奶牛卵母细胞体外受精和胚胎培养研究

[目的]探讨适合于奶牛体外胚胎生产的最佳条件。[方法]以奶牛卵母细胞为试验材料,研究不同温度、运送时间对奶牛卵母细胞成熟的影响,并比较在相同培养条件下孤雌激活和体外受精对奶牛卵母细胞胚胎发育的影响。[结果]卵巢在37—42℃运输后的成熟率（11．3％）明显低于20—30℃、30-37℃的成熟率（79．3％,85．1％）,20～30℃、30～37℃组间差异不显著;运送时间6h后的卵母细胞成熟率（53．2％）明显低于4h内、4—6h的成熟率（85．6％,77．8％）,4h内、4～6h差异不显著;孤雌激活和体外受精胚胎在相同条件下的卵裂率（72．41％,68．18％）、8细胞率（45．24％,47．22％）、囊胚率（25．60％,18．89％）差异均不显著。[结论]卵巢在30℃左右4h内运回实验室最适宜,而孤雌激活和体外受精胚胎在相同条件下发育率差异不显著。     

玻璃化法冷冻保存牛体外受精胚胎

本研究探讨了玻璃化冷冻保存对牛体外受精胚胎冷冻后存活的影响。7日龄的胚胎在10％甘油＋20％丙二醇的玻璃化冷冻液中，室温下停温10min，其孵化率为86．6％，与对照的83．2％相比，无明显影响（P＞0．05）。然10％甘油＋20％乙二醇，25％甘油＋25％乙二醇及25％甘油＋25％丙二醇均明显降低胚胎的孵化率（P＜0．01）。7日龄胚胎经10％甘油及10％甘油＋20％乙二醇依次平衡5min后,再置于25％甘油＋25％乙二醇的冷冻液中，20s内投液氮玻璃化冷漠，冻后孵化率达80．8％，明显高于其它平衡方法。冷冻液为25％甘油＋25％乙二醇的胚胎冻后总孵化率为72．1％，明显高于25％甘油＋25％丙二醇的60．9％。这些结果表明：牛胚胎玻璃化冷冻保存的成功率在很大程度上取决于防冻剂的种类、浓度及平衡方法。     

山羊卵巢卵母细胞的体外受精试验

将18枚细胞质均匀、包有完整致密卵丘细胞的山羊小卵泡(2～5mm)卵母细胞培养于含有hCG(20μg/mL)和FCS(10％)的TCM_(199)中30h,然后用经含有肝素(20μg/mL)和BSA(10mg/mL)的BO液诱导获能的山羊新鲜精子进行授精处理,授精后8h,转移入含有10％FCS的TCM_(199)中继续培养12h,结果有10枚卵子成熟,成熟率为55.6％,7枚卵子受精,受精率为70％。把7枚原核期受精卵移植给3只同期发情的受体山羊,2只妊娠,妊娠率为66.7％,并获得一只雄性试管山羊胎羔,胎龄为52d。     

奶牛胚胎冷冻保存技术的研究

<正> 自从Whittngham发现经超低温冷冻保存的小鼠胚胎可以成活后,超低温冷冻保存哺乳动物胚胎的方法取得很大进展。目前许多国家都在对不同的胚胎冷冻保护技术进行探讨,如加入冷冻保护剂的种类和浓度、冷冻程序的选择、脱除保护剂的方法等,试图寻找一个胚胎冷冻和解冻的最佳方案。我们从87年开始从事这方面的研究,其目的是探索胚胎冷冻的方法和步骤、寻找适宜于基层生产单位应用的解冻和脱除冷冻保护剂的简易方法。为今后胚胎移植的推广应用打下基础。     

集约化猪场沼液生态处理工艺优化试验效果评价

沼液的深度净化处理是集约化畜禽养殖废水无害化处理的必由之路,本研究旨在筛选处理猪场厌氧消化液的最佳工艺条件组合,为养殖废水资源化循环利用提供科学依据和技术支撑。采用水质相关国家标准方法,选取2个复合菌剂（A、B）,3个接种量（0.5、1.0、5.0%）,2个通气量（2mg/L、4mg/L）,比较研究不同处理条件组合对猪场沼液的净化效果。实验表明：12个组合处理均对猪场沼液具有不同程度的净化效果,能够有效去除猪场沼液生化需氧量（BOD5）、总磷（TP）、粪大肠菌群（FC, Fecal Coliform）,各自去除率最高分别达到90.0%、82.0%、99.9%。综合各项评估指标,工艺1、4、6优于其它组合,其中工艺4为最优组合。     

