K88ac基因工程苗及免疫仔猪腹泻的试验小结

一、大肠杆菌K88ac基因工程苗的构建 80年代以来,国内外许多学者都在研究预防仔猪腹泻的基因工程疫苗,且均有不同程度的进展。本文猪源性产肠毒素大肠杆菌K88ac菌株是从上海奉贤县仔猪腹泻粪便中分离出来的大肠杆菌。采用两个重组质粒,一个是粘附素基因重组质粒pMM032,编码合成K88ac抗原;另一个是热敏毒素(LT)基因重组质粒pPMC4或pPMC5,编码合成无肠毒     

大肠杆菌F18菌毛A亚单位基因(fedA)的克隆与序列测定

利用PCR技术 ,分别从产F18ab菌毛的猪水肿病大肠杆菌分离株G及产F18ac菌毛的大肠杆菌 8813株中扩增出 5 10bp左右的F18菌毛A亚单位基因 (fedA)。将这 2个PCR扩增产物按预定阅读框架克隆入pGEX 6p 1载体的谷胱甘肽S 转移酶 (GST)基因的下游 ,筛选获得阳性重组质粒 ,并对质粒中的插入序列进行测定。序列分析表明 :F18ab与F18ac的fedA基因的核苷酸序列同源性为 97.6 % ,推导的氨基酸序列同源性为 94.7% ,两者的主要区别在于F18acfedA基因的第 36 3bp处比F18ab多 3个核苷酸 ,并出现一个新的酶切位点 (NgoMI)     

大肠杆菌F18菌毛A亚单位基因（fedA）的克隆与序列测定

利用PCR技术，分别从产F18ab菌毛的猪水肿病大肠杆菌分离株G及产F18ac菌毛的大肠杆菌8813株中扩增出510bp左右的F18菌毛A亚单位基因（fedA）。将这2个PCR扩增产物按预测阅读框架克隆入pGEX-6p-1载体的谷胱甘肽S－转移酶（GST）基因的下游，筛选获得阳性重组质粒，并对质粒中的插入序列进行测定。序列分析表明：F18ab与F18ac的fedA基因的核苷酸序列同源性为97.6%，的氨基酸序列同源性为94.7%，两者的主要区别在于F18ac fedA基因的第363bp处比F18ab多3个核苷酸，并出现一个新的酶切位点（NgoMI）。     

大肠杆菌野生株K99菌毛蛋白结构基因的克隆与序列分析

根据产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K99菌毛蛋白的全基因序列设计产肠毒素大肠杆菌主要菌毛K99的一对引物。PCR扩增K99菌毛蛋白的全基因序列大小为546bp。将PCR扩增的目的片断克隆于pMD18-T载体、pET-32a载体中,分别转化大肠杆菌,经酶切鉴定、PCR鉴定及DNA序列分析,筛选出阳性克隆。经过序列比对,所克隆的外源基因与报道的K99菌毛蛋白结构基因序列同源性达99.3%。成功克隆分离到的产肠毒素大肠杆菌菌毛的K99基因,为当地产肠毒素性大肠杆菌病疫苗的选择及基因疫苗的研制提供了坚实的理论基础,为产肠毒素性大肠杆菌病检测、预防及基因工程疫苗的研制开辟新的途径。     

产肠毒素大肠杆菌F5菌毛基因的克隆与表达

应用PCR方法从产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)中扩增出不含信号肽序列的F5菌毛抗原基因片段,克隆测序后将其连接到大肠杆菌表达载体pET-30a(+)中,转化工程菌BL21,经IPTG诱导表达。经SDS-PAGE和Western Blot分析,重组蛋白在BL21中得到表达并与F5菌毛单因子血清发生明显反应。     

猪肠毒素大肠杆菌F4受体的微卫星标记筛选

从猪13号染色体选取与肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4受体基因连锁的8个微卫星座位,研究不同猪种间的遗传特性,并分析不同基因型与F4受体黏附表型的关系.结果表明,2个地方猪种(五指山猪和沙子岭猪)和2个外来猪种(大约克猪和杜洛克猪)在8个基因座均具有高度多态性,杂合度为0.6117～0.7500,多态信息含量在0.5749以上.对大约克猪和沙子岭猪的F4黏附性和微卫星的关联研究表明,在微卫星座位S0223和SW207,2个猪种不同基因型在F4ab和F4ac血清型黏附表型上差异显著或极显著,可能F4ab和F4ac受体就位于这2个位点之间.这2个微卫星座位可望作为ETECF4抗性基因的遗传标记.     

