猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) Nsp7的免疫原性,本研究将PRRSV Nsp7进行了原核表达.SDS-PAGE和western blot试验表明,Nsp7在大肠杆菌中获得大量表达,并且其具有较好的反应活性.采用Nsp7免疫小鼠制备多克隆抗体,并进行间接ELISA检测,表明多克隆抗体效价达到1∶32000以上;间接免疫荧光试验表明,多克隆抗体能够特异性识别PRRSV的Nsp7,显示出Nsp7具有较好的免疫原性.本研究获得了高纯度可溶性的PRRSV Nsp7,并进一步制备多克隆抗体,为研究Nsp7蛋白的免疫学特性提供实验依据.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒FS株Nsp9基因的克隆与序列分析

为了对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）Nsp9基因的功能进行预测,利用RT-PCR法从细胞毒中扩增PRRSV FS株的Nsp9基因,并将其克隆至pMD18-T载体上,测序得到Nsp9基因序列,利用多种生物信息学软件分析Nsp9序列生物学信息。结果显示,Nsp9基因全长1 929 bp,目的基因的蛋白分子质量为70.5 ku,pI为7.78,表明该蛋白不稳定;抗原性分析显示,Nsp9基因存在多个抗原位点,柔韧性较好,多处位点的亲水性较强,适合作为单抗制备的表位;同种亚型不同毒株的Nsp9基因氨基酸同源性为96.9%～98.9%,这表明Nsp9基因高度保守,可进一步作为检测靶蛋白用于猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的诊断与疫苗免疫;亚细胞定位预测该基因可能定位于细胞质中,而不是细胞核内;同源建模预测三级结构结果显示,三维结构呈右手型,具有3个亚结构域,没有信号肽。此外,亲本株Nsp9基因与疫苗株Nsp9基因存在多个氨基酸的突变,这些氨基酸的插入与缺失是否与病毒的聚合酶活性和毒力有关还需要进一步试验验证。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因的克隆与原核表达

将猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)基因进行克隆、表达,并获得纯化重组蛋白,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp的功能奠定基础.以RdRp基因cDNA为模板,用PCR扩增出RdRp基因片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pET32a(+)重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导高效表达.PCR法扩增出720 bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在大肠埃希菌LB21中表达得到分子质量约为46 ku的融合蛋白.成功克隆及表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的高度接触性传染病。主要引起母猪繁殖障碍,表现为妊娠后期流产,死胎,木乃伊胎及弱仔;各日龄段的猪特别是仔猪感染PRRSV引起呼吸道疾病,以间质性肺炎为特征,论文主要从近几年研究的PRRSV的非结构蛋白特性、免疫学功能、非结构蛋白基因的变异等方面进行分析,阐述非结构蛋白在病毒的增殖、致病力产生的影响,从而为进一步的研究提供一定的理论基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白9研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),又常被称作为猪蓝耳病毒,能够引起猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)。该病具有高度传染性,能造成母猪繁殖障碍和仔猪呼吸障碍与高死亡率,严重影响了全球生猪养殖业的发展。目前,对该病尚无十分有效的疫苗和治疗药物,对PRRSV的致病机制的相关研究为PRSS的防控提供依据。文章综述了PRRSV的非结构蛋白9(non-structural protein 9,Nsp9)与病毒复制、病毒致病性和免疫调控等的相关研究进展,旨在为PRRS的控制及其新型疫苗的设计与研发提供参考。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆与原核表达

通过PCR方法从重组质粒扩增得到猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)结构蛋白ORF5基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a,得到重组表达载体pET-32a-GP5,转化大肠埃希菌BL21.用不同浓度的IPTG分别于37 ℃诱导.经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为31.4 ku;薄层扫描分析显示,表达量占菌体总蛋白含量的28.8%.重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白基因的克隆及原核表达

通过RT-PCR技术从细胞毒液中扩增N蛋白cDNA,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,所获得的重组质粒pET-28a-N经酶切鉴定正确后,将其转化入表达菌E.coliBL21plysS诱导表达,用SDS-PAGE与Western blotting对表达产物进行鉴定。结果表明,通过RT-PCR扩增获得长度为372 bp的N蛋白基因,诱导表达重组质粒pET-28a-N,经SDS-PAGE检测,IPTG终浓度为1 mmol/L时,诱导4 h蛋白表达量最高,出现分子质量约为18 ku的目的蛋白带,与N蛋白的理论值相符。经Western blotting检测,该表达产物可与PRRSV阳性血清发生特异性反应。获得的PRRSV N蛋白为建立针对该病毒抗体的间接ELISA检测方法,以及为进一步研发PRRS抗体检测试剂盒奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒 Nsp10基因的克隆及序列分析

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒 BJ-4序列,选择Nsp10基因保守区域设计并合成特异性引物,用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州地方株(命名为JL株)Nsp10基因片段,克隆到pMD18-T载体并测序,应用DNASTAR、Clustal_1.81和Mega序列分析软件进行同源性比较.结果表明:贵州JL株Nsp10基因的cDNA长699 bp,可编码233 个氨基酸;贵州JL株Nsp10基因与早期分离毒株MLV株、BJ-4株、VR-2332株、CH-1a株、CH2002株和GS2004株相应序列的核苷酸同源性为 91.7%～94.0%,氨基酸同源性为97.4%～98.7%;而与最近分离毒株HN2007株、SX2007株、GD2007株、YN2008株、GS2008株、XL2008株、TJ株和JXA1株的核苷酸同源性为 98.3%～98.6%,氨基酸同源性为 99.6%～100%.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的亚克隆及原核表达

