尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼及其杂交子代的催乳素Ⅰ基因克隆及序列分析

本研究采用RT-PCR方法对生长快、耐盐性弱的尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus),耐盐性强、生长慢的萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)以及生长与耐盐均较优的杂交子代(O.niloticus♀×S.melanotheron♂)的催乳素PRLI基因cDNA序列片段进行了克隆与序列分析,以探讨罗非鱼耐盐性的分子机制,分析和筛选与耐盐性相关的基因。主要结果:(1)序列克隆及ClustalX1.83分析表明克隆所得cDNA序列长度为339bp,编码112个氨基酸。(2)3种罗非鱼PRLI的cDNA具有高度的保守性,核苷酸序列同源性介于97.94%～99.71%之间,氨基酸序列同源性均在99.11%以上,表明罗非鱼的PRLI基因具有高度保守性。(3)杂交子代同尼罗罗非鱼的cDNA序列相比有5个碱基的变异,变异比例为1.47%;同萨罗罗非鱼相比有1个碱基的变异,变异比例为0.30%。(4)尼罗罗非鱼推导氨基酸序列中第80位氨基酸残基为脯氨酸残基(P),而杂交子代和萨罗罗非鱼在该位点均为丝氨酸残基(S)。(5)MEGA4系统进化树分析显示,杂交子代同萨罗罗非鱼聚为1支。结果(3)、(4)、(5)表明,在PRLI基因的表达方面,杂交子代同父本萨罗罗非鱼的关系较近。     

尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼及其杂交子代胰岛素样生长因子(IGF-Ib)基因3'cDNA末端克隆及序列分析

为探讨尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼及其杂交子代(Oreochromis niloticuss♀×Sarotherodon melanotheron ♂)IGF-I基因结构差异,研究IGF-I基因与此3种基因型罗非鱼耐盐性能差异之间的关系,通过3'-RACE的方法,从鳃的总RNA分别获得其IGF-Ib基因的部分cDNA序列,长度分别为1 076 bp、1075 bp和1 079 bp,包含完整的开放阅读框(ORF)546 bp、一个终止密码及含polyA信号的3'UTR;ORF编码182个氨基酸,包括信号肽(44aa),成熟肽B区(29aa)、C区(10aa)、A区(21aa)、D区(8aa)及编码70aa的E区,二级结构为混合类型;与其他脊椎动物IGF-Ib序列的序列相似度达75.8%-100%;成熟肽A、B区高度保守,C区第82位后缺失2aa,E区第131位和159位分别缺失3aa和1aa;萨罗罗非鱼在E133位发生Ala/Pro氨基酸残基替换,与耐盐性强的莫桑比克罗非鱼和画眉罗非鱼一致,推测IGF-Ib基因E区选择性剪切与3种罗非鱼耐盐性能差异有关.     

尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼及其杂交子代胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰb)基因3′cDNA末端克隆及序列分析

为探讨尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼及其杂交子代(Oreochromis niloticus ♀× Sarotherodon melanotheron ♂)IGF-Ⅰ基因结构差异,研究IGF-Ⅰ基因与此3种基因型罗非鱼耐盐性能差异之间的关系,通过3′-RACE的方法,从鳃的总RNA分别获得其IGF-Ⅰb基因的部分cDNA序列,长度分别为1076bp、1075bp和1079bp,包含完整的开放阅读框(ORF)546bp、一个终止密码及含polyA信号的3′UTR;ORF编码182个氨基酸,包括信号肽(44aa),成熟肽B区(29aa)、C区(10aa)、A区(21aa)、D区(8aa)及编码70aa的E区,二级结构为混合类型;与其他脊椎动物IGF-Ⅰb序列的序列相似度达75.8%～100%;成熟肽A、B区高度保守,C区第82位后缺失2aa,E区第131位和159位分别缺失3aa和1aa;萨罗罗非鱼在E133位发生Ala/Pro氨基酸残基替换,与耐盐性强的莫桑比克罗非鱼和画眉罗非鱼一致,推测IGF-Ⅰb基因E区选择性剪切与3种罗非鱼耐盐性能差异有关。     

