1株猪繁殖与呼吸综合征病毒云南株的遗传演化分析

将2008年云南某猪场送检的疑似猪繁殖与呼吸综合征病例的病料处理后,接种Marc-145细胞,并对其进行病毒分离和鉴定,将分离株命名为Yunnan-08株.根据GenBank中PRRSV的基因序列进行设计.合成了针对ORF5和ORF7基因的引物,将RT-PCR扩增目的基因克隆入pGEM-Teasy载体中进行测序,再将测序结果提交给GenBank.应用DNAstar软件包分析,将该毒株的ORF5和ORF7基因序列及其推断氨基酸序列分别与PRRSV欧洲型代表株Lv、美洲型代表株VR2332和中国参考株CH-1a(AY032626)等毒株相应基因序列进行核苷酸比对,并与ATCC-VR2332(U87392)株、Lv(M96262)株等毒株进行氨基酸同源性比较,绘制系统的进化树,确定遗传演化关系.结果表明,该分离株的ORF7与VR2332的ORF7基因同源性为56.9%,与Lv株的ORF7基因同源性为41.7%;该分离株的ORF5与VR2332的ORF5基因同源性为87.1%,与Lv株的ORF5基因同源性为63.8%.表明新分离到的PRRSV Yunnan-08株仍属北美型,但存在很大变异,该分离株的ORF5与中国标准株CH-1a的ORF5基因同源性为93.4%,而ORF7与中国标准株CH-1a的ORF7基因同源性仅为56.6%.同一个毒株不同的开放阅读框架遗传演化的差异如此之大,这在以往未见报道,该病毒的变异为我国对该病的防控设置了障碍,毒株遗传监测显得十分重要.     

羊口疮病毒贵州株B2L基因的克隆及其分子特征分析

根据已发表的ORFV B2L基因序列设计引物,进行B2L基因的特异性扩增,并将其克隆到pMD18-T载体后进行测序。结果表明,贵州株的B2L基因长为1 137 bp。核苷酸序列比较、分析,结果表明,贵州株与湖北株(GU320351)同源性最高,达99.1%,与2003年北美分离株(AY278208)和2003年美国动物园分离株(AY424971)同源性最低,为97.1%,所推导氨基酸的同源性为96.3%~99.5%。说明贵州株B2L基因与参考毒株之间差异不大。该研究为贵州省羊口疮病毒疫苗选择提供理论基础。     

PCV-2陕西株ORF2基因的克隆、分析及原核表达

【目的】克隆猪圆环病毒2型陕西分离株(PCV-2SX株)ORF2基因,并进行序列分析及原核表达。【方法】根据GenBank公布的PCV-2ORF2基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,应用PCR方法扩增PCV-2SX株ORF2全长基因,将其克隆入pGEM-T载体中,进行测序及序列分析。然后,将ORF2基因亚克隆入原核表达载体pET-32a中,在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blotting鉴定。【结果】扩增到了702bp的PCV-2ORF2全长基因。序列分析结果表明,PCV-2SX株ORF2基因与广西分离株(EF675237,ChinaGX)和巴西分离株(DQ861802,am21)的核苷酸序列同源性均达98.0%,氨基酸序列同源性均达98.3%,与其他毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在89.9%～97.9%和88.5%～98.0%。SDS-PAGE可检测到分子质量约为48ku的融合蛋白,主要以可溶性蛋白形式存在。Western-blotting分析表明,重组蛋白可被PCV-2阳性血清所识别。【结论】成功克隆了PCV-2SX株ORF2基因,并进行了原核表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白基因的克隆及表达

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增出PRRSV甘肃株的核衣壳蛋白(N)基因,将N基因克隆至pGEM-T easy载体上,获得含N基因的阳性重组质粒pGEM-T easy-N.对质粒中的插入片段进行测序,应用DNAStar分析所测序列与GenBank中已登录的PRRSV毒株的同源性,再将其亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,得到重组表达载体pGEX-4T-1-N,转化E.coliBL21(DE3)细胞,用SDS-PAGE检测表达产物,并对其进行纯化.结果表明:PRRSV甘肃株N基因核甘酸序列与PRRSV-VR2332株的同源性为93.3%,与欧洲LV株的同源性为66.1%;构建的重组表达载体在大肠杆菌中获得了成功表达,表达产物为40ku的可溶性融合蛋白.     

