环境DNA技术及在鱼类监测中的应用

开展鱼类监测对鱼类多样性保护具有非常重要的意义。环境DNA(eDNA)技术使得鱼类调查更加省时省力、节约成本、无损伤,在鱼类监测中被广泛使用。文章从环境DNA技术及其优缺点、技术流程及方法、国内外研究现状以及该技术的未来展望4个方面进行了综述。eDNA技术存在着一定的缺陷,不能完全取代传统方法。e DNA技术包含了样品的采集及处理、eDNA提取、eDNA扩增、测序和生物信息学分析几个主要步骤,每个步骤又可采取不同的实验方案,进而影响eDNA的检测效率。eDNA技术主要应用于鱼类物种多样性监测、入侵物种检测、濒危物种检测和鱼类生物量的估算等方面。虽然国内eDNA的起步不晚,但相比国外研究方向较为单一,研究深度不高,需要进一步重视。     

长江上游鱼类通用引物的筛选与验证

为了筛选出适合使用eDNA技术对长江上游鱼类多样性进行研究的通用引物,本研究选择了6对引物,分别为：Mifish-U、AcMDB07、Teleo、Teleo2、 Fish16S1和FishCB,对长江上游常见的20种鱼类和3种其他水域鱼类肌肉组织提取的DNA扩增后结果显示,6对引物均能扩增出全部23种鱼类,但引物Mifish-U的扩增效果最好。进一步使用引物Mifish-U对长江上游屏山县、涪陵区和巫山县3个采样点的水样eDNA进行高通量测序,结果显示引物Mifish-U能扩增出研究使用的20种长江上游鱼类,其辨别度较高。使用引物Mifish-U对室内养殖3种鱼类的水样eDNA进行高通量测序后定性定量分析,结果显示黄颡鱼和鲤的生物量与序列数相关性显著,鲫的生物量与序列数相关性不显著。综上,引物Mifish-U更适合作为长江上游鱼类多样性研究的通用引物。     

中国对虾生物量评估的环境DNA检测技术 的建立及优化

近年来,环境DNA(Environmental DNA, eDNA)技术作为一种新的水生生物调查方法发展迅速,在水生生态系统的研究领域被广泛应用到物种检测、生物多样性评价、生物量评估等方面。然而,很少有研究专门评价eDNA技术操作流程中不同的eDNA富集方法与提取方法对研究结果的影响,从而针对具体研究对象建立一套最佳的eDNA技术操作流程。此外,由于物种间生活习性的差异,不同物种释放到环境中的DNA量及DNA片段大小不同,因而,针对不同研究对象需采用不同的eDNA富集与提取方法。本研究以中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)为研究对象,采用滤膜法富集eDNA,结合血液与组织DNA提取试剂盒提取eDNA。选取直径为47 mm的玻璃纤维膜、硝酸纤维膜、聚碳酸酯膜、尼龙膜共4种材质的滤膜,每种滤膜根据其孔径大小设置0.45、0.8、1.2、5 μm共4个梯度,取样水量设置500 ml、1 L、2 L共3个梯度。结果显示,滤膜材质、滤膜孔径大小及取样水体体积均对中国对虾的定性与定量分析具有一定的影响,其中,0.45 μm的玻璃纤维滤膜过滤2 L水样能够检测到的DNA拷贝数最多,并依据此建立了一套中国对虾eDNA技术的操作流程,提高了中国对虾的检出率,为后续中国对虾的分布监测及生物量评估提供了基础。     

