小尾寒羊M yoG基因外显子1的克隆及多态性分析

为促进畜禽育种工作的发展,采用测序法和群体遗传学方法进行数据分析,提取12月龄绵羊血液DNA,依据GenBank中羊MyoG基因序列扩增外显子1,研究小尾寒羊肌细胞生成素(Myogenin,MyoG)基因外显子在群体中的多态性。结果表明:在外显子1第211 bp位存在CT的突变,共得到AA、AB、BB三种基因型。绵羊AA、AB、BB基因型频率分别为0.529,0.353,0.118;等位基因A和B的基因频率分别为0.706和0.294;其中AA基因型频率在0.5以上,为优势基因型。纯合度(Ho)为0.584;杂合度(He)为0.416;有效等位基因(Ne)为1.712;多态信息含量(PIC)为0.330,在0.25～0.50,为中度多态。DNAStar软件对片段同源性对比分析发现其与山羊的同源性为99%,与牦牛的同源性为97%,与猪的同源性为92%。     

安义瓦灰鸡IGF-1基因多态性研究

研究了安义瓦灰鸡IGF-1基因的多态性,检测到该基因第1外显子有1处突变,表现为3种基因型,其中AA基因型的频率最高,BB基因型的频率最低,A等位基因的频率远高于B。多态信息含量分析表明,该位点属于中度多态位点。     

藏绵羊DQA1基因多态性分析

 【目的】研究藏绵羊DQA1基因多态性,确定其等位基因数、核苷酸多态位点、氨基酸多态位点及各等位基因间的遗传关系,同时分析其进化意义。【方法】采用PCR-SSCP方法检测了900只藏绵羊DQA1基因第2外显子多态性;克隆、测序群体内变异产生的各等位基因序列,并分析序列数据。【结果】发现了17个DQA1的等位基因,包括缺失的1种基因,其中5个为发现的新等位基因。16个单倍型序列中发现56个核苷酸多态位点,27个氨基酸多态位点。【结论】藏绵羊DQA1基因第2外显子具有丰富的多态性,群体中可能蕴藏着更多的遗传资源;藏绵羊DQA1基因最初可能是由2个等位基因突变分化成两大类等位基因的;藏绵羊DQA1基因第2外显子序列与牛的DQA1基因第2外显子序列具有较高的同源性,预示绵羊和牛的DQA1基因最早可能来源于它们分歧以前的共同祖先原始序列;DQA1基因在与其相关的特定抗原刺激下发生的免疫应答反应在绵羊和牛上具有相似性;新等位基因C的139位发现了1个新的核苷酸突变位点（A/G）,属同义突变;5个新发现的DQA1等位基因遗传关系较近,可能由同一等位基因突变产生。     

绵羊IGF-Ⅰ和IGF-Ⅰ R基因特征分析及其在肌肉组织中的表达差异

为了比较IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因在绵羊肌肉中的表达差异,根据GenBank公布的绵羊IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因mRNA序列设计特异性引物,采用实时定量PCR方法检测其在甘肃‘高山细毛羊’及其与南非肉用‘美利奴’杂交F1代(南甘F1代)羔羊肌肉组织中的表达量.利用生物信息学软件分析了绵羊IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因结构,并构建系统进化树,探讨了其生物学功能.结果表明:南甘F1代羔羊肌肉组织中IGF-Ⅰ基因的表达量显著高于‘甘肃高山细毛羊’(P0.05),而IGF-ⅠR基因的表达量在南甘F1代羔羊和‘甘肃高山细毛羊’肌肉组织中没有显著变化(P0.05).绵羊IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因分别含有465bp和4 518bp的完整开放阅读框,编码154个和1 505个氨基酸;其蛋白质分子量分别为17 011.71U和169 267.26U,等电点分别为9.36和6.70;IGF-Ⅰ基因信号肽切割点分别位于49~50位氨基酸之间,而IGF-ⅠR基因不含信号肽;IGF-Ⅰ基因编码产物的二级结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主,位于细胞核的可能性最高(62.5%);IGF-ⅠR基因编码产物的二级结构主要以无规则卷曲为主,位于细胞质的可能性最高(34.8%);IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因分别作为激素和信号传感器参与机体生物学过程.     

