苜蓿尺蠖核多角体病毒对家蚕核多角体病毒在蚕体内复制的干扰

昆虫杆状病毒具有相对狭窄的宿主域.虽然苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcMNPV)和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)两者DNA序列的同源性在95%左右,但AcMNPV不能在家蚕细胞中很好的复制,对家蚕幼虫不具有致病能力,但其基因组中个别基因可在被接种该病毒的家蚕幼虫体内表达.这些基因的表达可能对共感染的优势病毒BmNPV复制所需原料蛋白及转录因子形成竞争,进而抑制BmNPV在家蚕幼虫体内的复制表达.     

dsRNA对家蚕核型多角体病毒复制增殖的抑制效果

以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制必需的极早期基因ie-1和细胞释放型病毒CRV入侵关键基因gp64为靶序列,分别人工设计并体外转录出dsRNA I1(438 bp)和dsRNA G1(337 bp),用家蚕培养细胞BmN研究目标dsRNA对BmNPV复制、增殖的抑制效果。结果表明:dsRNA I1能有效地抑制BmNPV在BmN细胞中的增殖,最大抑制效果使培养液中的病毒滴度(TC ID50)比对照降低了104.30倍;dsRNA G1能显著地抑制新形成的病毒粒子的细胞侵染能力,最高可使培养液中的病毒滴度降低103.17倍。     

家蚕核型多角体病毒ODV囊膜蛋白基因的融合表达及引导外源蛋白进入多角体的研究

为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的包涵体衍生病毒(ODV)囊膜蛋白在病毒粒子包涵入多角体过程中的作用,选择2个ODV囊膜蛋白ODV-E25和ODV-E56作为研究对象,利用能够表达多角体蛋白的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建了融合表达E25-EGFP和E56-EGFP的重组病毒,在家蚕卵巢培养细胞系(BmN)中进行表达和定位分析。结果表明2种融合蛋白均在BmN细胞中成功表达,并于荧光显微镜下观察到绿色荧光主要分布在细胞核中。从感染的BmN细胞中收集纯化多角体,观察到多角体也能激发出绿色荧光,用Western blot方法进一步证实多角体中含有融合蛋白。这一现象表明当囊膜蛋白基因与外源基因融合表达时,外源融合蛋白能够进入多角体内部,推测这2种ODV囊膜蛋白不仅在病毒粒子包涵入多角体的过程中起信号引导作用,并能引导外源目的蛋白进入多角体。     

化学诱变的BmNPV对家蚕细胞和虫体感染性的初步研究

前文报道化学诱变剂对家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)多角体形态有明显的诱变作用 ,诱变的BmNPV基因组对某些限制性内切酶的酶切电泳谱发生变化。本文研究进一步表明 :诱变BmNPV感染家蚕Bm N细胞的病变特征与对照相比没有明显不同 ,但形成不定形超大多角体的空斑时间延迟2～ 3d;诱变BmNPV感染家蚕幼虫后 ,病蚕体内各组织病变损害的感染程度 (易感性 )与对照基本相同。研究结果提示 ,诱变的BmNPV对家蚕培养细胞、虫体组织的感染性无显著变化     

体外培养蓖麻蚕蛹精巢组织细胞对核型多角体病毒的敏感性分析

为开展核型多角体病毒与宿主互作关系的研究,建立蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricini)细胞体外扩增体系,分析其对不同核型多角体病毒的敏感性差异。采用剪切分离后的蓖麻蚕蛹精巢组织材料,将分散的细胞在TNM-FH培养基中经数月换液培养后,获得了扩增的蓖麻蚕蛹精巢细胞系(BMC1)。BMC1的倍增时间约为65h。病毒的感染性实验表明:BMC1细胞对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)比较敏感,在感染的细胞中可以明显地观察到多角体;家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的多角体蛋白基因启动子可以在BMC1细胞中表达,但难以观察到多角体形成和细胞的病变,提示BMC1可以作为BmNPV的稳定化表达受体;而蓖麻蚕核型多角体病毒(PcrNPV)单独感染BMC1细胞时,无明显病变,只有在与AcNPV混合感染时可观察到PcrNPV多角体形成。BMC1细胞对不同核型多角体病毒的敏感性具有差异,不同核型多角体病毒的感染性差异的机制有待深入解析。     

