一株GPV的分离鉴定及致病性研究

为了确定导致吉林省某地区10日龄雏鹅发病的病原,从病死雏鹅的肝脏中分离到一株病毒,根据病毒的电镜照片,动物回归试验及PCR鉴定,确定为鹅细小病毒。PCR产物测序后经BLAST比对显示,分离毒株与NCBI收录的GPVVP3基因同源性均在92％以上,与GPV／CH／HLJ02／08VP3基因的同源性最高,达99％。致病性研究表明,分离株的ELD50为10^-6.5／0．2mL,毒力较强,且该毒株能被GPV标准血清所中和。     

2013年苏皖地区鹅细小病毒的分离鉴定及其VP3基因序列分析

鹅细小病毒(GPV)主要引起雏鹅和雏番鸭的高死亡率。本研究对2013年采集的苏皖地区疑似GPV感染的病鹅组织,通过鹅胚病毒分离以及PCR扩增,共分离鉴定出11株GPV病毒。这11株GPV病毒的鹅胚致死时间为43¹59h。与NCBI中检索到的21个VP3进行的序列分析发现,这些GPV的VP3氨基酸同源性为97.2%159h。与NCBI中检索到的21个VP3进行的序列分析发现,这些GPV的VP3氨基酸同源性为97.2%¹00%。进化树分析表明,新分离的GPV VP3与分离于1982年的台湾GPV毒株82-0308最接近。与其他分离株VP3比较,这11株中有3株VP3中存在N35D、V261L、Y293H共突变现象。这些苏皖地区GPV毒株的分离、鉴定以及序列特征,对进一步探究苏皖地区GPV病毒的分子演化特征以及流行病学提供了材料。     

三株鹅细小病毒VP3基因的克隆和序列研究

为深入研究鹅细小病毒VP3基因的功能,利用PCR方法克隆了3株GPV分离株的VP3基因,并将其与pMD18-T载体连接,转化到感受态大肠秆菌Top10中,经PCR鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析.结果表明:3株GPV VP3基因全长均为1 605 bp,编码534个氨基酸.不同毒株主要结构蛋白VP3基因与鹅细小病毒B株核苷酸序列同源性为93.8％～98.5％,但强弱毒株间也存在一定差异.     

鹅细小病毒强毒株的分离鉴定与遗传进化分析

为了了解齐齐哈尔地区鹅细小病毒（GPV）现地强毒株的流行及抗原变异情况,试验从齐齐哈尔龙江县某养殖场采集疑似小鹅瘟病死雏鹅的肝脾病料进行病毒分离培养,对获得的疑似尿囊液进行PCR检测、血凝性检测、动物回归试验及VP3基因序列分析。结果表明,分离到的病毒株能使12日龄鹅胚在144 h内死亡;血凝性检测未检测出血凝价;动物回归试验,可复制该病,致使5日龄雏鹅在96～144 h内全部死亡;VP3基因PCR扩增条带大约为1 600 bp,与目的条带大小相符;对其进行序列分析,判定该分离株为鹅细小病毒毒株,与我室之前分离鉴定的鹅细小病毒HH10强毒株核苷酸同源性为98.17%,与标准B株核苷酸同源性为97.13%。说明鹅细小病毒基因保守。     

番鸭细小病毒安徽分离株结构蛋白基因的克隆及序列分析

为研究番鸭细小病毒(MDPV)安徽分离株的遗传变异特征,通过PCR扩增获得了MDPV结构蛋白(VP)基因全长序列AH-MDPV-VP,并将该序列与GenBank中登录的12条MDPV和鹅细小病毒(GPV)VP基因序列进行比对。结果显示,AH-MDPV-VP基因全长2 199bp,包括完整的VP1、VP2和VP3蛋白编码区。MDPV与GPV的VP基因部分序列一致,但具有明显的差异。进化分析显示,MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH为同一分支,亲缘关系较近。同源性分析显示二者核苷酸序列同源性最高,为99.9%,且AH-MDPV-VP与GPV毒株SHFX1201的序列同源性也有89.5%。此外安徽分离株与其他MDPV的VP1、VP2和VP3基因同源性有逐步下降的趋势,而与GPV则相反呈上升趋势。进一步显示MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH相似,可能为MDPV和GPV基因重组型水禽细小病毒。     

