安徽省猪伪狂犬病毒的分离鉴定及其主要毒力基因分子特征

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)引起的一种急性、热性传染病。自2011年底以来,PRV发生了变异,传统的PRV弱毒疫苗已不能对PRV变异株提供完全保护,这给我国PR防控带来了巨大挑战。为了解安徽省PRV流行特征及其主要毒力基因遗传变异情况。利用PCR技术、细胞接种试验、电子显微镜观察、间接免疫荧光试验及兔体接种试验等方法,对安徽省临诊病例中疑似PRV感染的病猪进行病原检测及PRV分离鉴定,并通过设计6对特异性引物对PRV分离株主要毒力基因(gE、gI、TK、gB、gC、gD)进行克隆及测序分析。2016—2018年安徽省临诊病例中共分离鉴定15株PRV;PRV分离株主要毒力基因序列均与2011年后国内PRV变异株同源性较高;与2011年前国内PRV经典株序列比对,PRV分离株gE、gB、gC及gD基因存在多个位点的一致性替换、插入或缺失,且gE、gC基因多位点突变位于其重要的抗原表位区。本研究分离的15株PRV均为变异株,变异株已成为安徽省主要的流行毒株。15株PRV分离株的gI、TK基因序列较为保守,而gE、gC蛋白抗原表位区...     

猪伪狂犬病基因缺失耐热保护剂活疫苗免疫效果试验探究

为评估猪伪狂犬病基因缺失耐热保护剂活疫苗C株（以下简称伪狂犬疫苗）对猪场伪狂犬病的防控效果,对天津市某猪场引进的约2000头后备母猪分阶段注射伪狂犬疫苗,引进前第4周和第10周各注射1头份,引进后15d注射1头份,并对抗体水平和野毒感染情况进行评估。结果表明,伪狂犬疫苗能使猪群产生较好的免疫应答,免疫后ELISA检测的猪伪狂犬病病毒gB抗体极显著提高（P<0.01）。经过免疫的后备母猪针对伪狂犬经典毒株和变异毒株的中和抗体水平均上升,且免疫前后针对伪狂犬变异毒株的中和抗体效价差异极显著（P<0.01）。可见,该研究所用伪狂犬疫苗无论是针对经典毒株还是变异毒株均能为猪群提供更好的保护力,且对变异毒株产生的中和抗体效价更高,保护力更强,适用于我国猪伪狂犬病的防治。     

江西省猪伪狂犬病原流行病学调查及其gB、gE及TK基因遗传变异分析

为了解江西省猪伪狂犬病原流行情况及遗传变异情况,对2017—2018年收集的疑似伪狂犬样品,以1对针对猪伪狂犬病毒gE基因的检测引物进行病原检测,并随机挑选15株PRV阳性样品,对PRV病毒复制必需的糖蛋白gB基因和主要毒力基因gE与TK基因克隆测序及遗传进化分析,用以探究其遗传变异关系。临床结果显示:猪伪狂犬病毒检出率由2017年的4.76%PRV gB/gE/TK全基因序列遗传进化分析结果表明:调查的15株伪狂犬病毒毒株与中国株处于同一分支,与美国株Bartha差异较大。核苷酸同源性分析结果表明:15株PRV gB基因相互间同源性为98.9%～100%;与参考毒株的gB基因的同源性96.7%～100%;gE基因相互间同源性为99.1%～100%;与参考毒株的gE基因的同源性98.1%～100%;TK基因变异相对较小,相互间同源性为100%,与参考PRV毒株的gE基因的同源性99.1%～100%。研究结果表明,gB基因和gE基因存在较多的变异,可能是当前流行毒株抗原变异及毒力增强从而使现有疫苗免疫保护力不佳的主要原因。     

猪伪狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析

【目的】进一步了解猪伪狂犬病毒新流行株的遗传特征。【方法】对从安徽某猪场分离的1株猪伪狂犬病病毒(PRV)AH株进行遗传进化分析及主要糖蛋白gB、gC、gD、gE的序列分析。【结果】PRV AH株与国内2011年以来的流行毒株非常相似,但与Bartha株及其他国外毒株遗传关系较远;国内流行毒株与Bartha株及其他国外毒株相比,其主要糖蛋白均存在明显的连续氨基酸的缺失和插入,且部分突变位点位于这些糖蛋白的重要功能区。【结论】从分子水平上解析了PRV新流行株与疫苗株Bartha株的遗传差异,为进一步深入研究Bartha株疫苗免疫失败的原因提供了理论依据。     