利用双色荧光观察分析重组家蚕杆状病毒对昆虫细胞及蚕体组织的感染

尝试将红色荧光蛋白(RFP)作为昆虫表达体系的分子标签,克隆了rfp基因的读码框,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将该基因插入家蚕核型多角体病毒(BmNPV)中,获得重组杆状病毒BmNPV-rfp。对家蚕细胞的感染表明,rfp适于在昆虫细胞中表达,在显微镜下红色荧光很明显,说明RFP可以作为杆状病毒表达的分子标签。BmNPV-rfp和另一种插入绿色荧光蛋白基因gfp的家蚕重组杆状病毒BmNPV-gfp混合感染家蚕细胞和幼虫的实验表明,二者的荧光很少在同一细胞中发生重叠,说明昆虫细胞大多只感受1次同一来源的病毒。BmNPV-rfp、BmN-PV-gfp与AcNPV混合感染Sf21细胞的结果也证明了该推断,并且还显示AcNPV可以协助BmNPV来源的病毒基因在Sf21细胞中表达以及协助病毒增殖或产生杂交病毒,但尚未明确其机制。     

ie-1和lef-1基因dsRNA表达元件转染及转化细胞对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制

通过RNAi介导可以抑制病毒增殖,将相应的RNAi元件通过转基因转入宿主有可能使宿主对病毒产生一定的抗性。根据家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组中的病毒复制必需基因ie-1、lef-1设计相应的RNA干扰区段,并构建相应的转基因载体转入家蚕BmN细胞中,瞬时表达结果显示转染了转基因RNAi载体的BmN细胞均对BmNPV有一定的抑制作用。IE dsRNA在病毒滴度为10-4时有抑制作用,在病毒滴度为10-5时有比较好的作用;LEF dsRNA则在病毒滴度为10-5时有抑制作用,在病毒滴度为10-6时有较好的抑制作用。通过转基因及G418筛选后,转基因IE dsRNA细胞在病毒滴度为10-4显示出一定的抑制作用,在病毒滴度为10-5表现了明显的抑制作用;而转基因LEF dsRNA细胞在病毒滴度为10-5有一定的抑制作用,但只维持了一个时段。     

宿主域扩大的苜蓿尺蠖核多角体杂交型病毒

将家蚕核型多角体病毒 (BombyxmoriNuclearPolyhedrosisVirus,BmNPV)的解链酶基因DNA和苜蓿尺蠖核型多角体病毒 (AutographacalifonicaMultipleNuclearPolyhedrosisVirus,AcMNPV)的基因组DNA共转染到秋粘虫细胞系Sf 2 1,经过累代的筛选获得既能感染家蚕细胞 ,又能感染秋粘虫细胞的宿主域扩大的杂交型病毒HyNPV。     

用家蚕核型多角体病毒DNA基因组转染细胞系NISES—BOMO—15AIIC的有效脂染法

家蚕细胞系(BOMO—15AIIC)(Inoue等,1990),对家蚕核多角体病毒(BmNPV)和对几种质型多角体病毒(CPV)易感,通常用此细胞系来进行各种研究,诸如杆状病毒介导的组蛋白的表达,研究在离体条件下复制时CPVS与BmNPV的相互影响以及在实验室条件下CPV表达载体的发展.所有这些研究都需要使用高效的方法来将病毒基因组转染到细胞之中.     

利用酵母双杂交系统筛选BmNPV PE38的互作蛋白

利用酵母双杂交技术,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的PE38蛋白为诱饵,从感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库中筛选与之相互作用的宿主蛋白编码基因,为探讨BmNPV PE38在侵染家蚕过程中的作用提供线索。将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-Pe38转化到酵母菌Y2HGold中,并将含有感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库的Y187酵母细胞与含有pGBKT7-Pe38的酵母细胞共同培养,初筛出8个有匹配结果的候选蛋白基因,经功能搜索后筛选到2个与病毒复制有关的蛋白基因,通过测序和生物信息学分析,这2个基因编码的蛋白质可能是与BmNPV的PE38蛋白有相互作用的候选蛋白,分别为家蚕丝氨酸蛋白酶和过氧化氢酶。     