大肠杆菌肠毒素STI、STII、LTB融合基因植物表达载体的构建

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌。利用PCR方法分别从pGEM-5Zf( )-STI、K88ab(LT ,ST )质粒中扩增到了STI、STII基因,然后通过三引物PCR实现了STI、STII基因的融合,再与LTB基因融合,并置同一阅读框。LTB基因的5′位于STII基因的3′端,并在ST基因和LTB基因之间插入7个氨基酸的连接肽。将融合基因STI-STII-LTB构建到带有核基质结合区序列(MARs)的植物表达载体pBI121-MARs中,并通过冻融法导入根癌农杆菌EHA105。     

猪肠毒素大肠杆菌（ETEC）F4受体的微卫星标记分析

从猪13号染色体选取与Escherichia.coli（ETEC）F4受体基因连锁的8个微卫星座位研究不同猪种间的遗传特性,并分析不同基因型与F4受体黏附表型的关系。结果表明,2个猪种在8个基因座均具有高度多态性,杂合度（H）在0.6117～0.7500之间,多态信息含量（PIC）达0.5749以上。在微卫星座位S0223和 SW207,两个猪种不同基因型在F4ab和F4ac血清型黏附表型上差异显著或者极显著,可能F4ab和ac受体就位于这2个位点附近（之间）。这为抗性猪的选择提供了可能,这两个微卫星座位可望作为E.coli F4抗性基因的遗传标记。     

仔猪黄痢K88-K99-987p-F41多价菌毛混合油乳剂灭活疫苗的制备及小鼠免疫保护试验

根据我国仔猪大肠杆菌性腹泻流行的实际情况，用产菌毛粘附因子的野生分离菌株HN2001(K88ab)、HN2002(K88ac)、HN2003(K88ad)、HN2004(k99)、C83915(987p)及C83621(F41)提取菌毛制成5批多价菌毛混合油乳剂灭活苗，5批多价灭活疫苗对小鼠的平均保护率达95.0％（38/40）。     

F4ac型产肠毒素大肠杆菌菌液上清对仔猪小肠 上皮细胞的免疫刺激作用

【目的】猪源产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC）是一类世界范围内流行的致仔猪腹泻的病原菌。依据养猪业生产实践中对致仔猪腹泻病原菌血清学鉴定结果可知,F4ac型ETEC的流行性最为广泛。到目前为止,对ETEC导致仔猪腹泻的机理已经有了比较透彻的阐释。但对ETEC培养液的免疫原性尚未有研究和描述。论文以F4ac型ETEC为研究对象,探索其菌液上清（即培养液）对仔猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）的免疫刺激作用。【方法】首先收集F4ac型ETEC菌株200培养12h后的培养液,后经4℃,4 000 r/min,离心15 min收集培养液上清,将该上清液经0.22 µm滤器过滤,并与DMEM/F12培养基以1﹕1的比例混合,以此混合液共孵育IPEC-J2细胞3 h,重复此处理3次获得处理组细胞;同时设新鲜的LB培养基与DMEM/F12培养基同样以1﹕1的比例共孵育3 h的IPEC-J2 细胞为对照组细胞,对照处理亦重复3次。然后用TRIZOL试剂按照说明书提取对照组和攻毒组IPEC-J2细胞的总RNA,并用TaKaRa 公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（反转录试剂盒）按照说明书将提取的总RNA反转录成cDNA。应用文献报道或自行设计的跨内含子的引物通过实时荧光定量PCR方法,以猪的持家基因β-actin作为内参,检测IL8、TNF-α、CXCL2、IL6、IL1A、TLR4、SLPI、PLAU和MUC13共9个免疫相关基因和黏蛋白基因在攻毒组和对照组中的mRNA表达差异性。【结果】较之对照组,在攻毒组中,3个重要的促炎细胞因子基因IL8、TNF-α和CXCL2的mRNA均出现了显著性地过表达。其中,在攻毒组中,IL8的表达量为对照组的3.24倍（P < 0.05）;TNF-α的表达量亦为对照组的3.24倍（P < 0.01）;CXCL2 的表达量为对照组的1.65倍（P <0.001）。在攻毒组和对照组之间,其他6个基因（IL6、IL1A、TLR4、SLPI、PLAU和MUC13）的表达差异未达到统计学上的显著水平。【结论】研究采用F4ac型ETEC菌株200的培养液上清对IPEC-J2细胞系进行3 h攻毒处理,并通过荧光定量PCR方法检测到了3个重要的促炎因子基因IL8、TNF-α和CXCL2在攻毒组较之非攻毒组中的过表达。这表明猪F4ac型ETEC培养液上清对仔猪小肠上皮细胞确实具有一定的免疫刺激作用。研究为更明确地了解猪F4ac型ETEC释放的肠毒素及黏附素等抗原物质对仔猪小肠上皮细胞的免疫刺激作用提供了一定的实验证据。     