基因重组型番鸭细小病毒FJM3的全基因组特征

从1例未免疫雏番鸭细小病毒活疫苗与鹅细小病毒活疫苗的临床病死雏番鸭脏器中成功分离到1株番鸭细小病毒(FJM3株)。为明确其基因组特征,运用PCR方法,扩增出番鸭细小病毒FJM3株全基因组。结果表明,FJM3株基因组全长为5017nt,其基因组结构和经典番鸭细小病毒参考毒株一致。序列比对结果表明,FJM3株全基因组序列与GenBank中登录的经典MDPV参考株(FM株)核苷酸序列同源性为94.0%,与番鸭源GPV参考株(Y株)核苷酸序列同源性为85.6%。全基因组遗传进化分析表明,FJM3株处于MDPV遗传进化分支;VP1基因遗传分析表明,FJM3株处于经典MDPV遗传进化分支;VP3遗传进化表明,FJM3株处于GPV遗传进化分支。对FJM3株和参考株(FM株、Y株和SYG61v)进行遗传重组分析表明,该毒株于存在2处MDPV与GPV的基因重组现象。     

鹅细小病毒不同毒株VP13基因的克隆与序列分析

分别将鹅细小病毒(GPV)的5个分离株通过PCR技术,从病毒基因组DNA中扩增出病毒蛋白VP1和VP3非重叠区的基因片段(VP13基因),并与pMD18-T质粒载体连接,转化到感受态大肠埃希菌Top10中,经PCR鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析。结果表明,5株GPV VP13基因全长均为594 bp,编码198个氨基酸。不同毒株主要结构蛋白VP13基因与国外已发表的鹅细小病毒B株核苷酸序列相似性较高(93.4%～98.7%),但毒株间也存在一定差异。     

番鸭源鹅细小病毒ZQ株VP2基因的克隆和序列分析

根据国内外已发表的鹅细小病毒(GPV)B株和GD株基因序列,应用DNA Star分子生物学软件设计一对引物,应用PCR技术扩增GPV ZQ株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到pMD18-T载体上,获得的重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定。结果表明ZQ株基因大小为1 764 bp,编码587个氨基酸,其基因序列与GPV参考毒株推导的氨基酸序列同源性在89.1%~99.3%之间,差异较大;与番鸭细小病毒(MDPV)参考毒株相比同源性在92.0%~92.5%之间,超过与部分GPV毒株的同源性,推测可能与该毒株来源于番鸭而不是鹅有关,另外也在基因水平上解释了GPV与MDPV在血清学上存在交叉反应的部分原因。     

鹅细小病毒SS/10株的分离鉴定及生物学特性研究

2010年从佛山市某专业户送检的雏鹅肝组织中分离到1株鹅细小病毒(命名为SS/10株),并对其生物学特性进行了研究。该毒株的番鸭胚半数致死量为10^-4.6/0.3 mL,动物回归试验显示其对10日龄雏鹅没有致死性,从组织切片观察肠、肝脏、肾脏和脑组织均有明显的病理变化。对该毒株测序分析结果发现,其VP1、VP2和VP3基因与GenBank收录的番鸭分离株DY株的同源性较其他参考毒株(鹅分离株)的同源性低,NS1和NS2基因的同源性没有这种差异;其VP3基因与82-0321V,VG32/1和标准株B株在同一分支上,与82-0321V亲缘关系最近,与番鸭细小病毒GD株亲缘关系最远;其VP3基因与B株相比少了505-507位的糖基化位点NRT。     