绵羊生长激素基因第4外显子的多态性分析

采用PCR-SSCP技术检测包括蒙古羊、小尾寒羊、德国美利奴羊以及德美寒杂交一代在内的绵羊生长激素(GH)基因第4外显子的多态性.结果表明:在1188~1502 bp片段上,德国美利奴羊及杂交后代中,AA型个体占多数,而小尾寒羊则以BB型个体为主.对这个片段的纯合型(AA,BB)分别进行克隆测序发现:1188~1502 bp片段上,AA型在第1406位发生了T→C的突变.实验结果证实绵羊生长激素基因第4外显子存在序列多态性.     

绵羊TTF-1基因的克隆及DNA多态性分析

自行设计2对引物,采用PCR方法从绵羊基因组中扩增获得2条目的片段,将其克隆转化并进行酶切鉴定及测序分析,结果表明所得序列为绵羊甲状腺转录因子-1(TTF-1)基因第1和第2外显子片段(GenBank登录号分别为DQ010919和DQ010920).分析发现,2条序列分别由318和249个核苷酸组成,编码105和82个氨基酸组成的多肽.同源性比对显示,绵羊TTF-1基因的核酸和蛋白质序列在分子进化上相当保守.利用PCR-SSCP方法对TTF-1基因在不同繁殖力绵羊品种间的DNA多态性检测表明,2个克隆片段的核酸序列在品种间无差异.     

威宁绵羊和贵州半细毛羊FecB 基因SNP 分析

利用威宁绵羊和贵州半细毛羊构建DNA池,设计11对引物扩增其Fec B基因外显子和部分内含子的序列,对纯化后的PCR产物双向测序,分析确定多态性位点。然后利用生物信息学软件分析SNPs位点对Fec B基因RNA二级结构、Fec B蛋白结构的影响。结果显示,在扩增的Fec B基因中筛选到10个SNPs,其中exon5-A39G、exon9-C37A、exon11-C87A、intron2-A62G、intron4-A1023G、intron10-G24A突变为威宁绵羊和贵州半细毛羊中所共有,而exon9-A8G和intron1-G243A突变为威宁绵羊所特有,intron3-G177A和exon8-T86C突变为贵州半细毛羊所特有。上述的SNPs中,exon5-A39G和exon9-A8G为错义突变,exon5-A39G突变导致编码的异亮氨酸(Ile)变为缬氨酸(Val),exon9-A8G突变导致编码的天冬酰胺(Asn)变为天冬氨酸(Asp);exon9-C37A和exon11-C87A多态位点均未改变氨基酸的编码,为同义突变。     

藏绵羊孕酮受体基因第4外显子多态性分析

以391只藏绵羊为研究对象,采用PCR-SSCP技术分析孕酮受体(PGR)基因第4外显子在藏绵羊中单核苷酸多态性(SNPs),探讨PGR的生理功能及其对藏绵羊繁殖力的影响。结果表明:PGR基因扩增片段在藏绵羊品种中存在PCR-SSCP多态性,序列比对分析发现2个SNPs位点,全为颠换。在该群体中发现3种基因型,分别为AA、BB和AB,其中AA为优势基因型,A为优势等位基因。χ2独立性检验表明,PGR基因扩增片段上各基因型呈极显著差异。     

7个绵羊品种PGR基因第4外显子多态性分析

为探索绵羊PGR基因第4外显子的多态性,采用PCR-SSCP技术,对‘德克塞尔羊’、‘无角陶赛特羊’、‘小尾寒羊’、‘蒙古羊’、‘德国美利奴羊’、‘滩羊’和‘藏羊’7个绵羊品种共计414个个体的PGR基因第4外显子进行了遗传多态性检测分析.结果表明:绵羊PGR基因第4外显子存在多态性,发现了AA、BB和AB 3种基因型.不同基因型PCR产物测序结果显示,该多态的产生是由于PGR基因第4外显子扩增序列的第227bp处发生了C→T的碱基突变.基因型和基因频率统计结果表明,‘小尾寒羊’同时存在AA、BB和AB 3种基因型,‘无角陶赛特羊’和‘德国美利奴羊’只存在AA基因型,而其他品种存在AA和AB 2种基因型;在所检测的品种中,AA基因型为优势基因型,A等位基因均为优势等位基因.χ2适合性检验结果表明,7个绵羊品种在该基因座位都处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05).不同基因型在7个绵羊品种间分布的独立性检验结果表明,在该位点,‘无角陶赛特羊’与‘藏羊’之间表现为差异极显著(P<0.01);‘无角陶赛特羊’与‘蒙古羊’和‘滩羊’之间,‘德国美利奴羊’与‘滩羊’和‘藏羊’之间均表现为差异显著(P<0.05);‘无角陶赛特羊’与‘德国美利奴羊’只发现同一种基因型,不存在差异;其他绵羊品种之间均表现为差异不显著(P>0.05).多态信息含量(PIC)分析结果表明,‘无角陶赛特羊’和‘德国美利奴羊’在该位点没有多态,其他属低度多态.     