河北免疫猪场猪伪狂犬病病例的诊断

为了对河北某免疫猪场发生的疑似猪伪狂犬病进行确诊,并针对猪伪狂犬病毒开展进一步的研究工作,本试验对该猪场送检的病猪进行剖检,将其脾、肺、肾及淋巴结的混合研磨液经PK15细胞接种分离,后经PCR扩增及动物回归试验,证实成功分离的病毒为伪狂犬病毒(PRV),并命名为SH151218。根据GenBank上传的PRV及其gE基因序列,设计了1对检测引物以及1对扩增gE基因的引物,并对其gE基因进行了序列分析,SH株属于GI亚型,与哈尔滨变异株同源性最高,所分离的PRV毒株为变异强毒株。此变异株的发现对PRV变异机制的研究及研制新疫苗提供了基础。     

规模猪场伪狂犬病流行病调查及监测结果综合分析

为了摸清鹿寨县规模猪场伪狂犬病的发生流行情况,有效控制猪场的猪伪狂犬病,对鹿寨县规模猪场猪伪狂犬病感染状况进行流行病学调查,通过使用猪伪狂犬病病毒gE-ELISA抗体检测试剂盒,检测血清样品,计算出鹿寨县猪伪狂犬病血清学场流行率以及个体流行率。结果显示:鹿寨县南北地区之间猪伪狂犬病毒野毒阳性率差异显著,北部地区猪伪狂犬病毒野毒阳性率显著高于南部地区;小型猪场伪狂犬病野毒阳性率最高为14.84%,中型猪场、大型猪场伪狂犬病野毒阳性率依次降低;不同生长阶段的猪群均可感染PRV,母猪PRV野毒阳性检出率最高为24.57%,仔猪PRV野毒阳性检出率为6.15%,育肥猪的PRV野毒阳性检出率为0.35%。本课题研究表明:鹿寨县北部地区规模猪场猪伪狂犬病野毒感染形势严峻,应加强猪场生物安全管理、科学饲养管理、合理地制定种猪高效免疫计划,强化定期监测防控意识,果断淘汰病猪,净化猪群,做好综合防治工作。     

免疫增强剂对猪伪狂犬灭活疫苗的免疫增强作用

为了评价免疫增强剂VA5对猪伪狂犬病毒灭活疫苗的免疫增强作用,将VA5与灭活疫苗混合并制成疫苗。通过常规Bartha-K61株灭活疫苗、含免疫增强剂灭活疫苗和Bartha-K61活疫苗3组免疫效力对比试验,首次免疫后14和35 d对猪进行采血,并且进行中和实验以及对相关细胞因子进行检测。结果表明,该免疫增强剂能够显著地提高猪伪狂犬灭活疫苗血清中抗体产生,同时能显著提高猪外周血淋巴细胞(PBMC)中IL-2和IFN-γ mRNA表达。交叉中和试验表明,VA5能够显著地提高猪伪狂犬灭活疫苗对伪狂犬流行变异株的中和作用。试验表明,VA5能够显著提升猪伪狂犬病毒灭活疫苗体液与细胞免疫,为研制免疫效果更好的灭活疫苗提供了依据。     

伪狂犬病病毒疫苗的研究进展

伪狂犬病是由疱疹病毒感染引起的一种急性的猪传染病,其对养猪业造成巨大的经济损失。伪狂犬病主要通过使用灭活疫苗和减毒活疫苗得到控制。近年来,随着我国伪狂犬病的反弹和流行,伪狂犬病防控和疫苗研究再次成为研究热点。文章综述了伪狂犬病毒疫苗的相关内容并为将来的疫苗研究作以展望。     