猪细小病毒YL株序列分析及其 VP2基因原核表达

为对猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)进行分子生物学研究,将该病毒YL株基因组分为4个重叠片段进行PCR扩增,并将扩增产物克隆到pGEM-T载体中,测定病毒基因组全长序列。另外,应用其中1对引物,通过PCR方法扩增出一段包含VP2主要抗原区域的片段,构建重组质粒pET-VP2,IPTG诱导表达。序列分析结果表明,PPV YL株和国内外PPV分离毒株NS1基因核苷酸同源性为97.8%～99.4%,氨基酸同源性为96.7%～99.5%,与国内外主要毒株VP2基因核苷酸同源性为98.7%～99.7%,氨基酸同源性为97.4%～99.8%。进化树分析表明,PPV YL株与BQ株(EU790641)毒株处在同一分支上,遗传距离最近。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子质量为56ku,经Western blotting检测具有生物学活性。     

REV分离株囊膜糖蛋白基因的克隆及序列分析

根据网状内皮组织增生症病毒（REV）SNV株env基因的序列，设计并合成了2对引物，利用该引物，以中国地方分离株SD9901、HA9901前病毒基因组cDNA为模板，通过PCR技术，成功地从国内分离的2株REV毒株中扩增出env基因，并将其克隆到pUCm-T载体中测序。将所得序列与SNV株进行比较，分析其同源性。结果表明：在核苷酸水平上，参考株SNV株的env基因与2株中国分离株的同源性分别为97.7%和95.0%；在氨基酸水平上，其同源性分别为96.9%和92.7%。分析进化关系，HA9901变异较大。     

PRRSV SD-TA变异毒株的分离及序列分析

从猪"高热病"病料中分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(SD-TA株),该病毒能够被抗PRRSV N蛋白单克隆抗体所识别.根据GenBank PRRSV经典株(VR-2332)和变异株(JXA1)基因序列分别设计合成了10对引物,利用RT-PCR扩增其基因序列,分别得到了预期的基因片段,将扩增的cDNA片段克隆入pMD18-T载体并测序.应用DNASTAR软件分析,与国内外已发表毒株的序列进行比较.结果显示,与美洲型相比,PRRSV SD-TA株相应基因核苷酸同源性为89.3 %～99.1 %,并且在Nsp2上缺失了30个氨基酸;与欧洲型代表毒株LV株相比同源性为59.9 %.遗传关系表明:SD-TA株属于高致病性变异株.     

禽呼肠孤病毒分离株σ2蛋白基因克隆及序列分析

为了解禽呼肠孤病毒（ARV）广西分离株与常用疫苗株在基因水平上的差异,将从广西某鸡场分离获得的2株ARV（R1、R2）分离株的σ2蛋白基因经RT-PCR扩增后,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α,重组质粒经PCR、双酶切鉴定及序列分析。结果表明,2株ARV分离株的σ2蛋白基因已成功克隆到质粒载体上;经序列分析发现,2株ARV分离株与ARV标准株S1133的核苷酸同源性分别高达99.2%和99.3%,其推导的氨基酸同源性分别高达98.1%和98.4%;两分离株间的核苷酸同源性为99.7%,其推导的氨基酸同源性为98.5%,具有很高的同源性。     

2006年-2008年河南省PRRSV分子流行病学调查

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332株的NSP2,ORF5-7基因的核苷酸序列,设计合成5对特异性引物,用RT-PCR方法扩增出10株PRRSV河南地方株的NSP2和ORF5-7片段,将扩增片段克隆到pMD-18T载体并进行测序。应用DNAStar序列分析软件对分离株的NSP2和ORF5-7基因和其推导的氨基酸序列与不同来源的PRRS毒株进行了同源性比较,结果表明PRRSV河南分离株的NSP2和ORF5-7基因与不同来源美洲型毒株之间的同源性分别为89.1%-98.1%和81.4%-96.1%,而与欧洲型毒株之间的同源性仅为46.7%-61.7%和44.7%-45.9%;同时将PRRSV河南分离株NSP2和ORF5-7基因的推导氨基酸序列与其他美洲型PRRSV毒株进行变异分析比较,证实了PRRSV河南分离株NSP2和ORF5-7基因发生了变异。     