绵羊肌肉生长抑制素基因外显子Ⅰ单核苷酸多态性分析

利用PCR-SSCP和DNA测序法,检测了德国肉用美利奴、特克塞尔、多浪羊和陶塞特等4个绵羊品种肌肉生长抑制素基因外显子Ⅰ的单核苷酸多态性。研究结果表明:在德国肉用美利奴肌肉生长抑制素基因外显子Ⅰ第 84位(相对翻译起始位点ATG)发现G→A的突变,但仅存在两种基因型,即GG和GA,基因型频率分别为0.6944和0.3056。该突变位点编码的氨基酸序列不发生改变,在其余样品均未检测到多态。     

威宁黄牛SOCS1基因外显子区SNP与体尺性状关联性研究

为研究SOCS1基因突变对威宁黄牛生长性能的影响,以106头威宁黄牛为研究对象,采用SSCP、DNA测序方法分析SOCS1基因外显子区SNP与不同个体体尺性状的相关性。结果显示：A＋815C位点在威宁黄牛中有不同分型,在威宁黄牛公畜中,A＋815C位点与体高、体直长有极显著关联,CC基因型个体体高、体直长均值最大,为有利基因型,对胸深的影响达到显著性水平,具有杂合子优势;在母畜中,A＋815C位点对胸围的影响达到显著水平,杂合子 AC基因型个体胸围均值最大。     

新疆巴什拜羊不同毛色与有关基因多态性分析

【目的】以不同毛色(红棕色73只,黑色53只,青灰色40只)新疆巴什拜羊为研究对象,采用PCR-SSCP技术检测ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因多态性,并分析其与被毛表型的相关性。【方法】采用随机抽样的方法选取出三种毛色的巴什拜羊,用枸橼酸钠抗凝管进行采血。运用软件PIC-CALC和POPGENE 32计算巴什拜羊ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因的多态信息含量和基因型频率、等位基因频率、纯合度、杂合度、有效等位基因数,并对该位点基因型的分布进行Hardy-Weinberg平衡的卡方检验。将所得数据输入Excel表中进行整理,并用SPSS 19.0软件进行差异性分析。【结果】ASIP基因在不同毛色的巴什拜羊群体中有两种基因型分别为AA型和AB型,等位基因B为红色被毛群体中的优势等位基因;等位基因A为黑色和青灰色两种被毛群体中的优势等位基因。处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05),红色被毛多态信息含量处于中度多态,而黑色和青灰色被毛多态信息含量处于低度多态。TYR基因在不同毛色的巴什拜羊群体中有两种基因型分别为AA型、AG型和GG型,等位基因G为3种毛色的优势等位基因TYR基因在巴什拜羊黑色和青色被毛群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05),而红色被毛群体中处于不平衡状态(P<0.05)。TYRP1基因存在两种基因型:AA型和GG型,等位基因A为红色和青灰色两种毛色的优势等位基因;等位基因G为黑色被毛群体的优势等位基因。TYRP1基因在巴什拜羊群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态。红色被毛多态信息含量处于高度多态,黑色和青灰色被毛多态信息含量处于低度多态。TYRP2基因PCR-SSCP检测结果没有显示多态。【结论】ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因多态性与巴什拜羊的毛色性状有相关性。     

