白斑综合征病毒胶体金免疫层析试剂板的研制

将胶体金免疫层析技术应用于对虾白斑综合征的诊断,研制了一种检测对虾中白斑综合征病毒的胶体金免疫层析试剂板。将胶体金标记的抗白斑综合征病毒单克隆抗体包被在金标垫上,将抗白斑综合征病毒多克隆抗体和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上。通过双抗体夹心法检测样品中白斑综合征病毒含量。结果表明,该试剂板对白斑综合征病毒的最低检出限为1.0 mg/kg,特异性好,稳定性高,整个检测所需时间为8~10 min,适合现场快速检测。     

WSSV和IHHNV对虾病毒的胶体金免疫层析快速检测

为了快速、方便地检测出这2种病毒,研究将PCR核酸扩增的高灵敏度和胶体金免疫层析技术快速、简便、直观的优点结合起来,建立了同时检测2种对虾病毒(WSSV和IHHNV)的同步PCR-胶体金免疫层析检测方法。采用了生物素标记和地高辛(Digoxigenin)标记引物。PCR扩增产物利用胶体金免疫层析技术进行检测。胶体金免疫检测试剂条的检测线(T线)处的层析膜处点上地高辛的单抗,经地高辛标记的PCR扩增产物可在T线上被检测到,在10 min内即可得到检测结果。同时,在PCR过程中使用UNG(尿嘧啶-DNA糖基酶),极大地控制了遗留污染。通过此方法检测对虾WSSV和IHHNV病毒的灵敏度均可达到10~100个拷贝,高于国家标准PCR检测法10~100倍。此检测方法让工作人员避免了接触有毒和诱导突变的试剂,免除基层检测实验室购买电泳设备和荧光检测系统的投资。     

豚鼠气单胞菌胶体金免疫层析试纸条的研制

采用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体分泌细胞株,获取抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体,柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金颗粒,选择直径20 nm的胶体金颗粒,标记抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体并制备胶体金垫。将胶体金垫与喷涂有抗豚鼠气单胞菌兔多克隆抗体和羊抗鼠抗体的硝酸纤维素膜及样品吸收垫等组装成免疫层析试纸条,建立豚鼠气单胞菌的快速检测方法。用灭活细菌与血清混合的模拟样本测定试纸条的特异性、灵敏度,结果显示,试纸条对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌等13种常见病原菌没有交叉反应,与豚鼠气单胞菌显示特异性反应,检测灵敏度为1×10⁶ CFU/mL,结果显示时间小于5 min。研制的豚鼠气单胞菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高、适用于基层临床生产推广应用等优点。     

哈维氏弧菌胶体金免疫层析试纸条的制备

用18~20nm胶体金标记抗哈维氏弧菌Vibrio harveyi抗体并制备金标垫,分别将羊抗兔Ig G和纯化后的抗哈维氏弧菌抗体包被于NC膜上作为质控线和检测线,组装制作了哈维氏弧菌胶体金免疫层析试纸条,优化了该试纸条的制作条件,测试了其性能。结果表明:所制备的哈维氏弧菌免疫层析试纸条具有较好的特异性,与费尼斯弧菌Vibrio furnissii、维氏气单胞菌Aeromonas veronii、美人鱼发光杆菌Photobacterium damselae、类志贺邻单胞菌Plesiomonas Shigelloides、鱼肠道弧菌Vibrio ichthyoenteri、鳗利斯顿氏菌Listonella anguillarum、迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda、海豚链球菌Streptococcus iniae、嗜水气单胞菌Aeromonas Hydrophila等9种常见水产病原菌无明显交叉反应,检测灵敏度为3×105CFU/m L,5~10min即可得出检测结果,具有快速、简便、特异性强和适应基层推广应用等优点,可用于养殖鱼类病原哈维氏弧菌的现场检测。     

胶体金免疫层析快速检测在水产养殖中的运用

胶体金免疫层析快速检测(CICA)是在免疫渗透的基础上所研制出来的一种快速检验方式,它被广泛应于用水产养殖领域,凭借其超精准的结果被称之为当前最快捷、高敏感的一种免疫学检测技术。该项技术真正实现了快速简易检测靶目标,并已在畜牧业中得到普及应用,成为当前畜禽病害早期防控的最有效方法之一。介绍了GICA的原理及其在水生动物检疫、水产品质量检测、水产养殖投入品检测中的应用,并对该技术在水产养殖业的应用做了展望。     

