玉米自交系幼胚高效再生系统的建立

以22份玉米自交系为试验材料,以幼胚为外植体,研究基因型、诱导（分化）培养基、继代次数、Ag-NO3浓度对玉米幼胚胚性愈伤组织的诱导、保持和植株分化的影响。结果表明,玉米幼胚培养能力受基因型、培养基及二者互作效应的影响,基因型是主要的影响因子。3 mg/L的2,4-D对胚性愈伤组织诱导和保持起关键作用;0.5 mg/L 6-BA抑制胚性愈伤组织的发生;8-12 mg/L AgNO3明显改善部分基因型愈伤组织质量,提高胚性愈伤组织诱导率。分化培养基中添加1 mg/L的KT和0.5 mg/L的IBA促进绿苗的分化和根系的生长。胚性愈伤组织继代3-5次后调整到最佳状态。确定了玉米幼胚培养胚性愈伤组织诱导的最佳培养基为N6＋3 mg/L 2,4-D＋8-12 mg/L AgNO3＋0.2 mg/L IAA,最佳分化培养基为N6＋1 mg/L KT＋0.5 mg/L IBA。     

植物激素对玉米愈伤组织诱导的影响

设计了含有不同植物激素的4种培养基用于玉米未成熟合子胚愈伤组织的诱导,以确定植物激素在玉米愈伤组织诱导中的作用。结果表明,KT和6-BA会明显降低愈伤组织和胚性愈伤组织的诱导频率,对愈伤组织的生长有明显的抑制作用;2,4-D在愈伤组织诱导中起着重要作用,但是在诱导培养基中添加3.3mg/L Dicamba比2 mg/L 2,4-D的诱导效果更好,除了能提高愈伤组织诱导频率外,更重要的是能提高胚性愈伤组织比例和获得更好的愈伤组织生长状态;并获得了一个用于从玉米未成熟合子胚高效诱导出良好愈伤组织的培养基配方LM6-CI。     

农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究

利用农杆菌介导玉米愈伤组织遗传转化,研究了不同影响因子对玉米遗传转化效率的影响。结果表明,相比自交系H99,玉米杂交组合H99×A188更适宜作为玉米遗传转化的受体材料;继代6d后的胚性愈伤组织最适宜农杆菌转化;农杆菌菌株EHA105的侵染效果好于EHA101;抗性愈伤组织筛选培养基中除草剂筛选的临界质量浓度为4.0mg/L;头孢霉素质量浓度在500mg/L时适合进行除菌处理,且对植株再生影响较小。     

农杆菌介导水稻sbeIIb基因转化体系的建立

本文对水稻愈伤组织再生体系及其转化影响因子进行了研究。以水稻品种秀水11的幼胚和成熟胚为外植体,以M S 肌醇0.1g/L 2,4-D 2mg/L 6-BA 0.2mg/L 脯胺酸2.8g/L 水解酪蛋白0.3g/L作诱导培养基,愈伤组织诱导率最高为73.45%,愈伤组织在M S 6-BA2 mg/L NAA 0.5mg/L的分化培养基上,分化频率达53.33%;在此基础上对农杆菌介导水稻愈伤组织转化的因子进行了优化,获得较高转化频率的条件为:预培养时间3d,在OD600值为0.6农杆菌菌液中感染10m in,共培养3d。     

农杆菌介导水稻sbeⅡb基因转化体系的建立

本文对水稻愈伤组织再生体系及其转化影响因子进行了研究.以水稻品种秀水11的幼胚和成熟胚为外植体,以M S+肌醇0.1g/L+2,4-D 2mg/L+6-BA 0.2mg/L+脯胺酸2.8g/L+水解酪蛋白0.3g/L作诱导培养基,愈伤组织诱导率最高为73.45%,愈伤组织在M S+6-BA2 mg/L+NAA 0.5mg/L的分化培养基上,分化频率达53.33%;在此基础上对农杆菌介导水稻愈伤组织转化的因子进行了优化,获得较高转化频率的条件为:预培养时间3d,在OD600值为0.6农杆菌菌液中感染10min,共培养3d.     