鹅细小病毒HN株的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究鹅细小病毒(GPV)基因遗传变异特征,采集海南某养鹅场疑似鹅细小病毒感染的病料,将其处理后接种番鸭胚成功分离到一株病毒,经PCR鉴定为鹅细小病毒,命名为HN株,并获得了其全基因组序列,将该序列与GenBank数据库中登录的16条鹅和番鸭细小病毒基因序列进行了比对分析。结果显示,该株病毒基因组全长为5 106bp,由ITR、NS、VP构成,其中ITR为444bp,NS1为1 844bp,VP1为2 199bp;HN株与SHFX1201株的NS1基因和VP1同源性最高,分别达到99.8%和99.7%,与番鸭细小病毒株FM的NS1基因同源性最低,为82.7%;与90-0215株VP1同源性最低,为80.1%。HN株的遗传进化树可以看出,GPV可以分成明显的2个基因亚群,HN株与鹅细小病毒匈牙利株(B)、欧洲疫苗株(VG32/1)和台湾株(82-0321V、82-0321、06-0329)均处在第I亚群,且与安徽分离株Y株以及SHFX1201株同源性最接近,番鸭源匈牙利株FM单独处于第Ⅱ亚群。本研究丰富了GPV的数据资料,为研究GPV分类地位以及遗传进化关系提供了依据,同时也为研究GPV流行趋势和疫苗的开发奠定了基础。     

吉林地区1株小鹅瘟病毒NS1和VP1基因的克隆与序列分析

为了解吉林地区小鹅瘟病毒（Gosling plague virus,GPV）的基因特征,及其与黑龙江及中国其他省份和国外流行毒株的相关性,本研究采用PCR方法鉴定2018年吉林某养鹅场送检的病死雏鹅的肠组织,同时对GPV的非结构蛋白NS1基因及结构蛋白VP1基因进行了克隆和测序,并与国内外16株GPV参考毒株的相应序列进行分析。结果表明,病死雏鹅为GPV与减蛋综合征病毒（Egg drop syndrome virus,EDSV）混合感染;吉林地区GPV的NS1基因长为1 884 bp,编码627个氨基酸,与参考毒株核苷酸序列同源性为93.8%~99.8%,氨基酸序列同源性为97.1%~99.7%;VP1基因长为2 199 bp,编码732个氨基酸,与参考毒株核苷酸序列同源性为93.4%~99.9%,氨基酸序列同源性为96.4%~99.9%。NS1及VP1基因的系统进化树分析均表明,吉林地区GPV与哈尔滨分离株98E属于同一进化分支,亲缘关系最近,与国外分离株、中国台湾和安徽分离株亲缘关系均较远。吉林地区GPV与鹅源GPV具有较近的亲源关系,同源性明显高于其他水禽来源的GPV。该研究为明确中国东北地区GPV空间的流行规律提供基础数据,为东北地区GPV的诊断与治疗提供参考依据。     

免疫雏鹅发生小鹅瘟的原因分析

2018年6月,安徽某鹅场接种过小鹅瘟蛋黄抗体的2批雏鹅发生小鹅瘟,再次用小鹅瘟蛋黄抗体产品进行紧急接种,有一定的控制效果,但仍有雏鹅死亡。为分析其原因,采集了8只9-12日龄病死鹅的肝脏和脾脏,用PCR扩增检测水禽细小病毒的VP3基因,选8份阳性样品测定了鹅细小病毒(GPV)VP1部分序列并进行了序列分析。结果显示,16份组织样品均为阳性。在443 nt VP1区,所测8株病毒之间的序列同源性为100%,与GPV亚洲强毒分支之间的序列同源性为99%。随后,用琼脂扩散沉淀试验分析了2株待检毒株与GPV参考毒株的抗原相关性,并测定了2种小鹅瘟蛋黄抗体产品的效价。结果显示,待检毒株与参考毒株具有相同的沉淀抗原,2种小鹅瘟蛋黄抗体产品的效价分别为1∶2和1∶16。表明免疫雏鹅仍发生小鹅瘟的原因并非源自GPV变异,而是与某些蛋黄抗体产品的抗体效价较低有关。     

