Hexon),本研究通过PCR从高致病性血清4型禽腺病毒基因组中扩增到hexon基因,克隆到杆状病毒转移载体p Fast Bac-1,获得重组转移质粒p Fast Bac-hexon,将其转化DH10Bac大肠杆菌并筛选,获得重组杆状病毒穿梭质粒r Bacmid-hexon,将重组杆状病毒穿梭质粒转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒r BV-hexon。间接免疫荧光试验和免疫印迹试验结果显示,Sf9细胞中的Hexon蛋白能够与血清4型禽腺病毒阳性血清发生特异性反应,蛋白质分子量约110 000,表明Hexon蛋白在Sf9细胞中获得良好的表达。     

草鸡J亚群禽白血病病毒的PCR检测

通过对GenBank发表的ALV的基因序列的分析,针对J型ALV保守区设计并合成1对特异性引物。通过对反应条件的优化,确定了检测ALV的PCR检测方法,对来源于江苏地区不同草鸡养殖基地的10份病料组织样本提取DNA进行PCR扩增。结果对疑似J亚群ALV病料和正常鸡肝脏组织的病原核酸检出率分别为90%和0,同时将扩增的目的基因进行克隆测序,并与GenBank中的参考毒株进行比较,结果表明目的基因片段序列长300 bp左右,与参考毒株核苷酸序列同源性为97%以上。试验表明,江苏地区草鸡群中确实存在J亚群鸡白血病病毒感染的情况。     

禽呼肠孤病毒σ3基因在烟草中的表达与鉴定

【目的】研究禽呼肠孤病毒S1基因编码的σ3基因在烟草中的表达及其表达产物的反应原性。【方法】根据Gen Bank中公布的禽呼肠孤毒株S1133的基因序列,设计特异引物扩增σ3基因,构建重组植物表达载体p BI121-σ3,热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞,筛选含有重组质粒的p BI121-σ3的阳性工程菌株EHA105。采用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草,卡那霉素筛选获得抗性植株。随后通过σ3基因的特异引物,PCR方法初步筛选获得转σ3基因的烟草植株。进一步对阳性植株通过实时荧光定量PCR方法检测σ3基因在转基因烟草中的拷贝数,以烟草自身单拷贝的内源基因核糖核酸还原酶-RNR2作为内参基因,通过梯度稀释分别构建RNR2及σ3基因的起始模板量和对应CT值的标准曲线,通过检测样品中σ3基因和RNR2基因模板量对数值的比值估算出σ3基因在转基因烟草中的拷贝数。并通过Western-blotting方法对转基因烟草中表达的σ3融合蛋白的反应原性进行分析。【结果】1通过双酶切和测序验证表明σ3基因插入位置、大小和读码框均正确,表明σ3基因已经成功的构建于植物表达载体p BI121的花椰菜花叶病毒(Ca MV)35S启动子的下游,以NOS为终止子,含有卡那霉素抗性标记(NPT II)。其表达的蛋白与下游的绿色荧光蛋白形成融合蛋白,其大小约为61.6 ku;2在转化筛选抗性植株的过程中采用350 mg·L-1的头孢霉素可以很好地抑制农杆菌的污染,100 mg·L-1的硫酸卡那霉素筛选压力能够很好地抑制非转化细胞的生长;3随机选取10株转化烟草进行PCR检测发现8株转化烟草可以扩增到清晰的目的条带约994 bp;4内参基因RNR2的标准曲线为y=-3.5352x+15.143,σ3基因的标准曲线为y=-3.5366x+1.8265,两个标准曲线的相关系数均接近于1。在检测的5株转化烟草中σ3基因的拷贝数均为4,阴性对照没有扩增。5Western-blotting显示σ3融合蛋白在转化烟草中可以正确表达,目的条带大小约为61.6 k D,与预计大小一致;σ3融合蛋白能够与禽呼肠孤病毒的阳性血清发生特异反应,表明该融合蛋白具有良好的反应原性。【结论】成功地构建了植物表达载体p BI121-σ3,筛选获得低拷贝的转σ3基因的烟草,σ3融合蛋白能够在烟草中表达且具有相应的反应原性,为进一步研究σ3基因的功能和利用植物作为生物反应器生产σ3蛋白口服疫苗的研发奠定了基础。     