绵羊IGFBP-1基因的克隆及序列分析

试验以凉山半细毛羊为研究对象,采用RT-PCR方法克隆了IGFBP-1基因的CDS全序列,生物信息学方法深入分析其序列。结果表明,IGFBP-1基因的CDS序列为792 bp,编码263个氨基酸,与牛、人、鼠的CDS同源性分别为97%、76%和74%,氨基酸序列同源性分别为97%、69%和71%,Gen Bank登录号为FJ589639.1;IGFBP-1基因的氨基酸分子量为27.8 k D,理论等电点(p I)为5.99;进化分析显示与牛、山羊等哺乳动物关系较近,与鸡、鱼类等亲缘关系较远;IGFBP-1基因存在明显的疏水性区域和亲水性区域,有一个信号肽、一个跨膜区、16个磷酸化位点、6个N-糖基化位点和8个O-糖基化位点;二级结构分析显示无规卷曲、α-螺旋和β-折叠区域分别为61.98%、24.33%、13.69%;三级结构分析显示存在IGFBP_N和甲状腺球蛋白-Ⅰ型功能域。为进一步研究绵羊IGFBP-1基因的功能奠定基础。     

5个绵羊群体的BMPR-IB基因多态性分析

选择骨形态发生蛋白受体IB基因(BMPR-IB)作为一种侯选基因.采用PCR-RFLP方法检测其在杜泊绵羊、湖羊、小尾寒羊及杜湖、杜寒杂交F1代群体中的多态性分布规律.结果显示:在杜泊绵羊中只存在1种基因型,即野生型( );在湖羊和小尾寒羊中检测到两种基因型,纯合突变型(BB)和杂合突变型(B );湖羊中BB、B 基因型频率分别为0.909和0.091,小尾寒羊中BB、B 基因型频率分别为0.563和0.437;在杜湖和杜寒杂交绵羊中发现两种基因型(B 和 ),杜湖羊B 和 基因型频率分别为0.875和0.125;杜寒羊B 和 基因型频率分别为0.786和0.214.BMPR-IB分子标记可作为一种新颖的辅助技术用于评估杜泊绵羊与湖羊或小尾寒羊杂交后代的繁殖力.     

宁夏滩羊FSHR基因多态性研究

[目的]研究宁夏滩羊卵泡刺激素受体（FSHR）基因的多态性,为其繁殖提供理论基础。[方法]采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法（PCR-RFLP）,对该群体111只健康滩母羊FSHR基因多态性进行检测。[结果]扩增出306 bp目的片段,PCR产物被限制性内切酶AluI消化后表现出多态性,共检测到3种基因型：GG、CG和CC。其中GG型15个,基因型频率为0.135 1;CG型74个,基因型频率为0.666 7;CC型22个,基因型频率为0.198 2。等位基因G的基因频率为0.468 5,而等位基因C的基因频率为0.531 5。[结论]宁夏滩羊FSHR基因具有多态性。     

绵羊SMAD1基因组织表达及其多态性与产羔数关联分析

【目的】绵羊产羔数是一个极其复杂的性状,受诸多因素影响。绵羊排卵数是最重要的因素之一,而SMAD蛋白在哺乳动物卵泡发育和颗粒细胞生长分化过程中发挥着重要作用。因此本文基于前期绵羊基因组重测序数据,深入研究SMAD家族成员1 (SMAD family member 1, SMAD1)基因在不同繁殖力小尾寒羊组织表达模式,并探讨其多态性与绵羊产羔数的关系,以揭示其影响产羔数的机制,为绵羊分子育种提供科学依据。【方法】首先,采用反转录PCR技术检测SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊群体大脑,小脑,下丘脑,垂体,子宫,卵巢,输卵管,心脏,肝脏,脾脏,肺脏,肾脏,肾上腺,甲状腺,大肠,小肠,胰腺,瘤胃,肾脂 19种组织的表达模式,然后利用实时荧光定量PCR技术检测SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊下丘脑,垂体,子宫,卵巢,输卵管5种繁殖组织的相对表达量。随后采用Sequenom MassARRAY ^?SNP技术对SMAD1基因5个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点在小尾寒羊（n=380）、湖羊（n=101）、苏尼特羊（n=21）、草原型藏羊（n=161）、策勒黑羊（n=52）、滩羊（n=22）6个绵羊品种中进行基因型检测,计算其群体遗传学指标,利用SPSS19.0软件分析5个SNPs与小尾寒羊产羔数的相关性。【结果】PCR结果显示,SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊全身性组织均有表达,在小尾寒羊单羔群体卵巢的表达量极显著高于多羔群体（P<0.01）,小尾寒羊单羔群体下丘脑、垂体的表达量显著高于多羔群体（P<0.05）;基因分型结果表明,g.12485895A>G,g.12487558G>A和g.12487190G>T位点在单、多羔绵羊品种中基因型和等位基因频率均差异显著（P<0.05）;而g.12508874T>C和g.12487467A>G位点在单、多羔绵羊品种中基因型和等位基因频率均差异不显著（P>0.05）;群体遗传学分析表明,g.12485895A>G、g.12487558G>A、g.12508874T>C、g.12487467A>G、g.12487190G>T位点在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、苏尼特羊、草原型藏羊中均为中度多态（0.25<PIC<0.5）,g.12508874T>C位点在滩羊群体表现为低度多态（PIC<0.25）;卡方适合性检验表明,g.12485895A>G和g.12487467A>G位点在小尾寒羊和草原型藏羊中处在Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.05）,g.12487558G>A在小尾寒羊和湖羊群体处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.05）,g.12487190G>T位点在草原型藏羊处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.05）。其他位点在6个绵羊品种中均处在Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）;关联分析表明,g.12485895A>G,g.12487558G>A,g.12508874T>C和g.12487467A>G位点与小尾寒羊产羔数无显著关联。g.12487190G>T位点TT基因型母羊前三胎的产羔数均显著高于GT和GG基因型母羊（P<0.05）。将该位点与小尾寒羊FecB（A746G）不同基因型进行组合后发现,AA-GG、AA-GT、AA-TT型母羊产羔数显著低于其他组合基因型母羊（P<0.05）。【结论】SMAD1与小尾寒羊繁殖密切相关,g.12487190G>T可作为小尾寒羊产羔性状选育的潜在分子标记。     