尼罗罗非鱼与萨罗罗非鱼及其正反杂交后代的微卫星分析

微卫星（microsatellite）技术是近年来广泛应用的DNA标记,具有重复性好、较易操作和共显性的特点。在硬骨鱼类中表现出高度多态性,已在家系鉴定、遗传作图、群体遗传分析、育种以及系统发生研究等多个领域得到应用。尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）是我国主要淡水养殖鱼类,生长快,耐盐能力一般;萨罗罗非鱼（Sarotherodon melanotheron）耐盐能力强,适合咸淡水养殖,但生长较慢。[第一段]     

尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂杂交后代的遗传分离分析

应用微卫星标记对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)♀×萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)♂杂交后代(F1、F2)的遗传分离情况进行了初步研究.在86对微卫星引物中,筛选出21对在尼罗罗非鱼和萨罗罗非鱼中存在差异等位基因的特异性引物,共检测出59个等位基因,包含32个尼罗罗非鱼和24个萨罗罗非鱼特异等位基因.F1观测杂合度(Ho=0.998)大于 F2(Ho=0.739), F2有效等位基因数(Ne=2.48)、平均多态信息含量(PIC=0.497)与 F1的(Ne=2.45、PIC=0.489)相似.F1中所有位点均表现为尼罗罗非鱼与萨罗罗非鱼杂合基因型.F2中位点等位基因分离情况各异,通过卡方检验,有18个位点符合孟德尔遗传(P>0.05),2个位点GM145、UNH003表现为偏离孟德尔遗传(P<0.05),1个位点GM276不分离.在18个孟德尔遗传位点中, F2中尼罗罗非鱼特异等位基因频率为48.3%,萨罗罗非鱼特异等位基因频率为47.7%;基因型出现F1型、尼罗罗非鱼型、萨罗罗非鱼型的比例分别为58.2%、19.9%、21.9%.结果表明, F2较好地继承了F1的遗传杂合性,但也存在一定程度的分离.     

慢性盐度胁迫对吉丽罗非鱼(尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼♂)及其两亲本耐盐性的影响

为深入研究养殖新品种吉丽罗非鱼[尼罗罗非鱼(♀)×萨罗罗非鱼(♂)]的耐盐性能,对吉丽罗非鱼及其两个亲本尼罗罗非鱼和萨罗罗非鱼进行了慢性盐度胁迫实验,分析了3种罗非鱼耐盐性能的差异,建立了盐度胁迫过程中死亡率与致死盐度及时间的回归模型,结果显示:(1)3种罗非鱼的耐盐能力差异显著,吉丽罗非鱼的耐盐性能接近于萨罗罗非鱼,远高于尼罗罗非鱼,耐盐胁迫时3种罗非鱼的平均致死盐度分别为57.9、66.7和18.5.(2)盐度胁迫实验中尼罗罗非鱼个体间死亡时间差异最大,萨罗罗非鱼个体之间差异最小,吉丽罗非鱼介于其间;吉丽罗非鱼和萨罗罗非鱼死亡时间都有极显著的正态负偏移,离群值和极值较多,尼罗罗非鱼有较显著正态正偏移,只有离群值,没有极值.(3)3种罗非鱼盐度胁迫实验中死亡率与死亡时间及盐度之间的回归关系更适合一元回归,吉丽罗非鱼盐度胁迫实验中死亡率(y)与死亡时间(t)的回归模型为增长模型Y=e (-7.694+0.031t)(R2=0.979),死亡率(Y)与盐度(s)的回归模型为二次模型Y =0.542-0.037s +0.001s2(R2=0.950).     

