水貂细小病毒性肠炎实验室诊断方法研究进展

水貂细小病毒性肠炎是威胁水貂养殖的最大疾病之一。该病在我国广泛存在,一旦暴发将给水貂养殖业造成巨大的经济损失。为了防制该病,需要迅速、准确地作出诊断。经过几十年的努力,水貂细小病毒性肠炎诊断技术从最早的病毒分离鉴定到血清学试验,再到分子生物学技术,已逐渐向更敏感、更特异、更方便、更经济的方向发展。本文就水貂细小病毒性肠...     

水貂病毒性肠炎的诊治

水貂细小病毒性肠炎也叫水貂传染性肠炎,是由水貂细小病毒引起的急性传染性疾病,特征是白细胞高度减少、肠黏膜炎症和坏死变化。幼龄水貂有较高的发病率和死亡率,多数病貂转归死亡,造成巨大损失。1病原病原为细小病毒科、细小病毒属的水貂肠炎病     

抗水貂肠炎细小病毒单克隆抗体的建立

以我国分离的水貂肠炎细小病毒（ＭＥＶ）为抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠获得的脾细胞与ＮＳ－１骨髓瘤细胞融合，筛选出８株分泌抗ＭＥＶ的单克隆抗体杂交瘤细胞。经鉴定，８株杂交瘤细胞都属于Ｂ型抗ＭＥＶ单克隆抗体。     

水貂病毒性肠炎的防治

夏季是水貂病毒性肠炎的高发期,该病是由细小病毒引起的急性传染性肠炎,当年出生的幼貂发病率高达50%-60%,成年貂为30%左右,一旦发病传播很快,死亡率较高。对养貂业危害很大,养殖户必须足够重视。     

水貂病毒性肠炎的诊断与防治

水貂病毒性肠炎又称水貂传染性肠炎,是水貂的一种急性传染病,本病有较高的发病率和死亡率。1病的发生和传播1.1病原水貂病毒性肠炎病原为貂肠炎病毒,是细小病毒属的一员,与猫泛白细胞减少病毒相类似。本病毒对外界环境有较强的抵抗力,在寒冷季节带毒粪便在户外土壤中放置1年以上仍有毒力。0.5%福尔马林,2%苛性钠溶液,室温条件下12小时病毒失去活力。3%甲醛,4%氢氧化钠,0.2%过氧乙酸可杀死病毒。     

水貂病毒性肠炎的防治

水貂病毒性肠炎,又称为水貂乏自血球症或传染性肠炎,是一种以胃肠黏膜炎症和坏死、白细胞高度减少为特征的急性高度接触性传染病,貂病毒性肠炎病毒为细小病毒,是无囊膜的粒子,直径为18-26 mm,呈二十面体对称,壳粒直径为3-4 nm,基因组是单一分子的单股DNA,与猫泛白细胞减少症病毒有着亲缘关系,然而貂肠炎病毒对猫无感染性。     

水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗保存期试验

对2~8℃条件下保存90,120,150,180,210,240,300,360 d的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗接种水貂进行免疫试验,结果表明:保存300 d的疫苗接种水貂30 d后血清中水貂肠炎细小病毒(MEV)HI抗体均在1∶32以上,免疫水貂强毒攻击均获得100%保护,确定水貂细小病毒细胞灭活疫苗保存期为300 d。该结果为水貂细小病毒细胞灭活疫苗运输和保存提供了理论依据。     

水貂病毒性肠炎弱毒疫苗株的选育及实验免疫研究

从自然发病死亡貂体内分离到１株水貂病毒性肠炎（ＭＶＦ）强毒株－ＭＥＶ，将该株病毒在犊牛睾丸（ＣＴ）细胞和猫肾传代细胞（ＣＲＦＫ）上混合培养进行适应。当传至５６代时，在ＣＴ细胞上出现细胞病变（ＣＰＥ），而后单独在ＣＴ细胞上传至７０代，经终点稀释克隆和鉴定获得一弱毒株。以其制备的ＣＴ细胞弱毒疫苗，给每只貂注射或口服１～５ｍＬ均未见任何不良反应。注苗后１２、６０、７２、１８０ｄ攻毒，保护率均为１００％。     