F18大肠杆菌黏附素受体结合域鉴定新方法

运用DNA重组技术将F18ab和F18ac大肠杆菌黏附素fedF亚单位内的第60～109位氨基酸残基区段(fedF1)和fedF全基因克隆入V型分泌系统MisL的载客结构域上,经DNA测序确证其正确阅读框后,含重组菌质粒pnirBMisL-fedF或pnirBMisL-fedF1经厌氧诱导后,与断奶仔猪小肠上皮细胞进行体外黏附试验。结果表明:FUT1基因M307位点中GG型和AG型仔猪小肠上皮细胞均能黏附上述重组菌,而AA型个体小肠上皮细胞则不能黏附。上述重组菌均能与兔抗F18ab菌毛FedF亚单位单因子高免血清发生玻板凝集反应。而FedF突变体FedF(M)的重组质粒菌则失去上述凝集和黏附特性。证明F18大肠杆菌黏附素fedF基因及其基因片段fedF1在大肠杆菌表面得到了功能性表达,F18ab和F18ac黏附素FedF直接介导F18大肠杆菌与易感仔猪小肠上皮细胞表面大分子受体黏附结合,fedF1为黏附素FedF的受体主要结合域,其His88、His99是FedF黏附素受体结合域的重要氨基酸残基。     

猪源ETEC的黏附素基因克隆与原核表达

[目的]克服传统方法制备黏附素抗原的缺点。[方法]应用PCR对猪源性产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)的黏附素F4、F5和F6的质粒中扩增出faeG、fanC和fasG基因片段,克隆测序并与pET 32a(+)构建重组表达载体。将重组表达载体转化E.coli表达菌株BL21(DE3),并分析其免疫原性。[结果]重组表达载体经IPTG诱导获得高效表达。血凝抑制试验表明,鼠抗血清能抑制标准的ETEC强毒株凝集红细胞,抑制效价在1∶128以上。这说明克隆表达的猪源ETEC黏附素蛋白具有良好的免疫原性。[结论]该研究可为进一步开发抗体制剂奠定基础。     

FimH黏附素对F18ac+大肠杆菌黏附能力和生物被膜形成能力的影响

为研究Ⅰ型菌毛FimH黏附素在F18ac+大肠杆菌(F18ac+E.coli)致病机制中的作用,采用λ-Red同源重组方法成功构建了F18ac+E.coli的fim H基因缺失株(F18ac△fim H)。并使用体外仔猪上皮细胞感染模型,探讨FimH黏附素缺失后对F18ac+E.coli黏附能力和体外生物被膜形成能力的影响。结果表明,与野生株相比,F18ac△fim H缺失株对易感仔猪上皮细胞系IPEC-1和IPEC-J2的黏附能力和体外生物被膜形成能力均显著下降,且其黏附能力可被8%的D-甘露糖所抑制。但是F18ac△fim H/pfim H回补株的黏附能力以及生物被膜形成能力均基本恢复至野生株水平。可见,FimH黏附素是介导F18ac+E.coli黏附的重要黏附因子。     

喷雾干燥血浆可以提高断奶猪生长性能

意大利研究人员通过试验证明．给21日龄断奶猪饲喂6％喷雾干燥血浆(SDP)代替同样数量的鱼蛋白可以提高猪的生长性能。15d时．饲喂SDP猪的平均日增重为197g．显著高于饲喂鱼蛋白猪的175g。此外．SDP还可以增强对大肠杆茵攻击的保护。试验4d时．用口服肠毒素性大肠杆菌K88对猪进行攻击，     

仔猪抗大肠杆菌性F4 ac腹泻病分子遗传机理研究进展

产肠毒素大肠杆菌F4ac(ETEC F4ac)是引发新生和断奶前仔猪腹泻病的最主要致病菌,分离和鉴别猪ETEC F4ac受体目的基因及因果突变位点成为猪ETEC F4ac腹泻抗病育种的关键。对仔猪抗大肠杆菌性腹泻病分子遗传机理研究进展进行综述,以期为培育种猪抗腹泻病新品系奠定理论基础。     

检测产肠毒素性大肠杆菌粘附素抗体间接ELISA的建立

为了评价仔猪大肠杆菌病K88-K99-987P-F41 四价亚单位疫苗的免疫效果,利用纯化粘附素为包被抗原,建立了检测产肠毒素性大肠杆菌粘附素抗体的间接ELISA。初步确定了各种反应条件: K88、K99、987P、F41粘附素抗原最适包被浓度依次为1∶400、1∶80、1∶40、1∶40,相应粘附素抗体最佳稀释度依次为1∶400、1∶200、1∶200、1∶200。经交叉试验、阻断试验和重复试验证实,本方法具有良好的特异性和重复性。     