农杆菌介导冷调节基因（Cbcor15a）遗传转化甘蔗体系的建立

【目的】利用农杆菌介导法,将外源冷调节基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织,建立快速、高效的甘蔗遗传转化体系,为培育具抗寒性甘蔗品种奠定基础。【方法】以新台糖22号（ROC22）为材料,通过对愈伤组织诱导、分化、生根等培养基进行优化,筛选出外源基因转化甘蔗的适合激素种类与用量、PPT用量、抗生素种类与用量;利用甘蔗转基因二元植物表达载体pCambia1300-Cbcor15a-bar,通过农杆菌介导法将目的基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织。【结果】当农杆菌菌液OD600为0.4、侵染20 min时有利于愈伤组织分化;甘蔗愈伤组织诱导和分化培养阶段的最佳PPT为0.50mg/L。侵染后在共培养中添加500.00 mg/L抗生素Cef能有效抑制农杆菌,添加300.00 mg/L抗生素Cef能促进愈伤组织分化成苗,添加200.00 mg/L抗生素Cef能促进幼苗生根。MS培养基中添加低量NAA更有利于甘蔗愈伤组织的分化;在促进细胞分裂时KT的效果明显优于6-BA。MS培养基中添加5.00 mg/LNAA和70.00g/L蔗糖能有效促进分化苗生根。利用建立的遗传转化体系可获得286株转冷调节基因Cbcor15a的甘蔗转化植株;选取83株通过PPT抗性筛选后长势良好的转化植株进行阳性检测,其中有4株呈阳性。【结论】利用农杆菌介导的Cbcor15a基因转化甘蔗的遗传转化体系能成功将Cbcor15a基因整合到甘蔗基因组。     

农杆菌介导转化小麦几个影响因素的再研究

选用四川省近年来选育的3个小麦新品种川农16、川麦32和川育16幼胚及愈伤组织,针对农杆菌介导遗传转化中筛选剂种类、剂量,预处理方式,侵染时间等几个重要影响因素进行了研究。结果表明:Kan不能抑制幼胚愈伤的生长,平均愈伤诱导率达87%,愈伤组织生长良好。川农16的幼胚在含不同G418剂量的MS2中生长受抑制,但愈伤诱导率不随浓度变化而变化,说明G418不能很好地抑制住幼胚生长,未能筛选出合适的选择浓度。川农16和川麦32的幼胚在含不同L-PPT剂量的MS2培养基中,生长受到明显的抑制,L-PPT浓度为3mg/L时就能完全抑制幼胚的生长,因此在小麦遗传转化诱导愈伤和继代阶段L-PPT合适的筛选浓度是2～3mg/L。侵染时间对不同基因型幼胚愈伤诱导率表现不一致,川农16在1h时表现较高的诱导率;侵染前对幼胚进行高渗处理和乙酰丁酰酮(AS)处理后,愈伤诱导率与未经处理相比并未表现出明显的增加趋势,但基因型对不同处理的反应也表现较大差异。     

提高根癌农杆菌介导水稻遗传转化频率的研究

以15个籼、粳稻栽培品种作材料,研究了农杆菌转化水稻幼胚愈伤组织频率的一些影响因素。结果表明:NB培养基适用于各种基因型的水稻幼胚培养,愈伤组织与农杆菌共培养时间以3d为宜,而CCS培养基则适合于水稻转化愈伤组织的筛选培养。用羧苄青霉素抑制农杆菌效果优于头孢霉素,其适宜浓度为250～400mg/L,而潮霉素的筛选压以25～50mg/L较为合适。此研究通过优化各种转化因子,已从供试的15个品种中获得了14个品种的水稻转基因植株。     

根癌农杆菌介导的籼稻蜀恢527遗传转化方法的探究

籼稻（Indica rice）组织培养过程中愈伤组织转化率较低,尤其是对优良品种成熟胚愈伤高频再生体系的建立和影响转化的主要因素还缺乏研究。在一定程度上制约着籼稻基因工程的进展。以籼稻品种重穗型恢复系蜀恢527成熟种子为材料,研究了不同温度和光照条件对其成熟胚愈伤诱导及生理状态的影响;并在分化培养基中添加不同的激素和调整激素间浓度配比从而筛选出蜀恢527最佳分化培养基。结果表明：在32℃光照条件下,蜀恢527成熟种子在N6D诱导培养基上诱导愈伤组织效果最佳,继代2次后胚性愈伤质量状态最好。以基本培养基NBS中添加0.02 mg/L NAA+2 mg/L KT+3 mg/L 6 BA+50 mg/L VC+0.5 mg/L IAA为蜀恢527成熟胚遗传转化的最佳分化培养基,分化频率较高,分化率达到36.42%。利用优化的籼稻遗传转化体系,通过根癌农杆菌介导法将水稻转录因子OsbZIP39转入籼稻基因组中,经PCR分子初步检测得到了抗性植株。     

