利用正交设计优化白桦的SSR-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对白桦SSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶,Mg2 ,模板DNA,dNTP,引物)在4个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了白桦SSR-PCR反应的最佳体系(20μL):DNA100ng,Mg2 浓度为3mmol·L-1,Taq酶0.5U,dNTP浓度为0.5mmol·L-1,引物浓度为0.4μmol·L-1。对白桦SSR-PCR最佳反应体系进行了梯度退火温度,得到的最佳退火温度为59.9℃。     

利用正交设计优化黄瓜的SSR-PCR反应体系

以白皮黄瓜B-2-2为试材,采用正交设计L16(45)在4个水平上对影响黄瓜SSR-PCR反应体系的Taq酶浓度、Mg2 含量、模板DNA用量、dNTP浓度及引物用量等5个因素进行了试验优化,并用单因素完全随机试验筛选各反应因素的最佳水平,建立了黄瓜SSR-PCR反应的最佳体系。结果表明:在20μL反应体系中,Taq酶最适浓度为0.5U,Mg2 最适浓度为2.0 mmol/L,模板DNA最适用量为5 ng/μL,dNTP最适用量为0.2 mmol/L,引物最适浓度为0.6μmol/L;引物最佳退火温度为50.0℃。利用20个黄瓜材料验证此反应体系,6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果显示,扩增产物在100~300 bp之间多态性高,且反应体系的稳定性和重复性好。     

正交设计优化稻瘟病菌SSR-PCR反应体系

[目的]筛选最佳的稻瘟菌SSR—PCR反应体系。[方法]利用正交设计对稻瘟菌SSR—PCR反应体系中的5个因素（TaqDNA聚合酶、Mg2＋、模板DNA、dNTP、引物）在4个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平并进行退火温度梯度试验筛选最佳的退火温度。[结果]稻瘟菌SSR-PCR反应的最佳体系为：反应总体积为20μl,raqDNA聚合酶1．0U,Mg^2＋ 2．0mmol／L,DNA100ng,dNTP50la,mol／L,引物（ms355～356）0．4μmol/L,最佳退火温度为58．5℃。在此体系下可从稻瘟菌材料基因组DNA中扩增出300bp左右清晰的目的条带,说明该体系稳定,适用于稻瘟菌基因组DNA的SSR标记。[结论]该研究为稻瘟菌的分子标记、遗传多样性研究和分子育种奠定了基础。     

正交设计优化番茄基因组DNA SSR-PCR反应体系

以21份番茄品种为材料,应用正交试验设计对影响番茄SSR—PCR的主要参数进行优化,建立适于番茄的SSR反应体系和扩增程序。在15μl体系中各反应的最适合含量为：2．5μl ddH2O,1μl 40ng模板DNA,3μl 200μmol／L dNTP,3μl 0．8μmol／L SSR引物,0．1μl 0．5U／μl Taq DNA聚合酶,1．5μl 10×PCR Buffer,0．9μl 1．5mmol／L MgCl2。PCR适宜扩增程序为：94℃预变性2min;94℃变性1min,45℃退火25s,共35个循环;68℃延伸25s,68℃延伸10min,然后4℃保存。利用此反应体系对21个番茄品种进行PCR扩增并电泳检测,扩增结果清晰且有较高的多态性,表明该体系适合番茄的遗传多样性研究。     

叶子花SSR-PCR体系的优化

[目的]优化叶子花SSR-PCR体系。[方法]以乔木叶子花为材料,通过Touchdown PCR扩增程序和正交试验,对影响叶子花SSR-PCR体系的引物浓度、Taq DNA聚合酶用量、Mg2+浓度和d NTPs浓度进行优化。[结果]叶子花20μl SSR-PCR体系的最优条件为引物浓度0.4 mmol/L、Taq DNA聚合酶用量1.5 U、Mg2+浓度1.5 mmol/L、4种d NTPs浓度均为0.15 mmol/L,模板100 ng左右。[结论]该反应体系的扩增条带清晰、稳定、重复性好,可用于后续叶子花遗传多样性分析和种质资源鉴定等研究。     

花生SSR-PCR体系的优化

以花生品种丰花3号为材料,研究了花生SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增效果的影响及不同引物的退火温度。结果表明dNTP对扩增影响较大,每对引物都有其扩增适合的退火温度。确立了适合花生SSR分子标记研究的优化体系。最终确定总反应体系为20μl,其中25mMMgCl21.5μl,2.5mMdNTP1.6μl,5U/μlTaq酶0.17μl,100ng/μl模板DNA0.4μl,2.5mM引物5μl。优化后的扩增程序退火温度为54℃。     

利用正交设计优化桃SRAP-PCR反应体系

以桃基因组DNA为模板,通过正交试验设计,从Mg2+、Taq酶、dNTP、引物、模板5种因素4个水平对桃SRAP反应体系进行优化,建立了适合于桃的SRAP-PCR优化反应体系,该25μL反应体系:模板DNA50 ng,MgCl22.5 mmol/L,dNTP200μmol/L,上下引物各0.4μmol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U,以灭菌双蒸水补齐至25μL。PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,5个循环;94℃变性1 min,50℃复性1 min,72℃延伸1 min,35个循环,72℃延伸10 min。     