海南岛淡水鱼类eDNA宏条形码COⅠ通用引物的筛选

已知的鱼类环境DNA (environmental DNA, eDNA)宏条形码通用引物主要位于线粒体核糖体基因区，这些12S和16S引物存在部分近缘鱼类无法识别及参考序列不足等问题。本研究以海南岛淡水鱼类为调查对象，基于8目26科101属150种鱼类COⅠ序列，筛选出6个侧翼保守区；综合碱基变异、物种鉴定、eDNA降解及高通量测序读长需求，在4个侧翼保守区设计了26条引物，其中6条引物未达到Premier评分要求；72种海南淡水鱼类的首轮PCR结果显示，有11条引物的通用性较高，其中，PCR成功种数≥70且条带亮度均大于marker的引物有5条；次轮PCR结果显示，5条引物相互搭配产生的3 (正向) × 2 (反向)套引物组合的扩增成功率均为100% (72种/72种)，经PCR条带长度、亮度筛选后表现最优的引物组合为“HN-A-F4、HN-D-R3”(以下简称HN-COⅠ)。30个水样高通量测序结果显示，HN-COⅠ产生的待分析序列总数、鱼类序列总数、OTUs总数和鱼类OTUs总数分别为MiFish-U的0.77倍(8 919 976/11 532 126)、1.22倍(2 264 965/1 863 905)、0.85倍(406/477)和1.32倍(86/65)；HN-COⅠ产生的鱼类OTUs注释到种、属、科及科以上水平的占比分别为81.40%、11.63%和6.98%，MiFish-U则分别为81.54%、4.62%和13.85%。“引物+水样”的NMDS聚类图形成边界明显的2组(胁强系数=0.15)；HN-COⅠ的属内物种扩增子两两遗传距离最小值及平均值均分别是MiFish-U的1.23倍(0.006 9/0.005 6)和1.57倍(0.155 9/0.099 4)。室内6个密度组鲤鱼(Cyprinus carpio carpio)“生物量–拷贝数”线性回归方程的相关系数较低，HN-COⅠ及MiFish-U均无法准确反映鲤鱼的生物量。本研究筛选并比较了HN-COⅠ与MiFish-U的优劣，表明HN-COⅠ对海南岛淡水鱼类具有更高的靶向性，不仅在防止微生物、哺乳类等非目标生物eDNA污染方面有优势，而且更有利于海南岛淡水鱼类的检出和准确鉴定。     

中国对虾生物量评估的环境DNA检测技术 的建立及优化

近年来,环境DNA(Environmental DNA, eDNA)技术作为一种新的水生生物调查方法发展迅速,在水生生态系统的研究领域被广泛应用到物种检测、生物多样性评价、生物量评估等方面。然而,很少有研究专门评价e DNA技术操作流程中不同的eDNA富集方法与提取方法对研究结果的影响,从而针对具体研究对象建立一套最佳的eDNA技术操作流程。此外,由于物种间生活习性的差异,不同物种释放到环境中的DNA量及DNA片段大小不同,因而,针对不同研究对象需采用不同的eDNA富集与提取方法。本研究以中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)为研究对象,采用滤膜法富集eDNA,结合血液与组织DNA提取试剂盒提取e DNA。选取直径为47 mm的玻璃纤维膜、硝酸纤维膜、聚碳酸酯膜、尼龙膜共4种材质的滤膜,每种滤膜根据其孔径大小设置0.45、0.8、1.2、5μm共4个梯度,取样水量设置500 ml、1 L、2 L共3个梯度。结果显示,滤膜材质、滤膜孔径大小及取样水体体积均对中国对虾的定性与定量分析具有一定的影响,其中,0.45μm的玻璃纤维滤膜过滤2 L水样能够检测到的DNA拷贝数最多,并依据此建立了一套中国对虾e DNA技术的操作流程,提高了中国对虾的检出率,为后续中国对虾的分布监测及生物量评估提供了基础。     

环境DNA技术在象山港水域鱼类多样性调查中的应用与评估

通过对象山港水域环境DNA(eDNA)样品的采集和高通量测序分析,并结合渔业资源调查数据,阐述象山港主要鱼类群落的种类组成和多样性特征,探讨了环境DNA技术在典型海域鱼类多样性研究中的应用前景.结果显示,共从象山港水域环境DNA样品中检测到26个常见鱼类物种,隶属于辐鳍鱼纲(Actinopterygii)的7个目中的2...     