奥利亚罗非鱼DMT基因克隆与序列分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)分离、克隆奥利亚罗非鱼(Oreochromis aurea)睾丸DMT(DM-do-main gene in testis)基因,并进行序列测定与分析。结果表明,该基因cDNA序列全长1 260 bp,包括74 bp 5’非翻译区,879 bp阅读框以及含poly(A)信号AATAAA的307 bp 3’非翻译区,阅读框共编码292个氨基酸。序列同源性分析表明,不同进化地位动物的DMRT1基因DM域编码序列存在高度同源性,显示DMRT1基因在系统进化上高度保守。生物信息学分析表明:DMT基因编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,有多个蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-糖基化位点,推测其可能在细胞信号传导中发挥作用,且其生物活性可能接受信号途中多种信号的调控。该基因的成功克隆及生物信息学分析不仅为DMRT1基因的分子进化和相似性比较研究提供了新的材料,而且对进一步研究其编码蛋白的结构与功能以及其在鱼类性别调控中的作用具有重要意义。[中国水产科学,2007,14(1):23-31]     

不同盐度下尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼和以色列红罗非鱼幼鱼生长、成活率及肥满系数的差异

用1m×1m×1m的实验网箱,在盐度分别为0、10、20及30的水体中进行尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)、萨罗罗非鱼(Sarotherodonmelanotheron)和以色列红罗非鱼(Israeliredtilapia)幼鱼的养殖实验。结果表明:(1)盐度、鱼的种类及盐度-鱼类的交互作用都对3种罗非鱼的生长及体重变异系数有显著影响(P<0 05);3种罗非鱼的成活率和肥满系数只受鱼的种类影响(P<0 05);盐度、盐度-鱼类的交互作用对其都无显著影响。(2)生长和盐度之间的回归关系在尼罗罗非鱼和以色列红罗非鱼较显著,在萨罗罗非鱼显著性较差。(3)尼罗罗非鱼和以色列红罗非鱼的生长随着盐度的降低而加快,萨罗罗非鱼的生长随着盐度的降低而减慢。在3种鱼中,盐度在6 9以下时,尼罗罗非鱼生长最快;盐度7 4～28 7时,以色列红罗非鱼生长最快;盐度高于29 0时,萨罗罗非鱼生长最快。(4)在实验的4种盐度下,萨罗罗非鱼的成活率都高于以色列红罗非鱼和尼罗罗非鱼,而除了在淡水中外,以色列红罗非鱼的成活率又都高于尼罗罗非鱼;萨罗罗非鱼的肥满系数都显著高于尼罗罗非鱼和以色列红罗非鱼,而以色列红罗非鱼的肥满系数和尼罗罗非鱼的没有显著差异。     

尼罗罗非鱼与萨罗罗非鱼正反杂交后代耐盐性能的杂种优势及其与遗传的相关性的SSR 分析

对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)♀×萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)♂(F2)、萨罗罗非鱼♀×尼罗罗非鱼♂(F2)、尼罗罗非鱼、萨罗罗非鱼4个遗传型群体的耐盐性实验表明:(1)4个遗传型群体的平均成活时间(MST)、50%成活时间(ST50)以及96 h半数致死浓度(MLS-96)由高到低依次为:萨罗、萨罗×尼罗(F2)、尼罗×萨罗(F2)、尼罗,死亡率与盐度具有显著的回归关系(P<0.05);(2)两个杂交种超越尼罗的超亲杂种优势值(HN)表现为正值,超越萨罗的超亲杂种优势值(HS)表现为负值,说明它们的耐盐力都超过了尼罗,但都未超过萨罗;(3)尼罗×萨罗(F2)的平均杂种优势值(HM)表现为负值,萨罗×尼罗(F3)的HM除其MLS-96表现为负值,其MST和ST50均为正值,说明萨罗×尼罗(F2)的耐盐性能略优于尼罗×萨罗(F2).对尼罗×萨罗(F2)、萨罗×尼罗(F2)、尼罗×萨罗(F1)、萨罗×尼罗(F1)、尼罗、萨罗6个遗传型群体的SSR分析发现:(1)有效等位基因数(Ne)、平均遗传杂合度(He)及多态信息含量(PIC)3项指标一致,表明F2遗传多样性比亲本增强2/3左右,这与杂交种的基因重组有关:F2又比F1增强1/10左右,初步认为这与F2的遗传分化有关;(2)引物Os-64和Os-75仅在尼罗、尼罗×萨罗(F1)及尼罗×萨罗(F2)中扩增出条带,表现出强烈的尼罗母系遗传:引物Os-25和IGF仅在萨罗、萨罗×尼罗(F1)及萨罗×尼罗(F2)中扩增出条带,表现出强烈的萨罗母系遗传,这4条引物可作为判别杂交鱼母本来源的遗传标记.     