规模猪场伪狂犬病gB与gE抗体检测综合对比分析

为了解鹿寨县规模猪场猪伪狂犬病病毒(PRV)免疫抗体水平及野毒感染情况,有效控制规模猪场的伪狂犬病,通过使用猪伪狂犬病病毒gE-ELISA抗体检测试剂盒及猪伪狂犬病gB抗体检测试剂盒对鹿寨县规模猪场所采集的992份血清样品按照不同地区猪场、不同规模、不同生长阶段3个方面进行gB与gE抗体检测综合对比分析。结果显示:猪伪狂犬病病毒在鹿寨县南北地区的不同猪场都有所流行,在北部地区平山镇流行范围广,流行率高,平山镇有伪狂犬野毒感染的猪场共计6家,占采样比的75%(6/8)。大型猪场gB抗体阳性率最高为86.46%, gE抗体阳性率最,低为3.13%;而小型猪场gB抗体阳性率最低为36%, gE抗体阳性率最,高为14.84%; PRV g B抗体阳性率与PRV g E抗体阳性率呈负相关。在不同生长阶段,母猪群的gB抗体阳性率为96.2%、 gE抗体阳性率韦24.57%,其两种抗体阳性率都明显高于育肥猪和仔猪;育肥猪、仔猪PRV gB、 PRV gE抗体阳性率的相关性与不同规模猪场PRVgB、 PRVgE抗体阳性率的相关性相似。表明:鹿寨县平山镇规模猪场猪伪狂犬病野毒感染形势严峻。而母猪群及后备猪群的野毒清除情况是决定规模猪场PR净化的首要关键点;母猪群的伪狂犬病免疫工作也是整个猪场伪狂犬病免疫的重中之重。在今后工作中应加强猪场生物安全管理、科学饲养管理、合理制定种猪高效免疫计划,强化定期监测防控意识,果断淘汰病猪,净化猪群,做好综合防治工作。     

猪伪狂犬病病毒流行株gE基因的遗传变异分析及其对仔猪致病性的初步研究

[目的]了解我国猪伪狂犬病病毒流行株 gE基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性。[方法]利用 Vero 细胞从疑似伪狂犬病病毒（PRV）引起的流产死胎猪的脑组织进行病毒分离。通过PCR进行初步鉴定,对分离株 gE基因序列进行系统进化树分析以及该病毒对6周龄左右仔猪的致病性试验。[结果]成功分离到1株 PRV 毒株,命名为 PRV N5B 株,该病毒能在 Vero 细胞上增值,在15代 TCID50达到107.125/0.1 ml;PCR检测可扩增出特异性条带;gE基因全长1740 bp,系统进化树分析表明分离株与2012年以来新流行的毒株属于同一个相对独立的分支,核苷酸同源性高达99.7%～100%;而与以往发表的国内外相关序列比较,在2个不同的位置分别有3个连续碱基的插入。动物试验表明,2 ml的该病毒（106/0.1 ml）滴鼻接种能使6周龄左右仔猪100%死亡。[结论]该研究中的 PRV N5B分离株 gE基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性试验对于目前流行的猪伪狂犬病的防控及新的疫苗的研发提供理论依据。     

猪伪狂犬病病毒流行株gE基因的遗传变异分析及其对仔猪致病性的初步研究（英文）

[目的]了解我国猪伪狂犬病病毒流行株g E基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性。[方法]利用Vero细胞从疑似伪狂犬病病毒(PRV)引起的流产死胎猪的脑组织进行病毒分离。通过PCR进行初步鉴定,对分离株g E基因序列进行系统进化树分析以及该病毒对6周龄左右仔猪的致病性试验。[结果]成功分离到1株PRV毒株,命名为PRV N5B株,该病毒能在Vero细胞上增值,在15代TCID50达到107.125/0.1 ml;PCR检测可扩增出特异性条带;g E基因全长1 740 bp,系统进化树分析表明分离株与2012年以来新流行的毒株属于同一个相对独立的分支,核苷酸同源性高达99.7%~100%;而与以往发表的国内外相关序列比较,在2个不同的位置分别有3个连续碱基的插入。动物试验表明,2 ml的该病毒(106/0.1 ml)滴鼻接种能使6周龄左右仔猪100%死亡。[结论]该研究中的PRV N5B分离株g E基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性试验对于目前流行的猪伪狂犬病的防控及新的疫苗的研发提供理论依据。     