闽南近海中国团扇鳐和林氏团扇鳐肌肉中水分含量、灰分含量及能值的分析

为探讨环境DNA (environmental DNA, eDNA)技术用于中国团扇鳐监测方面的可行性,同时开展基于eDNA技术的舟山近海中国团扇鳐定性与定量分析。本实验将中国团扇鳐与其同属汤氏团扇鳐COI基因片段序列进行比较分析,使用Primer Express 3.0软件设计中国团扇鳐特异性引物与TaqMan探针。在舟山朱家尖近海设计了A、B、C共3个定置网调查站位,定期收集中国团扇鳐样品。于2017年12月19日、2018年4月13日和2018年7月14日分别采集水样(站位A、B1、B2、C1、C2、D),开展eDNA微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)检测,并将检测结果与水温和采样点进行差异显著性分析。结果显示,不同站位、不同时间的中国团扇鳐eDNA浓度不同,水样采集点对中国团扇鳐eDNA浓度的影响极显著,不同采样点eDNA在不同季节存在极显著差异。研究表明,eDNA检测技术灵敏度高,水温、底质和水深对中国团扇鳐的分布皆有影响。研究结果为其他海域的中国团扇鳐eDNA追踪监测奠定了基础。

     

环境DNA在长江江豚监测中的应用

为了从水体环境中提取到高质量的eDNA环境DNA(environmentalDNA,eDNA),应用于长江中长江江豚(Neophocaenaphocaenoidesasaeorientalis)的分布调查,本研究比较了滤膜孔径和水样保存方式对eDNA获取的影响,同时对比了eDNA技术与传统调查法对长江江豚的检测结果。结果显示水样抽滤时间与滤膜孔径大小呈负相关关系,且都可以检出目标生物;水样采集后需在6 h内完成抽滤处理,或在冷藏条件下短期保存48 h;长江流域江苏段中观测到长江江豚出现的8个检测点均检测出长江江豚eDNA,而在10个未观测到长江江豚的水域中有3个检测出其eDNA。研究结果表明,相比传统目视监测方法, eDNA技术在长江江豚监测中不仅具有较高的准确性,还具有更高的灵敏性,可作为长江江豚种群调查的有效辅助检测工具。     

淡水养殖新品种——匙吻鲟 Paddlefish （Polyodon spathula）

匙吻鲟(Polyodon spathula),是北美产的一种名优鱼类。匙吻鲟是世界上现存的匙吻鲟科鱼类中仅有两个种之其中一种,是大型的淡水经济鱼类。据报导,匙吻鲟分布于美国密西西比河流域、亚拉巴马州西部至得克萨斯州东部,以及密执安湖(Michigan)、休伦湖(Huron)和伊利湖(Erie)等地;而另一种则生活于我国长江水系。     

长江干流浮游动物群落结构及时空分布格局

浮游动物是河流食物网的重要组成部分,在河流生态系统的能量流动和物质循环中具有重要作用,然而截至目前,尚缺乏对长江干流宏观尺度浮游动物的全面调查。本研究于2018—2019年,在长江干流约5 000 km江段设置51个调查站位,并于每年鱼类繁殖期(3—6月)、育肥期(8—10月)和越冬期(11—1月)各开展1次调查,系统调查分析了长江干流浮游动物群落结构特征及时空分布格局。结果显示,(1)种类：长江干流浮游动物共187种,其中原生动物56种、轮虫59种、枝角类34种、桡足类38种;三峡库区是浮游动物种类数最丰富的水域(87种),其余分别为金沙江(59种)、长江上游(68种)、长江中游(54种)、长江下游(56种)。鱼类繁殖期是浮游动物种类最丰富的季节,分别为金沙江(45种)、长江上游(56种)、三峡库区(47种)、长江中游(41种)、长江下游(32种)。(2)密度：长江干流浮游动物密度范围为1.12～644.40个/L,中游、下游密度显著高于上游;密度高值一般出现在繁殖期,低值一般出现在鱼类育肥期。(3)生物量：长江干流浮游动物生物量范围为231.78×10^-5～4...     