大肠杆菌多价苗免疫试验

<正> 仔猪黄痢是由产肠毒素大肠杆菌引起的急性肠道传染病,对周龄内仔猪危害严重。1987年,我们在1985年大肠杆菌多价苗研究的基础上经过改进,研制出了新的大肠杆菌多价苗,1988年进行了现场免疫试验。 供试疫苗为自制大肠杆菌多价苗,每头份2ml,内含K_(88ab),K_(88ac)各8IU,LT免疫溶血效价1:300,灭活菌体80×10~8个。供试猪为怀孕后期母猪,在产前约45天和10天肌肉或皮下注射各1次,每次注射2ml。     

CRISPR/Cas9介导TLR5敲除猪肺泡巨噬细胞系建立及对革兰阴性菌黏附能力的影响

Toll样受体5(TLR5)是Toll-like受体家族中的重要成员,在革兰阴性菌引起的炎症反应中发挥着重要的调控作用.通过CRISPR/Cas9基因敲除技术对猪肺泡巨噬细胞(PAMS)的TLR5基因进行敲除,然后经菌落计数,检测TLR5基因敲除后对大肠埃希菌F18ab和F18ac以及沙门菌黏附能力的影响.结果 表明:...     

抗大肠埃希氏菌K_(99)和987P粘着素单克隆抗体研究进展

引起初生幼畜腹泻的重要病原之一是肠毒素性大肠杆菌(ETEC),它们都具备两类致病因子即粘着素和肠毒素,在ETEC中,迄今已发现的粘着素有K88、K99、987P和F41四种。鉴于ETEC的血清型较复杂,加之粘着素种类的多样性和抗原性的彼比不同,采用淋巴细胞杂交瘤技术,研制纯净、匀质、高效价的抗大肠杆菌粘着素单克隆抗体,并形成诊断试剂盒,已成为大肠杆菌病的快速诊断及流行病学研究的重要手段。继成功地研制出抗大肠杆菌K88单抗之后,最近,我们又用提纯的K99和987P抗原分别免疫BALB/C小鼠,以免疫小鼠     

猪miR-192/-215的组织表达谱及其关键靶基因分析

【目的】在前期通过Illumina Solexa高通量测序技术并结合荧光定量验证筛选出断奶仔猪E.coli F18菌株感染下表达量极显著上调的microRNAs-miR-192和miR-215的基础上,为了解miR-192和miR-215的组织表达情况,进一步筛选确定miR-192和miR-215靶向调控E.coli F18菌株感染的关键靶基因,为探讨miR-192和miR-215调控断奶仔猪E.coli F18感染的分子调控机制奠定基础。【方法】试验采用Real-time PCR方法检测miR-192和miR-215在35日龄梅山仔猪各个组织中的分布情况,同时利用MEGA 5.0分析了其保守性,TargetScan预测miR-192和miR-215的靶基因,并对靶基因分别进行Gene Ontology和Pathway通路的富集分析,进一步利用DAVID对靶基因蛋白进行功能分类,最后将预测的靶基因与课题组前期筛选出的断奶仔猪E.coli F18感染抗性相关的调控基因取交集。【结果】miR-192和miR-215在35日龄梅山仔猪十二指肠和空肠中均高度表达,二者成熟序列在脊椎动物中高度保守。miR-192和miR-215对应的靶基因相同,具有156个靶基因,只在轴突导向通路（axon guidance pathway）显著富集（P-value < 0.05）以及25个GO功能中显著富集（P-value < 0.05）。靶基因蛋白按功能分为12类,其中信号转导功能的磷蛋白（phosphoprotein）和DNA结合蛋白（dna-binding）占主要部分。靶基因与前期筛选的E.coli F18感染抗性相关的调控基因（GEO登录号：GSE26854）取交集,发现DLG5、ALCAM、FRMD4B、MIPOL1和ZFHX3 等5个基因为miR-192和miR-215的重要靶基因,其中DLG5为维持小肠上皮细胞结构完整性的重要因子。【结论】miR-192与miR-215是参与维持断奶仔猪肠道正常功能与抗F18大肠杆菌感染的重要因子,DLG5可能是miR-192和miR-215靶向调控E.coli F18菌株感染中关键的靶基因,今后需要进一步验证其能否作为梅山猪抗F18大肠杆菌的有效遗传标记。