糯玉米的成熟胚培养

以糯玉米成熟胚为外植体作离体培养,研究了在培养基中添加植物激素,硝酸银及有机物等对玉米愈伤组织的诱导和胚性愈伤组织继代生长的影响.结果表明:在诱导培养阶段,N6+6-BA 0.2 rag/L+2.4-D2mg/L的培养基诱导率最高,愈伤组织质量好;在继代培养阶段,MS+6一BA 0.2 mg/L+2,4-D2mg/L+AgNO,10 mg/L或CW(Coconut Water)10%的培养基可改善胚性愈伤的质量.     

玉米自交系幼胚培养与基因枪转化研究

玉米自交系幼胚在添加 1～ 2mg/L 2 ,4-D的N6培养基上能够诱导形成不同类型的胚性愈伤组织。愈伤组织的诱导率与基因型和 2 ,4-D浓度有关 ,6个自交系的诱导率在 5 2 %～ 89%。将淡黄色颗粒状结构致密型愈伤组织在N6诱导培养基上继代培养 2 0个月 ,仍具有较强的分化能力。在附加 2mg/L 6 -BA和0 .2mg/LNAA的N6分化培养基上 ,有 2 7%～ 41%的愈伤组织分化成苗。通过基因枪轰击成功地将 pbarGUS基因转入玉米细胞 ,获得了大量的转化胚性愈伤组织。用 0 .4mol/L的甘露醇高渗处理幼胚 ,能显著提高pbarGUS基因在细胞中的表达 ,高渗处理转化率较对照提高了 3倍     

褐变抑制剂对黄芩愈伤组织褐变及次生代谢产物的影响

研究了不同褐变抑制剂对黄芩愈伤组织继代培养中褐变、生长以及黄芩愈伤组织次生代谢产物黄芩苷、黄芩素含量的影响。结果表明：在MS＋0．5mg／L2,4-D＋1．0mg／L6-BA继代培养基中分别添加1．0g/L植酸、10mg／L抗坏血酸、2．0g/L聚乙烯吡咯烷酮能有效抑制黄芩愈伤组织褐变,促进其生长。在综合考虑愈伤组织的褐变率、生长增殖倍数（干重）基础上,以黄芩苷产量为指标,添加10mg／L抗坏血酸＋1．0g/L植酸组合效果最好;以黄芩素产量为指标,添加1．0g/L植酸效果最好。     

3种抗生素对尾巨桉愈伤组织诱导及植株再生的影响

【目的】研究潮霉素、卡那霉素和头孢霉素对尾巨桉愈伤组织诱导、不定芽分化及生根的影响,确立抑制农杆菌生长的头孢霉素质量浓度。【方法】以尾巨桉无菌苗茎段为外植体,先后接种于添加不同质量浓度抗生素的愈伤组织诱导培养基、不定芽诱导培养基以及生根培养基上,统计愈伤组织诱导率、不定芽诱导率和不定芽生根率,观察头孢霉素对农杆菌生长的影响。【结果】(1)培养基中的潮霉素、卡那霉素、头孢霉素的质量浓度分别为15,25,200 mg/L时,尾巨桉外植体的愈伤组织诱导率分别为6.7%,12.1%和26.7%;(2)潮霉素、卡那霉素、头孢霉素的质量浓度分别为15,25,250 mg/L时,不定芽分化受到明显抑制,不定芽诱导率分别仅有2.6%,10.2%和7.6%;(3)潮霉素、卡那霉素、头孢霉素的质量浓度分别为15,25,250 mg/L时,不定芽生根困难,生根率分别为10.2%,16.2%和10.1%;当头孢霉素质量浓度≥200 mg/L时,农杆菌生长被完全抑制。【结论】尾巨桉对不同抗生素的敏感性存在差异,在尾巨桉遗传转化过程中,抗性愈伤组织与不定芽诱导的潮霉素适宜质量浓度为10 mg/L,卡那霉素为20 mg/L;生根诱导适宜的潮霉素和卡那霉素的质量浓度分别为15 和25 mg/L;抑制农杆菌生长的头孢霉素较适宜的质量浓度为200 mg/L。     