4种遗传型罗非鱼的耐盐慢性驯化表现

在实验室小水体中,对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,新吉富)、萨罗罗非鱼(Sarothrodon melanotheron)以及它们的杂交F1和F2("吉丽"罗非鱼)进行盐度梯度实验,观察其耐盐能力。采用4(遗传型)×4(水平或重复)随机区组设计。对照组全程维持淡水养殖;实验组起始盐度为0,盐度每天提高8直至实验鱼100%死亡。在水温保持(27.2±1.3)℃、正常投饵情况下,萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼、杂交F1及F2的50%死亡盐度平均值(MLS)分别为125.78±1.66、54.22±2.51、77.33±1.89和73.73±1.32;萨罗罗非鱼的累计存活率(CS)和MLS值均显著高于尼罗罗非鱼、杂交F1和F2(P<0.05);杂交F1和F2的CS值及MLS值均显著高于尼罗(P<0.05);F2和F1之间CS值和MLS值差异不显著(P>0.05)。     

尼罗罗非鱼与萨罗罗非鱼回交一代与回交二代群体遗传特征的微卫星分析

利用尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)第二代遗传连锁图谱中微卫星标记,对尼罗罗非鱼♀与萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)回交一代(BC1)和回交二代(BC2)群体遗传特征进行了分析。结果表明,从28个微卫星位点中筛选出9个在尼萨回交一代和回交二代中存在差异的扩增位点,这些多态性位点可作为尼萨回交一代和回交二代群体遗传鉴别的重要依据。尼萨回交一代群体的平均观测杂合度为0.670,多态信息含量为0.423;回交二代群体的平均观测杂合度为0.460,多态信息含量为0.365,回交二代群体的遗传多态性低于回交一代群体。与回交一代相比,尼萨回交二代群体的平均有效等位基因数较为一致(BC1:Ne=2.17,BC2:Ne=2.20),基因型数较为一致,但纯合基因型比例、优势等位基因频率均有明显提高,表明连续回交导致后代遗传同质性提高。     

尼罗罗非鱼与萨罗罗非鱼正反交鱼自繁后代F2耐盐性、生长性能及亲本对杂种优势贡献力的评估

为选育耐盐和生长兼优的罗非鱼,以原始亲本尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)和萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)为对照,正交鱼(尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼↑)自繁第二代(F2)和反交鱼(萨罗罗非鱼♀×尼罗罗非鱼↑)自繁第二代(F2)为试验对象,观察和比较他们在盐度为0、15、20及25时的耐盐性和生长性能,并估算杂种优势及亲本的贡献力.结果如下:(1)盐度20～25是正、反交鱼的适宜生长盐度,他们在这一盐度范围里的日均增重率为尼罗罗非鱼在盐度0下的75%左右、萨罗罗非鱼在盐度25下的4倍左右,表明杂交后代的生长速度比较接近尼罗罗非鱼,远优于萨罗罗非鱼.在盐度25下,正交鱼比反交鱼生长快7%左右.(2)在盐度15与20下,生长速度和体重变异系数的杂种优势较明显,未发现不同盐度会导致正反交鱼成活率有显著变化.(3)不同亲本鱼类的强势性状,如尼罗罗非鱼的快速生长、萨罗罗非鱼的高耐盐性,对杂交后代的不同性状在不同盐度中有不同的贡献力.运用F1≤a1P1 a2P2所作的估算表明,对杂交后代在15～25盐度下的生长率,尼罗罗非鱼的杂种优势贡献力比萨罗罗非鱼的大3～4倍;对杂交后代在25盐度下的耐盐性,尼罗罗非鱼的贡献力几乎为零,而萨罗罗非鱼的贡献力几乎为100%.     