白斑综合征病毒卵黄抗体对凡纳滨对虾免疫相关酶活力和抗病毒能力的影响

摘要：免疫活性物质可以调动或激活虾类自身的免疫系统,提高动物的免疫机能,增强动物的抗病毒能力。有关卵黄抗体对对虾体内酶活力及抗病毒能力的影响,国内外尚未见报道。本实验通过连续投喂的方法,用3个水平(1%、0.5%、0.1%)的Ig-Guard(shrimp)制成的试验饲料,同时以基础饲料为空白对照饲喂凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) 20 d,分别测定了第5,10,15,20 d血淋巴的酚氧化酶(PO)、溶菌酶(UL)、酸性磷酸酶(ACP)及肌肉匀浆液的超氧化物歧化酶(SOD)等非特异性免疫因子活性,并对血清及肌肉匀浆液中蛋白进行定量。结果表明,免疫组的PO、UL、ACP、SOD活力均显著高于对照组(P<0.05)。免疫20 d后,用白斑综合征病毒(WSSV)投喂感染。攻毒后第7 d各免疫组的相对免疫保护率分别为17.95%、23.08%、35.90%。实验结果说明,Ig-Guard(shrimp)能有效提高对虾免疫因子的活性,对于提高抗WSSV感染能力也有一定作用。将对虾免疫因子活性和累计死亡率协同分析,摄食低浓度Ig-Guard(shrimp)组较之高浓度组的酶活力高,其累计死亡率低,故笔者建议适当地投喂低浓度Ig-Guard(shrimp)更为合理。     

胶体金免疫层析快速检测技术及其在水产养殖业中的应用前景

建立快速、准确、简便易行的病害早期快速检测技术,是从事动物疫病防控研究工作者和产业界人士的迫切愿望。自从开辟免疫分析技术以来,越来越多更灵敏、更便捷的免疫分析方法被开发出来,以胶体金免疫层析法为基础建立起来的快速检测试纸,被认为是当前最快捷、高敏感的一种免疫学检测技术。该项技术真正实现了快速简易检测靶目标,并已在畜牧业中得到普及应用,成为当前畜禽病害早期防控的最有效方法之一。本文就该项技术在畜牧兽医领域的研究进展、应用现状、发展前景进行了介绍、分析和讨论,旨在为水产养殖动物病害的早期诊断提供借鉴,以期获得一种适用于水产动物病害的、专用的快速检测新技术和新产品。     

感染白斑综合病毒（WSSV）对虾相关免疫因子的研究

129尾中国对虾（Penaeus chinensis)分别捕自未暴发白斑综合症（WSSV病毒所致）虾池、WSSV暴发虾池以及曾暴发WSSV虾池。用斑点杂交和组织病理学方法确定各尾对虾的染毒（WSSV）程度。用96孔酶标板法测量相应个体血淋巴上清液的抗菌活力（Ua)、溶菌活力（UL）、酚氧化酶（PO）活性以及过氧化酶（POD）相对活性；用硝酸纤维膜斑点法测定其碱性磷酸酶（ALP）相对活性；用血凝法测定其凝集效价（HAT）。通过对以上免疫指标进行统计分析，结果表明，WSSV感染与对血淋巴PO活性以及ALP相对活性变化有紧密联系；不同虾池各免疫因子差异显著，发病虾池虾样各免疫指标平均值均低于其他虾池；曾发病虾池的虾样PO活性较强；WSSV与HPV感染无统计学意义上的相关性；未发病虾池与曾发病虾池实验对虾的Ua与UL相关性极显著，发病虾池实验对虾Ua与UL呈负相关；发病虾池对虾PO与ALP活性相关性显著。不同性别中国对虾血淋巴上清液的免疫因子活性没有显著差异。     