J 亚群禽白血病病毒受体基因NHE1 的遗传多态性分析

为发掘J亚群禽白血病病毒(ALV-J)受体基因NHE1潜在的遗传抗性位点,采用PCR技术分段扩增NHE1受体基因序列,并分析其遗传多态性。结果显示,在黄羽肉鸡NHE1基因外显子区域发现了16个SNP突变,分别为c.309GC,c.11653CT,c.11689GA,c.11917CT,c.11946CT,c.13405CA,c.13429TC,c.13438TC,c.14108AC,c.14516AG,c.14522GA,c.14654CT,c.15834GA,c.15873GA,c.17560CGandc.17770GA。进一步分析表明这些SNP突变均为同义c SNP,未引起氨基酸发生改变;在黄羽肉鸡NHE1基因内含子区域发现了SNP和插入/缺失突变,NHE1基因内含子2c.12239~12240和c.13114~13115分别存在AGGGCTGC和TGAAGCC插入突变,内含子11c.17073~17091存在TGTCCTGTGTCCTCCCTGC缺失突变;在ALV-J攻毒后阴性鸡和阳性鸡的NHE1基因外显子区域均发现c.309GC、c.11653CT、c.13405CA、c.13438TC、c.14108AC和c.14516AG6个SNP突变,内含子区域也均发现与黄羽肉鸡相同的插入/缺失突变。研究结果表明,发现的NHE1受体基因遗传变异位点不能作为ALV-J潜在的遗传抗性位点。     

鸭圆环病毒Cap 基因在昆虫细胞杆状病毒系统中的表达及鉴定

通过PCR方法扩增完整的鸭圆环病毒Cap基因,按正确的阅读框架将其克隆入pFastBacTM HTB杆状病毒载体,将筛选的阳性重组载体pF-CP转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBacmid-CP。在脂质体的介导下转染Sf9昆虫细胞,72h后获得重组杆状病毒。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明,表达的蛋白与原核表达Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反应原性,为进一步研究Cap蛋白的功能奠定基础。     

J亚群禽白血病的研究进展

介绍了J亚群禽白血病病原学、流行病学、症状、诊断、预防等几个方面的研究近况,旨在加强对禽白血病的防制。     

口蹄疫病毒A型AF/72株衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及鉴定

通过限制性酶切位点将P12A和3C基因插入到带有双启动子(Pp10和PPH)的杆状病毒表达载体p Fast BacTMDual,转化E.coli DH10感受态细胞进行蓝白斑筛选,将鉴定正确的重组杆状病毒质粒转染Sf9细胞后收获重组杆状病毒r Bac-Dual-P12A3C,通过间接免疫荧光(IFA)和蛋白质印迹(Western-blot)检测衣壳蛋白的表达。IFA结果表明表达产物能够被A型FMDV猪抗阳性血清所识别,鉴定正确并具有良好反应原性。Western-blot检测到81 k D(P12A)、57 k D(VP0+VP3)、47 k D(VP3+VP1)、33 k D(VP0)和24 k D(VP1/VP3)5条蛋白条带,与预期相符。该研究为进一步研究A型口蹄疫病毒空衣壳的体外组装提供了试验依据。     

猪瘟病毒Erns和E2基因在昆虫细胞中的表达研究

利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)Erns和E2基因,用于CSFV新型疫苗以及建立相关的血清学诊断方法等研究.从猪瘟病毒石门株血液样品中提取总RNA,对Erns及E2基因进行扩增,将产物回收后分别连接于T载体,酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移栽体pFastBacHT经重组筛选后获得杆状病毒重组质粒,重组质粒转染昆虫细胞sf9后连续传3～4代,分别收获细胞上清液及沉淀,用于SDS-PAGE及western-blotting试验,检测重组Erns,E2基因表达蛋白.用抗组氨酸(His)单克隆抗体在表达细胞中检测到Erns重组的His标签蛋白;应用抗E2蛋白单克隆抗体在表达细胞及培养上清液中检测到E2基因表达蛋白.结果表明在杆状病毒系统中成功表达了CSFV Erns和E2蛋白.     

棉铃虫核型多角体病毒(HaSNPV)ORF99基因在昆虫细胞中的表达及亚细胞定位

棉铃虫核型多角体病毒ORF99 基因Ha99是其基因组中特有的一个基因,序列分析发现Ha99基因开放阅读框包含354 bp核苷酸,编码118个氨基酸残基,预测相对分子质量为13 kDa.Ha99基因进一步在Bac-to-Bac系统中进行表达,SDS-PAGE和Western blot分析显示Ha99基因得到了成功表达,表达的相对分子质量为13 kDa,与预测的大小相符.亚细胞定位分析表明,ORF99基因的表达产物主要定位在细胞质中.时序表达分析显示Ha99基因在病毒侵染后6 h开始表达,一直持续到侵染后122 h,表明Ha99基因是一个晚期表达的基因.     