Karyotype analysis of Oreochromis mortimeri (Trewavas) and Sarotherodon melanotheron (Rüppell)

The karyotypes of both Oreochromis mortimeri (Trewavas) and Sarotherodon melanotheron (Rüppell) are shown to consist of 22 pairs of chromosomes (2n = 44). In O. mortimeri, the karyotype is composed of 9 sm/st and 13 t chromosomes. In the case of S. melanotheron, the karyotype is composed of 15 sm/st, 2 m and 5 t chromosomes. The karyotypes of these species are therefore similar to those of the majority of other tilapia species, with that of S. melanotheron being considerably different from that previously reported for this species.     

尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其正、反杂交群体的遗传多样性

用7对微卫星引物检测了尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）和奥利亚罗非鱼（O.aureus）群体及其正、反交群体共128个个体的遗传多样性。共检测到38个等位基因,尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、正交群体和反交群体的平均等位基因数分别为4.0、1.4、5.3和2.7,平均PIC值分别为0.557、0.099、0.590和0.497,平均观测杂合度分别为0.505、0.071、0.826和0.883,平均期望杂合度分别为0.622、0.117、0.684和0.598,杂合子偏离指数（D）分别为-0.146、-0.241、0.215和0.522。结果表明,正交群体的遗传多样性比两个亲本群体都高,反交群体介于两个亲本群体之间;正交群体的观测杂合度和期望杂合度也高于两亲本群体,反交群体的期望杂合度介于两者之间,但实际观测杂合度却最高;两亲本群体存在一定的杂合子缺失,而杂交群体则存在杂合子增加的现象,尤其是反交群体的观测杂合度大量增加。卡方检验表明,正交群体偏离Hardy-Weinberg平衡的位点较少（3个位点）,而其他3个群体大部分位点均偏离平衡,存在遗传漂变现象。4个养殖群体间遗传分化具有显著性（FST为0.081-0.610,P〈0.01）。UPGMA系统树显示,正交种与尼罗罗非鱼的亲缘关系较近。表明正交群体受亲本群体的影响最大,其生长优势除了性别因素外,遗传因素可能也具有重要作用。     

尼罗罗非鱼p38MAPK基因克隆与表达分析

为了探究p38MAPK与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)免疫功能的相关性,本实验运用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得尼罗罗非鱼埃及品系ntp38MAPK的cDNA全长序列,结果显示,该序列全长1789 bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长1086 bp,5′非编码区(Untranslated Region,UTR)长342 bp,3′UTR为361 bp。ORF编码361个氨基酸,预测分子量为41.598 kD,理论等电点为5.10。序列含有p38家族典型保守的Thr-Gly-Tyr(TGY)双磷酸化位点以及紧密相连的底物结合位点Ala-Thr-Arg-Trp(ATRW)。同源性以及系统进化树分析结果显示,尼罗罗非鱼的p38MAPK与大黄鱼(Larimichthys crocea)和鲈(Dicentrarchus labrax)的相似性最高。采用qRT-PCR的方法研究了ntp38MAPK在各组织以及无乳链球菌感染过程中的表达差异情况,结果显示,ntp38MAPK在各组织均有表达,其中在肌肉的表达量最高,心脏、肝脏、脾脏次之,头肾中的表达量最低。无乳链球菌感染过程中,脾脏、头肾中ntp38MAPK的表达量在2 h开始上调,肝脏中4 h开始上调,8 h后肝脏、脾脏和头肾中的表达量都有所下降,24~72 h趋于平稳,表明ntp38MAPK在尼罗罗非鱼抵抗链球菌侵染过程中发挥重要作用。