白斑综合征病毒感染与对虾的免疫防御反应

对虾白斑综合征病毒（WSSV）感染对虾后，最典型的免疫反应是对虾开放循环系统的血淋巴细胞数量急剧下降，血淋巴凝结功能下降，感染部位聚集了大量的血淋巴细胞，且以颗粒细胞为主。WSSV可感染对虾颗粒细胞和小颗粒细胞，其中小颗粒细胞感染率高、感染速率快，感染后大颗粒细胞占血细胞总数的比例可增加到50％；血淋巴中的总糖、总碳水化合物、总蛋白和游离氨基酸显著提高，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和诱导性一氧化氮合成酶的活性显著降低。自然状态下广泛存在WSSV潜伏感染，潜伏感染的存在会导致存在免疫反应情况下的感染复发，并且有助于病毒的传播；不同WSSV感染状态下过氧化物（POD）差异显著，其平均值由大到小依次为：潜伏感染虾样、中度感染虾样、严重感染虾样。而其抗菌活性（UA）、溶菌活性（UL）、酶氧化酶活性（PO）、碱性磷酸酶（ALP）和凝集效价（HAT）差异不显著；潜伏感染个体对再次接种WSSV有“类免疫应答”的抗性，这种抗性不是来源于发病期对虾的天然抗性，而是WSSV感染后的一种免疫系统增强。宿主细胞凋亡可能是感染对虾在高温时反而维持较高成活率的主要机制。免疫增强剂可对对虾防御WSSV感染产生影响，脂多糖、葡聚糖、肽聚糖、岩藻依聚糖和双链核糖核酸都已被证实可提高对虾抗病毒感染的免疫保护。WSSV主要囊膜蛋白VP28可诱导对虾对WSSV感染产生抗性降低累积死亡率，高效价的病毒抗血清具有良好的保护作用；对虾抗菌肽也可通过抑制病毒的复制而起保护作用。     

河豚毒素胶体金免疫层析快速检测试剂盒的应用研究

在我国东南沿海地区,每年均有人因食用带有河豚毒素的河豚鱼或织纹螺引起中毒的事件。本文以河豚毒素标准品溶液分析河豚毒素胶体金层析快速检测卡的最低检测出限为0.5 MU/mL或100 ng/mL。根据河豚毒素限量值(10 MU/g)设计了织纹螺以及河豚鱼的样品前处理方法,进一步分析了20个织纹螺及河豚鱼实际样品,准确率为100%,单个样品测试时间为20 min。结果表明:河豚毒素胶体金层析快速检测卡具有灵敏度高、特异性好、操作简便、可通过肉眼直接判读结果的特性,尤其适合于基层检测机构、渔业管理单位及水产品加工企业对河豚鱼或织纹螺中河豚毒素的快速筛查与分析。     

甲基睾酮免疫胶体金试纸条的研制及在水产品中的应用

通过研究胶体金免疫层析技术,建立了一种快速检测水产品中甲基睾酮含量的方法。将待测样品中的甲基睾酮和试纸条检测线上包被的人工抗原(MT-BSA)竞争性结合金标结合垫上包被的胶体金-甲基睾酮单抗聚合物,根据检测线呈现的红色线条深浅来判定样品的阴阳性。结果显示:试纸条上MT-BSA抗原工作浓度为1.0mg/m L,羊抗鼠二抗工作浓度为1.5 mg/m L,试纸条的最低检测限达到10μg/kg,与甲基睾酮类似物的交叉反应率低;使用甲醇提取,4倍PBST稀释,整个检测所需时间仅10~15 min,适用于大规模样品筛选。     

白斑综合征病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因保守序列,利用Primer Explorerv 4.0软件设计了4条引物,建立了白斑综合征病毒环介导等温扩增快速检测方法,对反应温度和反应时间等参数进行了优化,同时将建立的LAMP检测方法与巢式PCR进行了比较分析。结果表明,LAMP最适反应在64℃恒温条件60min内完成,凝胶电泳呈现梯型条带;反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色的阳性结果明显区别于橙色阴性结果。LAMP方法的最低检出限为100拷贝/μL,灵敏度较巢式PCR高100倍,而且LAMP方法在1h内即可完成检测,操作简单,无需复杂仪器,肉眼可直接观察检测结果。用建立的LAMP方法对临床发病南美白对虾样品进行了检测,结果表明,LAMP方法适合对虾白斑综合征病毒的现场快速检测。     

利用试剂盒检测对虾白斑综合症病毒

对虾白斑综合症病毒(wssv),又称对虾杆状病毒或皮下造血组织坏死杆状病毒,是迄今为止危害对虾养殖最为严重的一种病害.发病期一般在幼体期到生长期,死亡率可达100%,该病毒的流行给我国对虾养殖业造成了巨大的经济损失,成为对虾养殖业可持续发展的主要障碍之一.     