利用正交设计优化向日葵ISSR-PCR反应体系

向日葵产业的发展对调整黑龙江省种植业结构、利用中低产田、增加农民收入具有十分重要的作用,为了推广ISSR分子标记技术在向日葵分子育种上的应用,利用正交设计对向日葵ISSR-PCR反应体系中的5个因素(模板DNA、dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓度、Taq酶用量)在4个水平上进行优化,确立了适合向日葵ISSR-PCR反应的20μL体系:50ng模板DNA、2.0μmol·L-1dNTP、37.5μmol·L-1 Mg2+、8μmol·L-1引物、8UDNA Taq酶。     

利用正交设计优化芦笋SRAP反应体系

以芦笋（Asparagus offinalis L．）为材料,对影响SRAP—PCR扩增结果的因素dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2＋、引物、模板DNA进行了正交优化设计的研究。结果表明,适合芦笋SRAP—vcR析的最佳反应体系：20μL的反应体积中包括0．2mmol／LdNTPs0．4gL;1UTaqDNA酶1．0gL;1．5mmol／LMg2 1．2μg;上下引物各30ng,每个引物O．5此;60ng模板DNA1．1.0μL;10Buffer2．0凼无菌双蒸水13．4此。为今后利用SRAP标记技术研究芦笋的遗传多样性奠定基础。     

利用正交设计优化芦笋SRAP反应体系

以芦笋(Asparagus officinalis L.)为材料,对影响SRAP-PCR扩增结果的因素dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、引物、模板DNA进行了正交优化设计的研究。结果表明,适合芦笋SRAP-PCR分析的最佳反应体系:20μL的反应体积中包括0.2mmol/LdNTPs0.4μL;1UTaqDNA酶1.0μL;1.5mmol/LMg2+1.2μL;上下引物各30ng,每个引物0.5μL;60ng模板DNA1.0μL;10×Buffer2.0μL;无菌双蒸水13.4μL。为今后利用SRAP标记技术研究芦笋的遗传多样性奠定基础。     

利用正交设计优化亚麻SRAP-PCR反应体系

为亚麻分子标记及分子育种提供可靠的理论依据,利用正交试验设计对亚麻SRAP-PCR反应体系中的4因素(模板DNA、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度)在3个水平上进行正交优化,确立了适合亚麻SRAP-PCR反应的20μL体系:75ng模板DNA、0.75μmol.L-1引物、1.5mmol.L-1 Mg2+、0.40mmol.L-1dNTPs和1.5UTaqDNA聚合酶。     

利用正交设计优化金钗石斛的转化体系

为优化金钗石斛的转化体系,以其类原球茎(PLBs)为材料,利用正交设计研究了影响农杆菌介导转化的因素.结果表明:PLBs预培养1 d、侵染的菌液OD600值1.2、乙酰丁香酮(AS)100μmol/L、共培养5 d时,每100mg鲜物质量材料上的GUS染色蓝点数最多;单因子试验表明AS适宜的浓度为50μmol/L;PCR结果显示得到了转化呈阳性的PLBs;初步表明此体系可用于金钗石斛的遗传转化研究.

Abstract：

In order to optimize the Agrobacterium-mediated transformation system for Dendrobium nobile Lindl, effects of preculture time, bacterial concentration, acetosyringon (AS) concentration and co-cultivation time on Agrobacterium-mediated transformation of protocorm like bodies (PLBs) of D. nobile Lindl were studied in an experiment with orthogonal design. The results showed that number of GUS staining blue spots per 100 mg flesh weight of PLBs was the greatest in the treatment of the combination of preculture for one day, 1.2 of bacterial concentration (OD600), 100 μmol/L of concentration of AS and co-culture for five days. Single factor experiment showed that the appropriate concentration of AS was 50 μmol/LPCR confirmed that positive transformed PLBs were obtained. It is tentatively concluded that this system can be used in the study of transformation of D. nobile Lindl.     

利用正交设计优化辣椒的SRAP反应体系

以辣椒雄性不育保持系B-07LP为试材,利用正交设计L16(45)在5个水平上对影响辣椒SRAP反应体系稳定性的dNTP浓度、引物用量及Taq酶活性浓度梯度等外部条件进行了优化试验。在此基础上,通过单因素完全随机试验确定了辣椒SRAP关键反应因子的适宜浓度。其中引物浓度为0.4μmol/L、dNTP的适宜浓度为0.2 mmol/L及适宜的Taq酶活性浓度为0.3 U/μL,并对所建体系的稳定性进行了验证。     

番茄SSR-PCR反应体系的优化

为了确定番茄的SSR-PCR的最佳反应体系,采用2×Taq PCR Master Mix,对Taq酶、Mg2+、dNTPs进行综合考虑,探究其对番茄SSR-PCR反应体系的影响,并优化出最佳的反应体系。结果表明:引物用量对结果影响最大,其次是DNA用量,Master Mix用量对结果影响最小。最佳反应体系为:模板(50ng·μL-1)DNA2μL,Master Mix 9μL,引物3μL。     