本研究从河北省保定地区6份疑似感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)病猪的肺脏中,通过RT-PCR获得PRRSV GP5蛋白完整的基因片段,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,再设计一对引物从重组载体pMD18-T-GP5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的dGP5的编码序列dORF5,克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建原核重组质粒(pGEX-6p-dGP5),转化至E.coli BL21感受态细胞。经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳可检测到分子质量为40ku的目的蛋白。经Western blot分析表明,该蛋白与PRRS阳性血清具有良好的免疫反应性,为进一步研究PRRS新型基因工程疫苗和诊断试剂奠定了基础。     

Cloning and Sequence Analysis of Nsp9 Gene of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus FS Strain

In order to evaluate the function of Nsp9 gene,the target gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) FS strain was amplificated and sequenced after being cloned into the pMD18-T vector.The physical and chemical properties,homology,hydrophilicity,surface probability plot,antigenic index,secondary structure and subcellular localization were predicted by various softwares.The results showed that the length of Nsp9 was 1 929 bp,its predicted molecular weight was 70.5 ku and pI was 7.78,and it was unstable protein.There were many antigen sites,and the flexibility and hydrophilicity of Nsp9 were ideal.The study showed that Nsp9 possessed potential antigenicity,and it fits for preparation of monoclonal antibodies.The results of subcellular location showed that it might exist in the cytoplasm.Nsp9 of FS strain shared 96.9% to 98.9% amino acid homology with other strains of the some hypotype.Some amino acid mutations were found between the parent strains and vaccine strains,and insertions and deletions could be found among the European strains and the American strains.Whether these insertions and deletions correlate with the virulence and polymerase needed further research.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州PT分离株Nsp2基因克隆及序列变异分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)贵州PT分离株Nsp2基因序列特征,选择PRRSV JXA1株Nsp2基因保守区域设计并合成特异性引物,用RT-PCR方法扩增出PRRSV贵州PT分离株Nsp2基因片段,克隆至pMD18-T载体并测序,应用DNAStar、PSORTⅡ、TMHMM、MLRC等软件对Nsp2序列的理化参数、同源性、亲水性、表面可及性、抗原性和亚细胞定位等进行分析和预测。结果显示,该基因cDNA长588 bp,蛋白理论分子质量为21.5674 ku,理论pI值为5.02,为不稳定蛋白,具有良好的形成抗原表位的条件。亚细胞定位结果表明该蛋白极有可能位于细胞核,其Nsp2基因与所选18个毒株相应片段的同源性为80.0%~99.8%。预测Nsp2蛋白具有良好的抗原性,在PRRSV的流行过程中,Nsp2基因不断发生遗传变异,产生新的变异序列。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的原核表达及鉴定

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白,以一株PRRSV NADC30-like毒株的基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增出ORF5基因后,将该基因克隆至原核表达载体pCold-TF中,构建了重组质粒pCold-TF-GP5,转化Rosetta(DE3)后用IPTG诱导,经SDS-PAGE、Western blot鉴定,重组蛋白获得了可溶性表达,大小约为72 ku。将该蛋白过镍柱纯化后获得浓度为0.5 mg/mL的纯化蛋白,为下一步GP5蛋白单克隆抗体的制备奠定物质基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SCQ株M蛋白基因截断片段原核表达载体构建及其表达的初步研究

为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白主要抗原表位基因序列,参照GenBank中发表的PRRSV SCQ株M蛋白基因设计并合成一对特异性引物,通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM(deleting M),将其与pMD19-T simple vector连接,经测序正确后克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组表达载体pGEX-4T-1-dM,并将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG于37℃诱导,PRRSV M基因获得表达。经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为35 kDa。以纯化的重组蛋白作为抗原,经Western Blot分析结果表明该重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SGQ株M蛋白基因截断片段原核表达载体构建及其表达的初步研究

为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）M蛋白主要抗原表位基因序列,参照GenBank中发表的PRRSVSCQ株M蛋白基因设计并合成一对特异性引物,通过PCR方法从重组质粒pMD18-T-M扩增得到缺失N端跨膜区的M蛋白基因片段dM（deletingM）,将其与pMD19-Tsimplevector连接,经测序正确后克隆至高效原核表达载体pGEX-4T-1,得到重组表达载体pGEX-4T-1-dM,并将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,经IPTG于37℃诱导,PRRSVM基因获得表达。经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为35kDa。以纯化的重组蛋白作为抗原,经WesternBlot分析结果表明该重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测。     

两株高致病性PRRSV河北分离株NSP2和ORF5基因的克隆及遗传变异分析

从河北省保定某两个猪场疑似高致病性猪繁殖与呼吸综合征病料中分离出能引起Marc-145细胞病变的病毒,经RT-PCR鉴定证明,该病毒为美洲型PRRSV,分别命名为BD1和BD2株。并将其克隆、测序,与国内外PRRSV分离株的Nsp2和E基因序列进行了比较。结果表明,与PRRSV高致病性毒株JXA1、GD、WUH1、SY0608、HUN0701的核苷酸序列同源性为95.3%~96.5%,BD1和BD2株ORF5基因存在部分突变,没有缺失,与国内高致病性PRRSV分离株JXA1、HUB1、Jiangxi-3、Henan-1、WUH1的同源性高达97.2%~99.3%。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株ORF6基因的克隆与原核表达研究

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF6基因序列,设计合成一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出PRRSV的ORF6基因(M基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF6重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF6基因序列进行分析。结果表明,ORF6基因的原核表达载体构建成功。ORF6基因推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为96.0%～100%,与LV株的同源性为79.9%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。将构建成功的重组质粒pET-ORF6转化BL21,诱导后经SDS-PAGE和Western-blot分析表明:克隆在HIS标签的膜基质蛋白基因与HIS获得了高效表达,表达的融合蛋白HIS-M分子量约为39kDa,并且有免疫学反应活性。