基于环境DNA metabarcoding的西轩岛近海鱼类多样性研究

鱼类多样性的保护对于生态系统的科学管理和资源的可持续利用至关重要。环境DNA metabarcoding技术的出现和应用为水生生物的调查与监测带来了强有力的技术革新。本研究以浙江舟山近海岛屿——西轩岛为例,设计了4个不同采样站位,先后于2019年2月(冬季)、5月(春季)和11月(秋季)共采集水样12个,通过环境DNA提取、扩增、高通量测序以及生物信息学分析,对西轩岛近海鱼类多样性进行了分析,同时评估了鱼类多样性的时空差异。结果显示,共监测到鱼类33种,隶属于12目26科32属,其中,鲈形目(Perciformes)种类最多,共19种,约占所有种类的57.6%。不同采样季节的多样性指数和均匀度指数均存在显著差异,表明季节可能是影响西轩岛近海鱼类多样性的因素之一。综合时间和空间分析的结果显示,在繁殖季节且远离舟山本岛一侧的采样点监测到的鱼种数量更多。通过比对之前传统渔业资源调查的结果发现,不同季节优势种存在较大变化,可能与采样点数量较少且集中有关。进化树富集结果显示,各季节的优势鱼种与传统调查手段的结果有较大差异,表明目前环境DNA仍不能完全替代传统调查方法,但可以将环境DNA方法与传统的调查方法相结合,以确保监测结果的准确性和可靠性。     

长江流域水资源开发保护中的关键科学和技术问题

长江是我国鱼类多样性最高的河流,同时也是我国最重要的淡水渔业资源产区。然而,近几十年来受水域污染、水工程建设、湖泊围垦、航运发展、过度捕捞和外来种入侵等多重因素的影响,长江流域生态系统面临着逐渐衰退的困境,主要表现为鱼类种类数减少、鱼类濒危物种程度加剧、鱼类资源小型化趋势明显、鱼类资源呈衰退趋势和外来物种种类增多等。长江十年禁渔,对恢复长江水生态环境和保护水域生物多样性提供了重要的机遇。作者建议统筹协调长江生态保护与渔业发展的关系,创新流域管理体制与机制,根据长江水生态系统结构与功能变化,适时调整服务目标,其目的旨在实现对长江流域水生态环境的保护和渔业资源的可持续发展提供科学依据。     

长江十年禁渔后保护与发展

长江是我国鱼类多样性最高的河流，同时也是我国最重要的淡水渔业资源产区。然而，近几十年来受水域污染、水工程建设、湖泊围垦、航运发展、过度捕捞和外来种入侵等多重因素的影响，长江流域生态系统面临着逐渐衰退的困境，主要表现为鱼类种类数减少、鱼类濒危物种程度加剧、鱼类资源小型化趋势明显、鱼类资源呈衰退趋势和外来物种种类增多等。长江十年禁渔，对恢复长江水生态环境和保护水域生物多样性提供了重要的机遇。作者建议统筹协调长江生态保护与渔业发展的关系，创新流域管理体制与机制，根据长江水生态系统结构与功能变化，适时调整服务目标，其目的旨在实现对长江流域水生态环境的保护和渔业资源的可持续发展提供科学依据。     

基于环境DNA宏条形码的鄱阳湖真核浮游植物多样性研究

浮游植物作为水生生态系统的重要组成部分，其群落和分布特征可以反映水体的环境变化和营养状态。环境DNA宏条形码技术将传统的基于领域的生态学与深入的分子方法和先进的计算工具结合在一起，这在生物多样性的研究中具有巨大的优势。本研究旨在采用环境DNA宏条形码技术对鄱阳湖浮游植物多样性的组成及空间分布进行研究。于2019年的4月采集鄱阳湖环境水样，每个样点重复3次采集。使用0.45 μm的混合纤维素滤膜对水样进行真空抽滤。用试剂盒DNeasy? Blood & Tissue Kit进行滤膜DNA的提取，使用通用引物1380F：5’-TCCCTGCCHTTTGTACACAC-3’和1510R：5’-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC-3’针对真核浮游植物 18S rDNA 基因的 V9 区域进行PCR扩增，高通量测序并结合生物信息学技术分析鄱阳湖浮游植物的群落组成。基于环境DNA宏条形码技术鉴定到浮游植物10门24纲54目101科166属，其中绿藻门和硅藻门种类较为丰富，检测到的属明显多于传统方法检测到的。中部区域的浮游植物群落多样性和均匀度较高，且鄱阳湖浮游植物整体丰富度较高。NMDS分析阐明，中部和北部区域( p = 0.004)、南部和北部区域之间群落结构差异显著( p = 0.011)。冗余分析表明，叶绿素a (Chl-a)、pH、流速(V)对各区域的浮游植物群落影响较显著。本研究使用环境DNA宏条形码技术评估了鄱阳湖浮游植物生物多样性，证明了环境DNA宏条形码技术检测浮游植物群落结构的可行性。环境DNA宏条形码作为一种新兴的生物多样性监测手段，其可用于快速检测鄱阳湖浮游植物生物多样性及其空间分布，为鄱阳湖生物多样性监测以及生态系统健康评估提供新的技术手段。     