致病性水貂肠炎病毒MEV-ZJ1株的分离与鉴定

自临床疑似水貂病毒性肠炎发病貂的粪便中分离出1株病毒,经病毒形态观察、理化特性检测、血清学、聚合酶链式反应（PCR）和动物试验鉴定表明,该分离毒为水貂肠炎病毒（mink enteritis virus,MEV）,命名为MEV-ZJ1株。用分离毒接种水貂,试验动物均表现出典型水貂病毒性肠炎临床症状。研究表明,MEV-ZJ1分离株对水貂具有致病性,是1株强毒,为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫与诊断检测的研究奠定了基础。     

猫细小病毒、犬细小病毒、貂细小病毒的特征比较

猫细小病毒、犬细小病毒和貂细小病毒是3种极为相似的细小病毒。最初人们主要根据患病水貂、猫、犬临床症状相似的特点,注意到它们之间可能有密切关系。时至今日,对这3种病毒的许多方面都已进行了深入的研究。作者从猫细小病毒、犬细小病毒、貂细小病毒病共同特性、生物学差异和进化机制等方面对这3种病毒的特征进行了比较和综述。     

水貂肠炎病毒的提纯及部分生化特性分析

应用高速离心—PEG沉淀—蔗糖和氯化铯密度离心—氯化铯平衡密度梯度离心等方法,从水貂肠炎病毒猫肾细胞培养物中提纯病毒粒子。提纯的病毒粒子分为氯化铯浮密度为1.32～1.36g/ml的空壳病毒粒子和氯化铯浮密度为1.40～1.42g/ml的实心病毒粒子。应用SDS—PAGE分析,实心病毒粒子有结构蛋白3种,(VP_1,VP_2、VP_3),空壳病毒粒子有2种(VP_1、VP_2);从第5d培养物中提纯的实心粒子的VP_3含量少于第7d培养物的量。从第7d培养物中提纯的实心病毒粒子经尿素、NP_(40)、TritonX—100裂解后,在薄层聚丙烯酰胺等电聚焦电泳中出现4条蛋白带。从感染48h的细胞培养物中提取到水貂肠炎病毒线状双股复制型DNA(RF—DNA)。通过琼脂糖凝胶电泳测定,该RF—DNA大约有5000个硷基对。经限制性内切酶分析,RF—DNA有2个HindⅢ酶切点,1个PstⅠ酶切点和1个ECoRⅠ酶切点。     

水貂肠炎细小病毒的分离鉴定及其VP2基因的序列分析

本试验从疑似细小病毒感染的病死水貂中分离到1株病毒。经PCR鉴定、细胞培养、蛋白质电泳鉴定最终确定为水貂肠炎细小病毒(MEV),命名为MEV-WFD。对该分离病毒的衣壳蛋白VP2基因进行克隆测序分析,结果表明此病毒VP2基因3处碱基发生点突变,其中一处的突变导致第328处氨基酸残基由疏水性丙氨酸(Ala)变为亲水性苏氨酸(Thr)。将此株病毒VP2基因与GenBank上公布的所有MEV的VP2基因碱基序列进行同源性比较及进化树分析,结果表明该病毒与ZYL-1、MEV/LN/-10和Manzhouli的VP2基因同源率最高,为99.8%;进化树构建结果表明,该病毒与6株已公布的病毒属于同一进化分支。     

水貂肠炎病毒VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV) VP2 基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEV VP2 基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFast-BacⅠ载体中,构建重组转座载体后转化DH10 Bac感受态细胞,获得重组Bacmid 质粒后转染Sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行 Western blotting鉴定。结果成功克隆MEV VP2基因。Western blotting结果证实,表达蛋白能够被MEV单克隆抗体识别。在 Bac-To-Bac 杆状病毒表达系统中成功的表达了MEV VP2蛋白,目的蛋白具有较好的反应原性。     

水貂肠炎细小病毒灭活疫苗抗体消长规律的研究

应用血凝抑制试验对水貂肠炎细小病毒灭活疫苗免疫水貂进行抗体水平动态监测,结果表明,疫苗接种14 d抗体达到保护,21~30 d抗体水平达到高峰;免疫180 d抗体仍在保护值以上。攻毒试验证实,免疫180 d后90%免疫水貂获得保护,确定水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗免疫保护期可持续6个月。