鹅细小病毒VP3亚单位疫苗的制备及其免疫效果

为了研究鹅细小病毒(GPV) VP3亚单位疫苗的免疫效果,从ZJ-04分离株基因组DNA扩增VP1和VP3基因并克隆到pMD18-T载体,测定其核苷酸序列;将VP3基因亚克隆至质粒载体pET-32a(+),重组质粒pET-VP3用于转化E.coli BL-21(DE3)感受态细胞获得重组菌BL-VP3;以VP3重组蛋白和BL-VP3重组菌制备油乳剂疫苗免疫接种种鹅,用琼脂扩散试验检测血清GPV抗体,观察母源抗体对雏鹅GPV感染的免疫保护效果.结果表明,ZJ-04株VP1基因大小为2 199 bp,编码732个氨基酸,与Gen-Bank收录的GPV毒株的核苷酸序列同源性为95.3％～99.2％,氨基酸序列同源性为97.7％～99.3％;SDS-PAGE、Western blot检测结果表明,重组VP3分子质量约80 ku,能与GPV抗体发生特异性反应;VP3包涵体和BL-VP3重组菌均能诱导种鹅产生GPV抗体,新生雏鹅可获得良好的免疫保护.     

鹅细小病毒国内分离株主要结构蛋白（VP2-VP3）基因的克隆和序列分析

根据国外已发表的鹅细小病毒（GPV）A株基因组核苷酸序列设计了一对引物,对国内两株鹅细小病毒毒株(GPV　CC株)和(GPV　FS株)主要结构蛋白（VP2-VP3）基因进行PCR扩增，并克隆到pCR3.1T载体，分别获得正向、反向连接重组质粒pVPC1、pVPC2和pVPF1、pVPF2，经酶切鉴定筛选出阳性克隆质粒并进行核苷酸序列分析比较，序列分析结果表明：GPV　CC株和GPV　FS株VP2-VP3的核苷酸大小分别为1　764　bp和1　763　bp,其中GPV　CC株与A株同源性达到98.9%；GPV　FS株缺失一个碱基,与A株同源性为93.5%,与GPV　CC株同源性为93%。     

鹅细小病毒安徽分离株NS和VP基因的克隆及序列分析

为研究安徽省鹅细小病毒（goose parvovirus,GPV）的遗传变异特征,本研究通过PCR扩增获得GPV基因AH,并与天鹅、番鸭、雁鹅等宿主的GPV相应基因序列进行了比对。序列分析可见,AH基因包括完整的NS和VP基因,长度分别为1 884和2 199 bp,分别编码2个非结构蛋白和3个结构蛋白。遗传进化分析显示,安徽分离株AH基因与重庆分离株毒株RC16及安徽分离的强毒株Y、E、Yan-2等基因序列的遗传距离较近;而与安徽分离的鸭源细小病毒株DS15和匈牙利分离株Virulent B,尤其是与疫苗株SYG61v遗传距离较远。同源性分析结果表明,AH-NS基因与毒株RC16核苷酸序列同源性最高,为99.6%;与疫苗株SYG61v同源性最低,为94.3%;AH-VP基因与毒株RC16的核苷酸序列一致,而与毒株DS15同源性仅为95.2%。安徽GPV AH基因序列与强毒株的基因位点一致,在VP3基因的第797、1 141、1 144、1 169和1 185 bp处分别为G、A、G、C、T,结合该毒株引发疾病的严重程度,符合高致病力毒株特点。本试验结果表明,GPV同源性普遍较高,宿主范围较广泛,对不同品种水禽均有较强的侵染力。     

鹅细小病毒安徽分离株NS和VP基因的克隆及序列分析

为研究安徽省鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)的遗传变异特征,本研究通过PCR扩增获得GPV基因AH,并与天鹅、番鸭、雁鹅等宿主的GPV相应基因序列进行了比对。序列分析可见,AH基因包括完整的NS和VP基因,长度分别为1 884和2 199bp,分别编码2个非结构蛋白和3个结构蛋白。遗传进化分析显示,安徽分离株AH基因与重庆分离株毒株RC16及安徽分离的强毒株Y、E、Yan-2等基因序列的遗传距离较近;而与安徽分离的鸭源细小病毒株DS15和匈牙利分离株Virulent B,尤其是与疫苗株SYG61v遗传距离较远。同源性分析结果表明,AH-NS基因与毒株RC16核苷酸序列同源性最高,为99.6%;与疫苗株SYG61v同源性最低,为94.3%;AH-VP基因与毒株RC16的核苷酸序列一致,而与毒株DS15同源性仅为95.2%。安徽GPV AH基因序列与强毒株的基因位点一致,在VP3基因的第797、1 141、1 144、1 169和1 185bp处分别为G、A、G、C、T,结合该毒株引发疾病的严重程度,符合高致病力毒株特点。本试验结果表明,GPV同源性普遍较高,宿主范围较广泛,对不同品种水禽均有较强的侵染力。     