猪伪狂犬病疫苗研究及应用现状

猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的猪的一种急性传染病,对世界养猪业危害严重。疫苗免疫是预防和控制猪伪狂犬病的主要措施之一。目前,国内外临床应用的猪伪狂犬病疫苗包括灭活疫苗、弱毒疫苗和基因缺失疫苗。近年来,随着我国伪狂犬病的反弹和流行,伪狂犬病防控和疫苗研究再次成为研究热点。本文对猪伪狂犬病疫苗的研究及使用现状进行了较为详细的综述。     

猪伪狂犬病毒HN-LD株分离鉴定及部分毒力基因遗传进化分析

为了解湖南省伪狂犬病毒（PRV）病原特征及遗传变异情况,从湖南娄底某猪场采集疑似感染伪狂犬病（PR）病料,通过细胞传代、PCR鉴定、间接免疫荧光试验（IFA）等进行病毒分离鉴定;对该毒株的gC、TK和gE基因进行PCR扩增及测序,分析其变异情况。结果表明,临床病料接种PK15细胞后有1份样品出现细胞病变,经过PCR和IFA鉴定结果表明分离的毒株为PRV（命名为HuN-LD株）,盲传第6代病毒的滴度为10^7.5 TCID₅₀/mL。与参考PRV毒株相比,该毒株gE、TK和gC基因序列与国内流行变异株对应序列同源性最高,与其他毒株同源性相对较低。基于gC基因序列构建的系统进化数分析结果表明,该毒株与国内2011年后流行变异株亲缘关系最近,属于同一分支,但与国外流行的毒株（NIA3和Becker等）相隔较远,属于不同分支。提示成功分离得到1株PRV变异株,该结果可为湖南省PRV流行病学研究及疫苗研发等提供科学依据。     

规模化猪场猪伪狂犬病净化措施的研究

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起的多种家畜、野生动物感染的一种急性传染病。据不完全统计,近几年伪狂犬病在我国的许多省市猪场呈爆发流行趋势[1],给养猪业造成巨大的经济损失,严重制约着我国养猪业的健康发展。本文通过对两个猪伪狂犬病病毒低感染猪场实施长达1年多的伪狂犬病的净化措施（包括免疫、检测、淘汰、消毒、灭鼠、日常管理等）后,发现PRV阳性率明显降低,达到了净化的目的。     

猪伪狂犬病毒C株的分离鉴定

在流行病学调查中分离到的1株伪狂犬病毒,命名为猪伪狂犬病毒C株,并对其进行鉴定、纯化。在gE和gI基因段上设计特异性引物进行PCR检测,闽A株在5 000 bp处出现目的条带,该毒株在1 500 bp附近出现目的条带,对目的条带测序,扩增产物大小为1 538 bp,在第989—4 468位基因缺失,缺失片段大小为3 570 bp,该缺失片段包含了伪狂犬病病毒的主要毒力基因(gE基因),除此缺失片段外,分别在第873、4 665、4 666、4 950位发生了碱基突变,同猪伪狂犬病病毒Bartha K61同源性为95.0%—96.0%,与PRV Bartha K61不是同一个毒株。用该毒株对部分省市分离到的伪狂犬毒株和标准毒株闽A株进行中和试验,中和指数为708—6 761,该毒株可完全中和临床分离的伪狂犬病毒株,故可用作候选疫苗毒株。     

猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI缺失突变株的构建及生物学特性研究

【目的】为研制针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的疫苗提供候选毒株。【方法】构建针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的gE/gI缺失重组转移质粒pMD-LA-RA及携带EGFP标记基因的重组转移质粒pMD-LA-EGFP-RA,将pMDLA-EGFP-RA与伪狂犬病病毒流行毒株PRV AH进行同源重组,利用EGFP为筛选标记,获得携带EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–/EGFP~+,以此毒株与pMD-LA-RA进行第2次同源重组,筛选去除EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–,并通过生长曲线、易感细胞连续传代和动物免疫评价其增殖能力、遗传稳定性及免疫原性。【结果】通过2次同源重组,结合荧光观察、空斑纯化和PCR检测,成功获得了PRV AH gE~–/gI~–,经PCR鉴定、荧光观察及测序鉴定,证实该毒株g E和g I基因被成功缺失,且不携带EGFP标记基因。生物学特性研究结果表明,该毒株增殖能力与亲本毒株相当,遗传稳定性及免疫原性良好。【结论】采用同源重组技术成功构建了免疫原性良好的猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI基因缺失突变株,为研制针对流行毒株的基因缺失疫苗奠定了一定的基础。     