多杀性巴氏杆菌与禽白血病病毒亚群混合感染诊断及相关基因分析

【目的】明确引起贵州某规模化（20万羽）养殖场三黄鸡群发病的病因及科学用药,最大限度减轻经济损失,同时为规模化养殖场防控禽白血病和净化鸡群提供参考依据。【方法】无菌采集送检病鸡的心脏、肝脏和脾脏等组织进行细菌分离培养、生化试验、荚膜分型、毒力基因和耐药基因等分子生物学检测,同时对采集病料进行禽白血病病毒（ALV） PCR检测及gp85基因克隆测序分析。【结果】成功分离获得1株多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）,命名为Pm-GZXF2021; Pm-GZXF2021为荚膜A型Pm,具有黏附素（ptfA、hsf-1、hsf-2、pfhA、fimA和tadD）、超氧化物歧化酶（sodA）、外膜蛋白（ompA、ompH、plpB和oma87）和铁摄取（exbB、exbD、tonB、Fur、hgbB和hgbA）相关的毒力基因,同时携带有喹诺酮类的gyrB耐药基因和内酰胺类的tem耐药基因;药敏试验结果表明,Pm-GZXF2021对米诺环素、丁胺卡那、哌拉西林、庆大霉素、多西环素、氧氟沙星、新霉素、头孢拉定、麦迪霉素及头孢哌酮等药物敏感,而对头孢他啶、苯唑西林、羧苄西林及头孢曲松等药物已产生耐药性;健康昆明小鼠在接种Pm-GZXF2021纯培养菌液（1.7×108 CFU/mL）后12 h内全部死亡,剖检可见昆明小鼠小肠均出现胶冻样浸润,肝脏肿大且伴有白色坏死灶。从病鸡的组织样品检测出ALV,命名为ALV-GZXF2021;由基于gp85基因核苷酸序列相似性构建的ALV系统发育进化树可知,ALV-GZXF2021与5株ALV-K参考毒株处于同一分支,与A、B、D、E、J亚群处于不同分支,即ALV-GZXF2021属于K亚群。【结论】贵州某规模化养殖场三黄鸡群发病是由Pm与K亚群外源性ALV混合感染所致。因此,养殖场应采取相应的防控措施,一般包括加强饲养管理,做好生物安全措施及疫苗接种等,尤其是建立无禽白血病的种鸡群。     

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP3基因在昆虫细胞中的表达与鉴定

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus type-I,DHAV-I)SH株的主要结构蛋白VP3,首先根据DHAV-I SH株VP3基因序列设计1对引物,RT-PCR方法扩增出VP3基因,克隆至杆状病毒表达载体p Fast Bac1,获得重组杆状病毒转移载体p FB-VP3,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒r Bacmid-VP3,在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒r Bac-VP3。间接免疫荧光结果显示重组蛋白获得了正确表达,能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性反应。Western blot结果显示表达的重组蛋白分子量约为27 000。表明,DHAV-I SH株的主要结构蛋白VP3在昆虫细胞中获得了成功表达,为VP3结构蛋白的功能研究及相关亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及其抗原性鉴定

为构建并表达O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的空衣壳蛋白的重组杆状病毒并鉴定其抗原性.以质粒pMD19-P12A3C为模板,扩增出编码O型FMDV衣壳蛋白前体P12A及其蛋白酶3C的P12A3C基因,插入至杆状病毒转移载体pFast-BacDual PH启动子下,构建出重组转移载体pFastBacDual-P12A3C,并转化DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞,构建重组转座子Bacmid-P12A3C,将其转染Sf9细胞,获得表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒rBac-P12A3C.增殖重组杆状病毒然后用其感染Sf9细胞,最后通过间接免疫荧光检测外源蛋白的表达.结果表明,表达产物能够被O型FMDV VP1多克隆抗体识别,并具有良好的反应原性,表明表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒rBac-P12A3C构建成功.该研究为进一步研究O型FMDV空表壳的体外组装提供前期实验材料,并为后期研制出口蹄疫的基因工程亚单位疫苗奠定基础.