奶牛体外受精相关影响因素分析

[目的]探讨和研究奶牛体外受精（IVF）各技术环节中一些因素,对奶牛IVF整个过程的影响。[方法]研究不同来源的卵母细胞、精液的不同处理方法、不同的培养体系,不同受精时间,受精密度对奶牛IVF的影响。[结果]屠宰场采集的卵母细胞和活体采卵收集的卵母细胞的卵裂率和囊胚发育率差异不显著;对精子分别采用percoll梯度密度离心和上浮法处理,两组的卵裂率囊胚发育率无明显差异,用SOF液和BO液体外培养,两培养体系的卵裂率和囊胚发育率均差异不显著;受精时间为8、10 h及10、12 h的囊胚发育率均差异不显著,但受精8 h的囊胚发育率显著高于受精时间12 h;受精微滴（100μl）中放置成熟的卵母细胞数（20、40个）,两组的卵裂率和囊胚发育率均下降,且差异显著。[结论]随受精时间的延长,卵裂率和囊胚发育率逐渐降低,差异不显著,但受精8 h的囊胚发育率显著高于受精12 h;受精微滴（100μl）中放置20个成熟的卵母细胞,可取得较好的体外受精效果。     

颗粒细胞单层对黄牛孤雌胚胎体外发育的影响

为优化颗粒细胞单层共培养体系,研究了不同类型、不同种属的颗粒细胞单层及不同时间更换培养单层对黄牛孤雌胚胎体外发育的影响.结果表明.就卵裂率、囊胚率和囊胚孵出率而言.壁颗粒细胞单层组与丘颗粒细胞单层组之间无显著差异(P>0.05);来自黄牛、猪和小鼠的颗粒细胞单层在支持黄牛孤雌胚胎体外发育方面无显著差异(P>0.05):就囊胚率而言,共培养的第3天和第6天两次更换单层分别与共培养的第4天更换单层和始终不更换单层的对照组之间无显著差异(P>0.05),但第4天更换单层与对照组之间有显著差异(P<0.05).所以.不同类型和不同种属的颗粒细胞单层都能很好地支持黄牛孤雌胚胎的体外发育.在胚胎的体外发育过程中更换培养单层可以明显提高胚胎的囊胚率和囊胚孵出率,并且在共培养的第4天更换培养单层可以得到较高的囊胚率.     

In Vitro Developmental Potential of Cloned Embryos Derived from Bovine Somatic Cells and Rabbits Oocyte

180 reconstituted embryos were produced by nuclear transplantation using bovine ear fibroblasts at G0 or non-G0 stage as donor nuclei and oocytes collected from superovulated multiparous or young rabbits as recipients. After cultivation in two kinds of medium M199+ 10%FBS or RD+ 10%FBS, 112 of them developed to 2-cell stage (62.2%) and 26 to morula stage (14.4%) and 20 of them eventually developed to blastocyst stage (11. 1% ). There is no significant difference for the cleavage rates in two groups of reconstituted embryos derived from G0-stage and non-G0 stage donor cells respectively. However, G0-stage donor cells could result in higher rate of 8-cell - 16-cell stage embryos significantly (P＜0.05), as well as higher rate of blastocysts (P＜0.01). It seems that using two different culture systems had no significant effects on the cleavage rate, morula rate or blastocyst rate (P＞0.05).     

牛未成熟卵母细胞体外受精及染色体分析

收集不同供体牛的卵母细胞并分成两组。体外成熟培养16h为不完全成熟组；体外成熟培养24h为完全成熟组。结果显示，体外受精48h后，成熟组大部分胚胎发育到8细胞期和16细胞期，不完全成熟组的多数胚胎发育到2细胞期和4细胞期。染色体异常发生率显著高于成熟组。染色体异常表现为单倍体、多倍体和混合倍体。引起染色体异常发生的原因可能是由于精子穿入时透明带或卵母细胞膜的功能障碍所引起。     

ITS、卵巢保存温度及所处性周期对黄牛卵母细胞和孤雌胚体外发育的影响

研究了ITS、卵巢保存温度及所处性周期阶段对黄牛卵母细胞体外成熟和孤雌胚体外发育的影响.结果表明,在成熟液中添加10μL·mL-1,的ITS对黄牛卵母细胞体外成熟率和卵裂率影响不大,但可以提高卵母细胞孤雌激活后的囊胚发育率(41.67%/32.00%);牛卵巢从采集到送达实验室保存在30～39%的灭菌生理盐水中可以获得较高的成熟率和囊胚发育率(71.34%/41.84%);黄体期无黄体组与有黄体组均低于卵泡期卵母细胞的体外成熟率、卵裂率和囊胚发育率,但差异不显著(P>0.05).     