水貂IGF-1R基因SNPs筛查及其与生长性状的关联分析

为分析IGF-1R基因部分SNPs与银蓝水貂与美国短毛黑水貂2个群体生长性状的关联性。以同龄同场的银蓝水貂和美国短毛黑水貂为研究对象,采用PCR产物直接测序法筛查IGF-1R基因CDS序列的多态位点,利用SPSS(19.0)软件GLM统计模型分析基因SNPs不同基因型与水貂生长性状的相关性。在线软件对IGF-1R基因进行生物信息学分析。结果表明:在IGF-1R基因外显子2和外显子8分别检测到G207A同义突变和G1782A同义突变,根据测序峰图对2位点进行基因分型。群体遗传学分析显示,G207A位点在银蓝水貂群体中属于低度多态,G1782A位点在银蓝水貂群体中属于中度多态,G207A和G1782A 2个位点在美国短毛黑水貂中均为中度多态;χ~2检验表明,银蓝水貂和美国短毛黑水貂群体在2个突变位点处于HardyWeinberg平衡状态(P0.05);关联分析表明,G1782A位点与美国短毛黑水貂的体重显著相关(P0.05),突变纯合子AA基因型个体的体重值显著高于GG基因型个体和GA基因型个体。因此G1782A位点适合于短毛黑水貂体重的分子标记选择。     

湖北白猪IGF-1基因的克隆及序列分析

[目的]以湖北白猪肝脏作为试验材料,克隆出湖北白猪胰岛素生长因子（IGF-1）基因,并对其序列进行分析。[方法]采用Trizol法从湖北白猪的肝脏中提取总RNA,将其作为RT反应的模板,用P2（5＇-CAGGTAACTCGTGCAGAGCAAAGGA-3＇）引物合成IGF-1基因cDNA第一链,以其产物为模板,再以P1（5＇-CCCATCTCCCTGGATTTCTTTTTG-3＇）和P2为上下游引物扩增到大小约为607bp的产物,并将其克隆至pCRII载体上,经蓝白斑筛选、酶切、测序。[结果]经筛选、酶切、序列分析,表明该片段为IGF-1基因的cDNA克隆,它由607个核苷酸组成,其中1～145位是5＇端非翻译区,从第146位ATG起始密码子开始至第538位TAG终止密码子,539～607位是3＇端非翻译区,包含一完整的ORF,该ORF共有393核苷酸,编码一个推断由130个氨基酸组成的多肽。与GenBank中的序列比较,该序列与Muller等报道的猪IGF-1基因编码序列完全同源。[结论]成功克隆了湖北白猪IGF-1基因,并对其进行序列分析,证实了IGF-1基因的高度保守性,为采用转基因技术对湖北白猪进行育种奠定了基础和提供了技术依据。