禁捕后长江鱼类资源监测的技术指标建议

为了确定监测时长、监测网具、站位布局对禁捕后长江鱼类资源监测评估的有效性,于2021年5—7月在长江中游10个站位开展了鱼类资源捕捞监测,每个站位连续监测15 d,从日捕获量、物种记录数、渔获物群落结构等3方面着手,对监测时长、监测网具、站位布局等的设置进行探讨。结果显示,连续11 d捕捞监测所得累计日均渔获量基本达到稳定,连续15 d捕捞监测可以记录到站位近70%的鱼类种类数,所得累计鱼类群落结构基本达到稳定。网具类型、规格的使用覆盖对监测结果中鱼类种类记录数、鱼类群落结构有明显影响,网具使用量对监测结果中日均渔获量有明显影响。10个监测站位间的鱼类群落结构具有明显差异,结合监测站位间的空间距离来看,鱼类群落结构具有较高的空间异质性。研究表明,为了保障评估结果的准确性,基于原始监测数据进行相关评估之前,有必要对监测数据的充分性、有效性进行检验,网具类型、规格和使用量对监测结果的影响应予以适当考虑,各具体江段的鱼类群落结构评估应由相应具体江段的监测结果来支撑。本研究将为长江流域重点水域全面禁捕后的水生生物资源监测评估提供科学支撑。     

人工模拟条件下环境DNA宏条形码技术的定量分析初探

近年来,环境DNA宏条形码技术(eDNA metabarcoding)在水生生态系统生物多样性评估等相关领域中得到广泛应用,因其具有快速测算群落中物种丰度的潜能,eDNA宏条形码技术成为资源保护和管理中颇具应用前景的调查工具.虽然大量证据表明eDNA高通量测序获得的reads数与自然环境中生物相对数量具有相关性,但一直...     

有关长江流域鱼类资源保护的几个问题

为了确定监测时长、监测网具、站位布局对禁捕后长江鱼类资源监测评估的有效性,于2021年5—7月在长江中游10个站位开展了鱼类资源捕捞监测,每个站位连续监测15 d,从日捕获量、物种记录数、渔获物群落结构等3方面着手,对监测时长、监测网具、站位布局等的设置进行探讨。结果显示,连续11 d捕捞监测所得累计日均渔获量基本达到稳定,连续15 d捕捞监测可以记录到站位近70%的鱼类种类数,所得累计鱼类群落结构基本达到稳定。网具类型、规格的使用覆盖对监测结果中鱼类种类记录数、鱼类群落结构有明显影响,网具使用量对监测结果中日均渔获量有明显影响。10个监测站位间的鱼类群落结构具有明显差异,结合监测站位间的空间距离来看,鱼类群落结构具有较高的空间异质性。研究表明,为了保障评估结果的准确性,基于原始监测数据进行相关评估之前,有必要对监测数据的充分性、有效性进行检验,网具类型、规格和使用量对监测结果的影响应予以适当考虑,各具体江段的鱼类群落结构评估应由相应具体江段的监测结果来支撑。本研究将为长江流域重点水域全面禁捕后的水生生物资源监测评估提供科学支撑。     

Fish diversity assessment in the headwaters of the Volga River using environmental DNA metabarcoding

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