种番鸭减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因的克隆与序列分析

运用PCR技术从表现产蛋异常的种番鸭分离鉴定的减蛋综合征病毒(EDSV)E05株中分段扩增六邻体蛋白基因,分别与克隆载体pMD18-T连接后,转化感受态细胞,对经PCR鉴定和酶切鉴定均为阳性的克隆进行测序.结果表明,E05株六邻体蛋白基因长度为2733 bp,共编码910个氨基酸.序列分析表明,该株病毒与鸡源EDSV 127株和鹌鹑源EDSV QU株六邻体蛋白基因的核苷酸同源性分别为99.6%和96.0%,氨基酸同源性分别为99.9%和99.3%.     

PRRSV河南株ORF7基因的克隆表达及条件优化

从猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)河南分离株(HN07-1、HN07-2)的细胞培养物中提取RNA,根据参考株IAF-exp91 N蛋白基因序列设计出2对引物,成功克隆出ORF7全长基因,并连接至pMD-19T栽体.基因测序结果表明,2株PRRSV河南分离株ORF7基因序列完全相同;该序列与HB-4(hs)同源性为...     

新城疫病毒HN09-69株P基因的克隆、序列分析及表达

【目的】对新城疫病毒(NDV)HN09-69株P基因进行克隆、序列分析和表达鉴定,为研究P和V蛋白的功能,及NDV新流行毒株的免疫预防提供理论依据。【方法】以HN09-69株NDV为研究对象,根据GenBank上发布的相关P基因参考序列设计引物,进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定分析,将P基因的核苷酸序列与相关参考株的P基因序列进行比对分析并构建进化树。将P基因克隆到原核表达载体PET28a(+)中,得到重组质粒rPET28a(+)-P,将重组表达质粒转化到BL21（DE3）中诱导表达,用SDS-PAGE电泳和Western blotting检测表达情况。【结果】扩增出了HN09-69株P基因的ORF,序列长度为1 188 bp。NDV HN09-69株核苷酸与弱毒株La Sota、clone-30同源性分别为82.5%和82.4%,与强毒株F48E8同源性为84.9%,与鸭源,鹅源NDV核苷酸同源性分别为97.9%～98.4%和96.0%～98.0%。SDS-PAGE电泳和Western blotting检测结果表明,重组P蛋白分子质量约为54 ku,符合预期结果,在大肠杆菌中主要以可溶性的形式表达。【结论】NDV HN09-69株与SDWF-02和SD-09鸭源强毒分离株同源性高,亲缘关系近。重组P蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

鸡传染性支气管炎病毒豫北株的分离与鉴定

[目的]分离与鉴定鸡传染性支气管炎病毒。[方法]从豫北某蛋鸡场疑似鸡传染性支气管炎的病鸡中采集气管分泌物、肾脏等组织分离病毒,进行血凝试验、NDV干扰试验,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对HN07的纤突蛋白S1基因进行扩增、克隆和序列测定。[结果]结果表明,分离到1株病毒,经连续鸡胚传代后,出现侏儒胚和蜷缩胚;血凝试验中,尿囊液无血凝性,而经胰酶处理后有血凝性;NDV干扰试验中,分离的尿囊液明显干扰NDV的增殖;病毒回归试验中病毒可引发接种鸡37.5%死亡;RT-PCR检测试验中,扩增到了约为1.7 kb的目的片段。DNAstar软件分析表明,测定基因具有IBVS1基因的共有分子特征,而且分离株HN07和HD株S1的同源性最高,核苷酸同源性为93.6%。[结论]分离的病毒株HN07为鸡传染性支气管炎病毒。     

PRRSV陕西分离株ORF5基因克隆、序列分析及原核表达

克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因,并进行序列分析及原核表达。根据GenBank公布的PRRSV ORF5基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV陕西分离株糖基化囊膜蛋白基因ORF5,将其克隆入pGEM-T载体中,进行测序及序列分析。再设计另外1对引物扩增ORF5缺失编码N端31个氨基酸残基的基因片段,将截短的ORF5基因亚克隆入原核表达载体pET-32a中,在大肠杆菌BL21中进行原核表达。结果扩增到603 bp的PRRSV全长ORF5基因,序列分析表明,分离株与北美型代表株VR-2332和欧洲型代表株LV氨基酸同源性分别为87.8%和54.5%。因此推测陕西分离株属于北美型。SDS-PAGE可检测到大小约为38 ku的融合蛋白,主要以可溶性蛋白形式存在。West-ern-blot分析表明,重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。     