表达PRRSV NADC30-like毒株GP5-M的重组伪狂犬病病毒的构建及其生物学特性探究

为获得一株能够融合表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)GP5-M蛋白的重组伪狂犬病病毒PRV-GP5-M毒株，以猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)变异株TK基因缺失株PRV FJ01/TK-为病毒载体，以gI/gE基因为插入靶点，利用同源重组技术和CRISPR/Cas9技术敲除gI/gE基因，并在gI/gE位置上插入CMV-GP5-M表达盒，经噬斑纯化，成功构建能够正确表达GP5-M蛋白重组病毒PRV-GP5-M。进一步对该毒株的稳定性、生长动力学、培养特性、安全性等生物学特性进行探究。结果表明，该重组毒株具有良好的遗传稳定性、安全性，易于增殖培养。研究结果为靶向PRRSV GP5与M蛋白生成新的PRRSV疫苗提供了新的线索，同时可为预防近些年流行的PRRSV NADC30-like毒株和PRV变异株的疫苗研发提供重要参考。     

辽宁省规模化猪场猪伪狂犬病感染状况的血清学调查

猪伪狂犬病是猪的重要传染病之一,为了了解规模化猪场猪伪狂犬病的感染状况,本研究采用IDEXX公司的阻断ELISA试剂盒对2015年7~11月采自辽宁省3个规模化猪场的1039份血清样品进行了PRV野毒感染的检测与分析。结果表明,猪场1没有感染猪伪狂犬病,猪场2和猪场3猪伪狂犬病的感染较严重,阳性率分别达56%和78%,而且猪场2和猪场3不同猪群的感染情况也有所不同。结果说明,规模化猪场间猪伪狂犬病的感染状况存在着很大的差异。本研究对于了解辽宁省部分地区猪伪狂犬病的流行情况,进而制定正确的防控策略提供了依据。     

规模猪场伪狂犬弱毒疫苗滴鼻免疫的效果

伪狂犬病毒(PRV)在我国猪群中流行广、危害大,伪狂犬病的净化势在必行。对浙江省3家猪场的仔猪进行伪狂犬弱毒疫苗滴鼻免疫试验,并根据gB和gE抗体检测结果调整其免疫程序。结果表明,阳性猪场滴鼻加肌注程序免疫后,在90,120,175日龄gE阳性率分别由69.57%,0%,100.00%降低至41.70%,29.20%和20.80%;阴性和弱阳性猪场2种免疫程序的抗体阳性率变化不显著。研究结果说明滴鼻加肌注的免疫策略优于单独的肌注免疫,在PRV阳性猪场采用滴鼻免疫能阻断PRV的早期感染,保护仔猪不受PRV野毒侵害。     

猪伪狂犬病毒gB基因序列分析

2011年以来我国多省免疫猪伪狂犬病毒gE基因缺失苗猪场出现变异型猪伪狂犬病毒(PRV)感染,经典猪伪狂犬病毒疫苗(Bartha-k61)对该病无法提供100%有效保护,已有研究发现变异型PRV和经典PRV gE基因存在特征性变异。为明确变异型PRVgB基因特征,本研究对GenBank中登录的部分PRV代表株gB基因进行分析比较。结果表明,我国经典型和变异型PRV在gB蛋白氨基酸编码区第395位、453位、562位和739位存在特征性差异,但不同来源PRVgB基因的核苷酸和氨基酸同源性分别在98.1%~100%和96.1%~100%。从相互之间的遗传进化关系可以看出,PRV遗传进化出现两个大的遗传分支,呈现明显的地域性。新发变异型和经典型PRV在中国PRV遗传进化分支上呈现各自独立进化小分支;我国近年分离的貉源和约克夏梗犬源与新发变异型PRV则处于同一进化小分支。