Superovulation of the Cloned Cattle Derived from Somatic Cells and the Transfer of the Vitrified-Thawed Embryos of the Cloning Cattle

In this experiment, it was designed to carry out superovulation on the two cloned cattles, vitrification and transfer of the embryos recovered from them. First of all, it was carried out vitrification on embryos obtained by IVF. Results showed that there were no significant differences between the blastocysts (obtained by IVF) vitrified in EPS10 and these in EPS20 on the resuscitative rate and the developmental rate. The hatched rate of the blastocysts vitrified in EPS10 (31.3%, 35/112) was significantly higher than that in EPS20 (12.2%, 13/107) (P＜0.01), so EPS20 was selected as the vitrification solution to freeze the embryos recovered from the cloned cattle. After superovulation, six (four usable embryos) and ten (nine usable embryos) embryos were respectively recovered from Kangkang and Shuanghuang. Two embryos were selected from the recovered embryos of each cloned cattle to freeze in EPS20, subsequently thawed and transferred into luteal ipsilateral uterine horns of 4 Holstein recipient cows after synchronization of estrus, respectively. At last, one recipient cow (No. 9908) became pregnant and delivered one healthy calf (descendant of the cloned cattle-Shuangshuang). The results of this experiment show that the cloned cattle as well as common cattle had better response to the exotic FSH and better ability to multiovulation, the embryos recovered from the cloned cattle can be vitrificated.     

体细胞克隆牛超排胚胎玻璃化冷冻及移植试验

 对体细胞克隆牛进行了超数排卵、胚胎玻璃化冷冻及胚胎移植试验。首先对体外受精卵进行了玻璃化冷冻保存试验,结果表明,体外受精囊胚经过EPS10和EPS20 的TCM-199液玻璃化冷冻-解冻后胚胎形态正常率和发育率各组间差异不显著,囊胚孵出率EPS20组为31.3% (35/112)极显著高于EPS10组的12.2% (13/107)（P＜0.01）,选择玻璃化冷冻液EPS20作为体细胞克隆牛超排采卵获得胚胎的冷冻保存液。本试验对体细胞克隆牛"康康"和"双双"进行了超排试验,分别获得6枚（4枚可用胚）和10枚（9枚可用胚）胚胎,各取2枚1级胚胎应用EPS20玻璃化液进行玻璃化冷冻,解冻后分别移植到4头同期发情处理的中国荷斯坦奶牛的黄体侧子宫角内,结果为1头9908号受体母牛妊娠,并且产下1头健康的体细胞克隆牛"双双"的胚胎移植后代。试验结果表明,①体细胞克隆牛与正常牛一样对外源激素（FSH）具有较好的应答能力和超数排卵的能力;②体细胞克隆牛的胚胎可用于玻璃化冷冻保存。     

南阳牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的研究

探讨了不同采集方法、牛卵泡液（bFF）添加浓度、培养时间和不同培养体系对南阳牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响。结果表明：组织破碎法、剥离法和切割法平均每个卵巢采到的卵母细胞数三者之间无显著差异，但用切割法所得的卵母细胞经体外培养，其成熟率显著高于剥离法和组织破碎法；成熟液中添加10％bFF组的卵母细胞成熟率显著高于对照组和添加5％bFF组，但其卵母细胞成熟率与20％bFF组差异不显著；在不同培养时间、不同培养体系试验设计中，以30～32h组、TCM199＋OCS＋FSH＋LH＋LIF组的卵母细胞成熟率较高。     

卵丘细胞对活体取卵来源的裸卵在体外成熟中的作用

本文探讨了卵丘细胞对活体取卵(ovumpickup,OPU)来源的裸卵在体外成熟中的作用。实验分3组:自然裸卵组(NO),裸卵独自成熟培养;共成熟组(CM),自然裸卵与A级卵丘卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes,COCs)共成熟培养;非裸卵组(NN),正常AB级COCs成熟后,去除卵丘再进行体外受精与体外培养。结果显示:NN组的成熟率最高,其卵裂率及囊胚率高于NO组,但与CM组相似;CM组的成熟率与NO组没有显著差异,但卵裂率和囊胚率均比NO组高。表明OPU来源的裸卵和A级COCs共成熟能显著改善裸卵的发育能力;卵丘细胞对卵母细胞的促成熟作用可直接作用于裸卵,促进裸卵的成熟及随后的发育。     

以鲁西黄牛为受体的高产奶牛胚胎移植研究

以自然发情的鲁西黄牛为受体,移植经性控技术生产的高产奶牛7日龄雌性冷冻胚胎,共移植合格受体牛5 516头,移植后60～80d进行直肠孕检,怀孕2 228头,移植准胎率为40.39％;共繁殖奶牛犊牛1346头,其中母牛1 279头,公牛67头,胚胎性别控制率为95.02％.左侧与右侧卵巢排卵移植准胎率分别为35.14％和43.15％,差异极显著(P＜0.01);春季与秋季的移植准胎率分别为36.93％和43.53％,秋季明显高于春季,差异极显著(P＜0.01);黄牛不同黄体级别A级、B级、C级的准胎率分别为39.16％、41.70％和33.42％,A级与B级移植准胎率差异不显著(P＞0.05),B级与C级移植准胎率差异极显著(P＜0.01);移植单胚与双胚的受体牛准胎率分别为40.73％和38.24％,差异不显著(P＞0.05).