华山松SSR-PCR反应体系优化

[目的]建立华山松SSR-PCR最佳反应体系,为华山松种质资源的分子标记辅助育种、遗传多样性分析及遗传图谱构建研究提供理论参考.[方法]以华山松幼嫩针叶为材料,分别采用试剂盒法、SDS法和改良CTAB法提取华山松基因组DNA,确定华山松DNA最佳的提取方法.通过L16(44)正交试验设计对华山松SSR-PCR反应体系中引物用量(A)、dNTP用量(B)、Taq DNA聚合酶用量(C)和DNA模板用量(D)进行优化,获得华山松SSR-PCR最佳反应体系.[结果]改良CTAB法提取的基因组DNA浓度为92.1~1786.3 ng/μL,OD260/OD280为1.80~2.07,OD260/OD230比值约2.0,条带明亮且清晰,无弥散现象,表明该方法提取效果最佳.正交试验极差分析结果显示,4个因素影响华山松SSR-PCR反应体系扩增效果的主次顺序为A>D>B>C,最优水平组合为A4B2C2D2.正交试验方差分析结果显示,4个因素影响华山松SSR-PCR反应体系扩增效果的主次顺序为A>D>C>B,最优水平组合为A4D2C2B2.结合正交试验16个组合的评分结果,最终确定华山松SSR-PCR最佳反应体系(20.00μL):10μmol/L引物0.35μL,50 ng/μL DNA模板1.00μL,10 mmol/L dNTP 2.00μL,5 U/μL Taq DNA聚合酶1.20μL,10×PCR Buffer(含Mg2+15 mmol/L)2.00μL,用ddH2O补足至20.00μL.[结论]优化获得的华山松SSR-PCR最佳反应体系可应用于华山松种质资源评价及分子标记辅助育种等研究.     

大豆SSR-PCR反应体系优化

应用单因素试验和L16(45)正交设计对影响大豆SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适合大豆SSR-PCR反应的最佳体系。各因素不同水平对PCR反应结果均有影响,优化后的大豆SSR反应体系为:2.0 mmol/L Mg2+、1.00μmol/L引物、0.150 mmol/L dNTP、0.5 UTaq酶、50ngDNA模板。运用优化后的反应体系对大豆进行多态性引物的筛选,从140对引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物45对。     

玉叶金花SSR-PCR体系的优化

[目的]优化玉叶金花SSR-PCR扩增反应体系。[方法]以红纸扇为材料,采用正交设计和单因素试验方法,从Mg~(2+)、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA浓度以及退火温度4个方面对玉叶金花SSR-PCR体系进行优化,并采用4对SSR引物和4种玉叶金花植物样品进行验证。[结果]玉叶金花20μL的SSR-PCR反应最优体系为Mg~(2+)浓度1.50 mmol/L、d NTPs浓度0.150 mmol/L、引物浓度0.45μmol/L、TaqDNA聚合酶2.00 U、模板DNA 15 ng、退火温度53.4℃。[结论]该反应体系的扩增条带清晰、稳定、重复性好,可用于玉叶金花的SSR分子标记开发、物种分子鉴定、遗传多样性分析和谱系关系构建等相关研究。     

梁山慈竹SSR-PCR体系的优化

以梁山慈竹为材料,提取叶片DNA并将其作为模板,采用正交设计试验优化影响梁山慈竹简单重复序列-聚合酶链式反应(SSR-PCR)体系的3个主要因素,并对21个梁山慈竹不同品系进行稳定性验证,结果表明,优化的20μL SSR-PCR反应体系为2×Taq PCRMix 8μL、模板DNA(20 ng/μL) 2.5μL、SSR引物(1.0×10~(-4) mmol/L) 1μL,无菌蒸馏水补足至20μL;使用SSR引物BMK.38757对21个梁山慈竹不同品系进行扩增,扩增产物大小在140 bp左右,共有4个多态性位点;使用SSR引物L6、R83对梁山慈竹进行扩增,均获得3个多态性位点,且条带清晰。     

椰子SSR-PCR反应体系的优化

为进一步开发利用椰子种质资源和开展分子标记辅助幼苗早期筛选及遗传育种工作,采用L_9(3⁴)正交试验设计,探索了椰子SSR-PCR的最佳反应体系。通过对模板DNA、Mg4)正交试验设计,探索了椰子SSR-PCR的最佳反应体系。通过对模板DNA、Mg⁽²⁺⁾、dNTPs、Taq酶、引物、退火温度的筛选优化,建立了椰子SSR-PCR最佳反应体系(10μL)为:模板DNA 60 ng、Mg(2+)、dNTPs、Taq酶、引物、退火温度的筛选优化,建立了椰子SSR-PCR最佳反应体系(10μL)为:模板DNA 60 ng、Mg⁽²⁺⁾2.5 mmol/L、dNTP 250μmol/L、Taq酶0.5μmol、引物0.5μmol/L、退火温度58℃,在该体系条件下,PCR扩增条带最为清晰,该反应体系的优化,为今后应用SSR标记技术为椰子群体结构分析、种质资源丰富度、基因定位和遗传育种等研究奠定工作基础。