鹅源新城疫病毒F和HN基因的表达及功能鉴定

鹅源新城疫病毒的F和HN基因经RT-PCR方法从尿囊液中扩增后分别克隆进pCR2．1载体,再分别亚克隆到真核表达载体pCI-neo上,构建了F基因的表达载体(pCI-F)和HN基因的表达载体(pCI-HN)。间接免疫荧光(IFA)鉴定结果表明:F和HN基因均能在细胞中得到较好的表达;将pCI-F和pCI-HN共转染CEF和COS细胞,转染的细胞中能形成明显的合胞体。而用pCI-F单独进行转染时,不能产生合胞体,说明F蛋白要发挥其融合作用必须要有HN蛋白的参与,同时也进一步证明F和HN蛋白与病毒的融合特性密切相关。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF1基因的克隆与原核表达

根据GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2) ORF1基因序列,设计合成了一对引物,扩增出PCV2新疆株ORF1基因片段.将扩增出的ORF1基因(945 bp)插入到pMD18-T载体中,筛选获得重组质粒,命名为pMD18-ORF1.将ORFI酶切产物亚克隆到原核表达载体pET-32a中,获得重组质粒,命名为pET-...     

乌鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR法,对分离于当地典型发病乌鸡群的IBDV(WJ株)进行了VP2基因的克隆与序列分析,并和相关毒株进行了比较。结果表明,WJ株与标准血清 型STC株的核苷酸和氨基酸的同源性只有91.39%和92.74%,而与超强毒株UK661和从当地鸡群中分离的超强毒株HN01株的核苷酸和氨基酸的同源性则较高,其中,与其核苷酸同源性分别为95.43%和95.87%,与其氨基酸同源性均为96.77%。且该毒株的VP2基因序列完全具备超强毒株的主要特征。由此说明,分离于当地发病乌鸡群的IBDV为超强毒株,并和当地流行的鸡IBD超强毒株有较高的同源性,但也有明显的差异。     

鸡传染性支气管炎病毒HN99株N基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N基因序列,设计并合成1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增IBVHN99株的N基因,并将其克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌Top10,提取pMD18-T-N重组质粒,进行酶切和PCR鉴定,并对阳性质粒进行测序,将测序结果与H52,Ark99,BJ等参考毒株进行序列分析。结果表明,N基因全长为1230bp,编码1条409个氨基酸组成的多肽;其核苷酸与H52,Ark99和BJ等毒株的同源性为88.4%~90.7%,氨基酸同源性为91.7%~94.4%;HN99株与H52,Ark99和BJ等其他各毒株的亲缘关系均较远,是1株新的IBV变异株。     

一株犬副流感病毒CPIV-BJ01株全基因组测序与其遗传变异分析

为分析本实验室分离的犬副流感病毒CPIV-BJ01株全基因组序列与其遗传变异情况,对CPIV-BJ01株全长进行分段扩增并测序,拼接获得全基因组序列,与GenBank发布的27株副流感病毒5型分别进行全基因组和包膜糖蛋白(F、SH和HN)核苷酸及氨基酸序列的相似性比对,分析其遗传进化关系。结果显示,CPIV-BJ01毒株与犬源PIV5 1 168-1亲缘关系最近,核苷酸相似性为99.9%,氨基酸相似性为99.8%。CPIV-BJ01的F和HN基因序列变化较为保守,核苷酸和氨基酸变化均在4%以内,其中F蛋白的氨基酸变化形成一处新的O-糖基化位点;CPIV-BJ01株的SH基因序列与其他演化分支毒株差异显著,核苷酸相似性为84.4%~97.0%,氨基酸相似性为31.8%~95.6%。综上,CPIV-BJ01株基因组序列与前人报道的毒株相比,在F、HN基因和部分非编码区存在核苷酸或氨基酸序列的改变,同时F蛋白存在糖基化修饰的改变,均为该毒株所特有,该研究结果丰富了中国CPIV流行株的基因组信息。