对虾白斑综合征病毒蛋白质组的研究进展

白斑综合征病毒WSSV(White Spot Syndrome Virus,WSSV)是引起对虾大规模死亡的主要病毒性病原,且该病毒感染的宿主广泛。自WSSV基因组全序列公布以来,国内外的学者对WSSV的研究热点转移到该病毒基因产物功能的相关研究上面来。弄清WSSV感染机理是有效防治病毒的基础,而对其感染机理的阐释则主要是搞清病毒各蛋白在感染中的作用,这些是WSSV蛋白质组学的研究内容之一。分析WSSV蛋白同时可以在分子水平上为研究海洋和陆地生物病毒的进化趋势提供有力的基础。     

WSSV蛋白酶性质的研究

从感染白斑综合症病毒(Whitespotsyndromevirus,WSSV)的对虾中提取和纯化WSSV,对其蛋白酶活力进行分析。结果表明,WSSV蛋白酶具广泛的pH稳定性,当pH达7.5时,蛋白酶活性最大;pH高于10 0时,酶活力很低,其蛋白酶偏碱性。丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)对酶活性有抑制作用。Ca2 、Mn2 、Fe2 和Cu2 可降低WSSV蛋白酶活性,但Mg2 有轻微的激活作用。胰蛋白酶抑制剂在浓度为12.5～25.0mg/L时,对WSSV蛋白酶活性无影响。Leupeptin使蛋白酶活性降低12.29%。Chymostatin在质量浓度为12.5～25.0mg/L时,对WSSV蛋白酶活性有强烈的抑制作用,表明WSSV蛋白酶类属胰凝乳蛋白酶。蛋白质修饰剂对WSSV蛋白酶活性影响的研究结果表明,组氨酸残基为WSSV蛋白酶活性基团,而巯基为非必需基团,说明WSSV蛋白酶为非巯基依赖型的蛋白酶。     

对虾白斑综合征病毒VP28酵母表面展示

以pYD1为载体,制备以酒精酵母为载体的基因工程免疫制剂。参照GenBank中对虾白斑综合征病毒VP28基因序列设计引物,PCR扩增得到预期长度的产物,双酶切插入用于酒精酵母表面展示的穿梭质粒载体pYD1,转化大肠杆菌TOP10,提取阳性质粒转化酒精酵母菌株EBY100,诱导表达后,用免疫荧光检测外源蛋白的表达。结果获得VP28酵母表面展示菌,测得最佳诱导时间为36～48h。以此展示酵母活细胞分设两个浓度组,腹腔注射螯虾,检测其毒性。结果表明,此重组酵母对螯虾是安全的,该研究为下一步对虾用活载体免疫制剂效果的研究奠定了基础。     

Development of a multiplex PCR system for the simultaneous detection of white spot syndrome virus and hepatopancreatic parvovirus infection

A multiplex PCR kit for simultaneous detection of white spot syndrome virus (WSSV) and hepatopancreatic parvovirus (HPV) was developed and field testing was conducted. A 604‐bp target sequence was selected from the vp28 gene of WSSV. A primer set was developed to amplify a 338‐bp DNA fragment at the junction of the NS2 and NS1 protein genes of HPV after alignment of eight sequences from different strains. Another internal positive control primer set produced a 139‐bp PCR fragment from the β‐actin gene by alignment of this gene from Litopenaeus vannamei, Fenneropenaeus chinensis and Penaeus monodon. The detection limits, tested using purified plasmids, for WSSV and HPV were 21.4 and 19.0 copies respectively. The optimum ratio for HPV, WSSV and β‐actin was 3:1:1, with an optimum annealing temperature of 57°C. Field test of the multiplex PCR with 170 L. vannamei individuals from 17 aquaculture farms showed 41.8% coinfection with WSSV and HPV, and 40.0% and 3.5% single infection with WSSV and HPV respectively. No virus‐free shrimp farm was found. Ten wild catch F. chinensis individuals showed 60% coinfection, and 40% were infected with HPV.     

Melanin-containing feedstuffs protect Litopenaeus vannamei from white spot syndrome virus

International Aquatic Research - Viral diseases are a serious issue for the shrimp aquaculture industry. White spot syndrome virus (WSSV) has been considered one of the most dangerous pathogens...