不同玉米自交系幼胚愈伤组织诱导和分化的研究

[目的]通过对玉米幼胚培养,建立一套稳定性好、再生率高的组织培养体系.[方法]以4个玉米自交系幼胚为外植体,研究不同基因型、幼胚大小、2,4-D浓度、AgN03浓度对愈伤组织诱导的影响,进一步研究6 - BA和蔗糖浓度对愈伤组织分化及IBA和NAA对再生苗的生根影响.[结果]2,4-D浓度为2.0 ～3.0mg/L,幼胚长度为1.0～2.0 mm时,对胚性愈伤组织诱导有良好效果;在诱导期间采用隔代法添加10 mg/LAgNO3能提高胚性愈伤组织的诱导率;当6- BA为0.5 mg/L、蔗糖浓度为50 g/L时,愈伤组织分化率最高且有利于小植株的形成;IBA浓度为0.6 mg/L对植株生根较有利.[结论]对4个玉米自交系幼胚培养研究筛选出适宜玉米幼胚培养的最佳诱导、分化及生根培养基.     

根癌农杆菌介导CYP1A1转化菠萝的研究

将菠萝(Ananas comosus)愈伤组织经含有植物表达重组质粒(pUHA1-CYP1A1)的根癌农杆菌(LBA4404菌株)侵染后,在MS+3.0mg/LBA+2.0mg/LNAA+100μmol/LAS+8g/Lagar上共培养3d,转入选择培养基(MS+3.0mg/LBA+2.0mg/LNAA+20mg/LKm+400mg/LCarb+8g/Lagar)上培养约10d后开始分化出不定芽;28d后将绿色的抗Km不定芽转入MS+2.0mg/LNAA+30mg/LKm+300mg/LCarb+8g/Lagar上再进行连续2轮选择,随后将绿芽转入MS+1.0mg/LIBA+30mg/LKm+8g/Lagar上生根,共获得95株Km抗性植株,转化率0.12%～2.69%.对其中部分的抗Km植株进行PCR检测,PCR阳性植株率达64.29%.经Southern杂交进一步证实,CYP1A1已整合到菠萝基因中.以琼脂为培养基凝固剂、共培养基中添加AS、增加选择次数和逐渐增加新一轮选择培养基中的Km质量浓度等是根癌农杆菌介导菠萝愈伤组织获得转基因植株的重要条件.     

抗生素对高粱愈伤组织诱导和生长的影响

用羧苄青霉素等抗生素进行抑菌试验,以羧苄青霉素和头孢霉素的抑菌效果较好.头孢霉素对高梁愈伤组织的毒性表现出比羧苄青霉素大.浓度低于500 mg/L羧苄青霉素对高梁愈伤组织的生长起促进作用;而分化率随着羧苄青霉素浓度的提高而下降.在农杆菌介导高梁遗传转化时,选用羧苄青霉素是合适的,浓度以250 mg/L为宜.高梁愈伤组织对潮霉素的反应比卡那霉素更敏感,高梁不同基因型愈伤组织对卡那霉素和潮霉素的反应在褐化(死亡)率上表现不同.在以潮霉素作为抗性筛选标记时,选择压以50～75 mg/L为宜.     

玉米成熟胚愈伤组织诱导及其影响因素研究

以玉米成熟胚为外植体,初步研究了不同基本培养基、不同生长素及其浓度对成熟胚愈伤组织诱导的影响。结果表明,N6培养基对玉米成熟胚愈伤组织的诱导率略高于MS培养基,而且N6培养基上诱导的愈伤组织质量好于MS培养基;培养基中所添加的生长素种类及浓度对成熟胚愈伤组织诱导有较大影响。在MS和N6培养基中添加2,4-D,诱导玉米成熟胚愈伤组织的效果优于添加NAA;中低浓度的NAA（1．O～3．Omg／L）和中高浓度的2,4-D（2．0～5．0mg／L）有利于玉米成熟胚愈伤组织的诱导。     

激素和附加物对玉米幼胚愈伤组织诱导的影响

以沈农糯玉米为试材,改良MS培养基为基本培养基,研究了不同浓度的2,4-D对玉米幼胚愈伤组织的诱导效果,筛选出最适的2,4-D浓度为4 mg/L。4 mg/L 2,4-D配合使用较低浓度的6-BA(0.5 mg/L)不仅可以提高愈伤组织的诱导率,而且胚性愈伤组织的诱导率也有所提高。培养基中同时加入700 mg/L水解酪蛋白和1 000 mg/L的L-脯氨酸可显著提高胚性愈伤组织的诱导率;甘露醇和AgNO3对胚性愈伤组织诱导率提高无明显作用,但对改善胚性愈伤组织的质量起重要作用。