BmNPV多角体对稳定转化细胞表达荧光蛋白的包埋现象初探

为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)多角体对外源蛋白的包埋特性,构建了含有绿色荧光蛋白基因(gfp)和红色荧光蛋白基因(DsRed)的表达载体pIZT-DsRed,用该载体转染家蚕卵巢细胞系(BmN),并以吉欧霉素(zeocin)筛选得到稳定表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的BmN细胞系。进一步以野生型BmNPV感染pIZT-DsRed转化BmN细胞,发现部分多角体可以发出绿色荧光和红色荧光,Western blot检测证明多角体中含有GFP蛋白,显示BmNPV多角体可以包埋进病毒粒子以外的其他蛋白成分,表明BmNPV多角体蛋白的包埋机制中存在非特异性识别包埋的现象。     

表达短ie-1 dsRNA的转化细胞对家蚕核型多角体病毒的抑制作用

为了利用RNAi技术提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抗性,根据BmNPV复制必需基因ie-1设计其相应的dsRNA,构建带有ie-1 dsRNA表达盒的转基因载体piggyantiIE-Neo,结果显示:表达短ie-1 dsRNA的稳定转化Bm细胞,对BmNPV的增殖表现出抑制作用,但在病毒感染后期,由于病毒恢复增殖导致RNAi的效果被掩盖。通过反向PCR分析外源DNA片段插入基因组位点,结果显示:在转化细胞中,外源DNA可通过随机整合或按照piggyBac特定的转座位点TTAA插入细胞基因组。     

家蚕病毒病的综合防治措施

<正> 家蚕病毒是超显微的、没有细胞结构的、特定的活细胞寄生的大分子微生物,他们在活体外具一般大分子特征,即具有潜在浸染力的病毒粒子(如病毒包含体BmFV和BmDNV、多角体BmCPV和BmNPV等),一但进入宿主细胞,就具有极强的生命特征,其病毒核酸的遗传活性附加于或取代其宿主细胞核酸的遗传活性,打破细胞的自身规律进行过剩的增殖,使被侵袭的细胞机能低下而出现病害。病毒是专性细胞内寄生物,只能在活细胞内繁殖,感染细胞后接管宿主细胞     

BmNPV多角体蛋白片段引导外源蛋白固定入多角体的研究

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)晚期产生大量多角体,其主要作用是包埋病毒粒子免受外部恶劣环境的影响,为次代感染提供保障。将BmNPV多角体基因分段克隆并与报告基因——增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合,利用BmNPVPolh+Bac-to-Bac表达系统构建重组病毒,使多角体蛋白与融合蛋白在BmN细胞内共表达。分析感染细胞和形成的多角体中融合蛋白的含量,研究不同的多角体蛋白片段引导EGFP固定入多角体的效果,结果表明构建的5种重组病毒都能大量表达融合蛋白,每种多角体蛋白片段都能引导EGFP固定入多角体内部,且外源融合蛋白在多角体总蛋白中占有较高的比例,其中,以多角体蛋白N末端100个氨基酸和完整多角体蛋白序列作为信号固定EGFP的效率最高。这一现象为解决活性蛋白长期保存提供了新思路,同时对于开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂和新型疫苗的转运载体也具有较好的参考价值。     

家蚕核型多角体病毒蛋白质组学的研究进展

家蚕核型多角体病毒（ BmNPV）属于杆状病毒,是一类对家蚕具有高致病性的病原体。对家蚕Bm-NPV的生物学特性以及新的BmNPV蛋白的鉴定和抗BmNPV的研究发现进行综述,并指出当前BmNPV蛋白质组学的研究阶段,为BmNPV的蛋白质组学的进步发展提供参考。     

利用N-端融合(His)_6标签观察家蚕核型多角体病毒泛素蛋白的亚细胞定位

为了给家蚕核型多角体病毒(BmNPV)泛素蛋白(UB)的功能研究提供亚细胞定位信息,利用Red重组系统和BmN-PV的bacmid系统,进行2次同源重组,成功地将(His)6标签编码序列引入到BmNPV泛素基因(ub)起始密码子ATG和第2个密码子CAA之间,使得表达的BmNPV UB的N-端融合(His)6标签。通过对(His)6的免疫荧光分析观察到BmNPV UB在BmN细胞中呈现3种方式的亚细胞定位:均匀地分布于整个细胞;主要分布于细胞核;分布于细胞核,同时在细胞质中出现零星的点分布。BmNPV UB具有多种不同的亚细胞定位方式,提示其功能的多样性。     