GPV野毒株鉴定及其致病力试验

在送检的小鹅瘟病料中分离到1株病毒,经NS1基因特异性引物扩增后确定是GPV。用该对引物对从鹅细小病毒野毒感染的病鹅分离的GPV野毒株进行PCR检测,结果该结引物能特异性地扩增出与预期片段大小相符的1.9kb片段。回归试验结果表明,该GPV野毒株的感染潜伏期为8天,病程为1-3天,致死率达100%;对雏鹅半数致死量LD50为3.4。     

6株鹅细小病毒的分离及其VP3基因序列分析

为了解吉林省不同地区小鹅瘟流行情况,从吉林省磐石、白城、九台、德惠、辽源与镇赉地区鹅养殖场采集疑似小鹅瘟雏鹅的肠管,处理后接种SPF鹅胚成功分离到6株病毒(暂命名为PSH、BCH、JLJT、DH、LY与ZL株),经PCR鉴定为鹅细小病毒。VP3基因序列分析结果显示,分离到的6株鹅细小病毒VP3基因与近年来国内流行毒株同源性较高,核苷酸与氨基酸同源性分别为93.1%~99.6%与95.9%~99.4%。其中,BCH株、JLJT株与LY株属同一分支,与浙江和扬州等地区分离的鹅细小病毒相似性较高,达到99.4%~99.6%;ZL株、DH株与PSH株属同一分支,相似性较低。试验表明,吉林省流行的鹅细小病毒与我国南方地区流行毒株同源性较高,与其他地区流行毒株存在一定差异。     

鹅细小病毒国内分离株主要结构蛋白（VP2—VP3）基因的克隆和序列分析

根据国外已发表的鹅细小病毒（GPV）A株基因组核苷酸序列设计了一对引物，对国内两株鹅细小病毒毒株（GPV CC株）和（GPV FS株）主要结构蛋白（VP2－VP3）基因进行PCR扩增，并克隆到pCR3.1T载体,分别获得正向，反向连接重组持粒PVPC1，PVPC2和PVPF1，PVPF2，经酶切鉴定选出阳性克隆质粒并进行核苷酸序列分析比较，序列分析结果表明：GPV CC株和GPV FS株VP2－VP3的核苷酸大小分别为1764bp和1763bp，其中GPV CC株与A株同源性达到98．9％，GPV FS株缺失一个碱基，与A株同源性为93．5％，与GPV CC株同源性为93％。     

半番鸭胚中鹅细小病毒的分离鉴定及其基因组分子特征分析

通过胶体金试验、电镜观察及PCR扩增等方法,自半番鸭胚及孵化的雏半番鸭中分离获得了鹅细小病毒(GPV)毒株(命名为MDE株),并进行了病毒全基因组分子特征分析。结果表明,该病毒粒子为直径20~24nm的球形、无囊膜粒子。胶体金试验结果呈GPV阳性。该毒株基因组全长为5 106bp,与GenBank登录的15株GPV基因组序列相似性为93.2%~98.1%,其中与SH株及疫苗株SYG61v株等的相似性较高,而与半番鸭源的GPV重组病毒M15株相似性最低。基于病毒VP1和NS1基因的遗传进化分析表明,分离毒株MDE与GPV疫苗毒株的亲缘关系最近,处于同一个独立的分支上,与番鸭细小病毒的亲缘关系较远。与疫苗毒株SYG61v株比较,MDE株VP1区的糖基化位点增加了703NRTS糖基化位点。以上结果表明,本研究揭示了GPV可通过半番鸭胚垂直传播给雏鸭,丰富了GPV的生态学内容。