家蚕核型多角体病毒ie0基因对病毒复制和转录的影响

ie0基因是家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的一个晚期基因,该基因编码氨基酸序列的高度保守性及多种结构域提示其在病毒感染过程中的重要性。利用Red同源重组技术,分别对BmNPV ie0基因编码不同结构域的序列以及完整序列进行敲除构建ie0缺失型病毒,以野生型病毒为对照,研究ie0序列完全或部分缺失对病毒转录、复制及对宿主细胞致病能力等方面的影响。结果表明ie0基因完整序列或编码各结构域的序列缺失后均会对病毒产生不同影响:宿主细胞中完全缺失型和部分缺失型病毒滴度均有不同程度降低;完全缺失型和部分缺失型病毒基因组的拷贝数均与野生型病毒无显著差异;部分缺失型病毒的晚期和极晚期基因转录水平变化与ie0基因完全缺失型病毒相一致,均显著低于野生型病毒,并且缺失锌指结构域编码序列的影响最为明显。MTT检测结果也显示ie0基因完全缺失后病毒对宿主细胞的致病能力有所下降。亚细胞定位显示IE0蛋白在细胞质、细胞核中均有分布,但主要位于细胞质。综上所述,ie0基因为BmNPV病毒增殖、基因组复制的非必需基因,但对病毒晚期和极晚期基因的转录具有调控作用,影响最为显著的为锌指结构域的编码序列,且该基因的缺失会导致病毒对宿主细胞的致病能力有所下降。     

苏芸金杆菌与核型多角体病毒对家蚕的联合致病作用

初步研究了苏芸金杆菌(Bacillusthuringiensis,B.t)和家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus,BmNPV)对家蚕的联合致病作用。结果表明,BmNPV可增强B.t的毒力,增效作用显著;3.6×104、1.2×105mL-1B.t可增强BmNPV的毒力;与单独感染相比,B.t与BmNPV联合感染可缩短LT500.1～2.1d,加速家蚕死亡。     

利用转基因RNA干涉提高家蚕对BmNPV的抗性初探

基于探讨利用转基因RNA干涉技术使家蚕获得对核型多角体病毒抗性的目的,将家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的DNA聚合酶基因、蛋白激酶(PK1)基因以及bro-d和orf1629基因的部分编码片段,分别以其反向重复的形式与家蚕Actin3启动子连接,构建了基于piggyBac转座子载体的转基因表达载体,通过显微注射于家蚕卵,获得了36~107个G1蛾区,得到了20~23头转基因阳性家蚕。经Southern杂交及RT-PCR分析表明,BmNPV的4个反向重复片段都已经导入家蚕基因组中,并且可以进行转录。攻毒实验结果表明,BmNPV的DNA聚合酶基因和PK1基因反向重复片段对病毒的增殖有抑制作用,从而使家蚕对BmNPV具有一定抗性;而BmNPV的bro-d和orf1629基因反向重复片段对病毒的增殖没有抑制作用。针对特定病毒的转基因RNAi技术有望使家蚕获得对该病毒的抗性。     

柞蚕核型多角体病毒对柞蚕蛹的感染性试验

苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)载体表达系统的建立,使数百种外源基因得到高效的表达.该系统的产业化开发如大量培养昆虫细胞,存在成本高、技术难度大等问题.建立柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyi nuclear polyhedrosis virus ,ApNPV)载体表达系统,是利用柞蚕蛹为宿主进行外源基因表达.我国柞蚕资源丰富,柞蚕的蛹体大,以蛹滞育越冬,能够满足工厂化生产的需求.柞蚕核型多角体病毒有3个不同亚株,本实验研究了ApNPV A株系[简称ApNPV(A)]对不同发育阶段和不同品种的柞蚕蛹的感染性,为利用柞蚕蛹表达外源基因的产业化开发奠定基础.