谷氨酸脱羧酶亲和层析介质制备

将 Sepharose 4B用环氧氯丙烷活化 ,接丁二胺臂 ,再用环氧氯丙烷活化 ,与谷氨酸的 N- 2氨基偶联。在 N ,N-二环己碳化二亚胺催化下 ,以接臂的胶与谷氨酸的 C- 5和 C- 1羧基基团偶联。结果表明 ,谷氨酸 N- 2氨基偶联和 C- 1羧基偶联的亲和介质对小麦谷氨酸脱羧酶有部分亲和作用 ,洗脱下的酶活低 ,而谷氨酸 C- 5羧基基团偶联的层析介质对小麦谷氨酸脱羧酶有完全亲和作用 ,洗脱的酶活高。谷氨酸能从亲和材料上洗脱掉脱羧酶 ,但它抑制酶活 ,而同等浓度的 4-氨基丁酸和谷氨酰胺梯度洗脱没有作用     

提高L—谷氨酸脱羧酶产量与稳定活力的研究

通过正交试验，获得了利用大肠杆菌生产Ｌ－谷氨酸脱羧酶的最优培养基配方与工艺条件。通过对精制条件的研究。发现丙酮温度过低是导致酶活力降低的主要因素。用０℃左右的丙酮溶液处理菌悬液可保证酶制剂活力。     

高等植物体内γ—氨基丁酸代谢的酶学研究进展（综述）

本文对高等植物体内γ－氨基丁酸代谢的酶学研究进展，特别是参与酶谷氨酸脱羧酶、γ－氨基丁酸转氨酶和琥珀酸半醛脱氨酶的分布、分离提纯和酶的性质进行了较为全面的综述。     

林生山黧豆谷氨酸脱羧酶的性质及其比较研究

林生山黧豆谷氨酸脱羧酶的亚基分子为量70kD,天然分子量为140kD,是2个相同亚基组成的二聚体。N-末端氨基酸为丙氨酸。圆二色谱分析表明,该酶在207．5nm和215nm有一平缓的负峰,二级结构中α-螺旋占34．28％,β-折叠占33．24％,无规则卷曲占32．28％,紫外吸收表现一般蛋白质的特征吸收光谱,在278nm处有最大吸收。酶最适pH5．4,对谷氨酸的Km值为1．62×10-3mol·L-1,最适温度40℃,酶特异性地使谷氨酸脱羧,不能使门冬氨酸等其他氨基酸脱羧。比较结果说明该酶在已知结构和性质上与人及大鼠脑的谷氨酸脱羧酶接近,但和已知的几种植物的酶相差较远。     

提高L-谷氨酸脱羧酶产量与稳定活力的研究

通过正交试验,获得了利用大肠杆菌生产Ｌ－谷氨酸脱羧酶的最优培养基配方与工艺条件．通过对精制条件的研究,发现丙酮温度过低是导致酶活力降低的主要因素．用０℃左右的丙酮溶液处理菌悬液可保证酶制剂活力．     

米胚芽谷氨酸脱羧酶的分离纯化及部分酶学性质的研究

【目的】分离纯化米胚芽谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD),并对其酶学性质进行研究。【方法】通过(NH4)2SO4分级沉淀、DEAE-Sephrose FF离子交换色谱、Superdex 200凝胶过滤色谱和Glu SephroseCL 4B亲和色谱等分离纯化技术,对米胚芽GAD进行分离纯化。用体积排阻高效液相色谱测定米胚GAD的相对分子质量,SDS-PAGE测定其亚基的相对分子质量。测定米胚GAD的最适温度和pH,通过酶动力学试验测定其动力学常数(Km)和最大反应速度(Vmax),并测定KCl和MgSO4等化学物质对酶活性的影响。【结果】分离纯化得到了米胚GAD,其纯化倍数为65.7,比活达223.4 U/mg,酶活回收率为10.8%。米胚GAD的相对分子质量为78 ku,亚基相对分子质量为40 ku,说明米胚GAD是由2个相同亚基构成的二聚体。米胚GAD的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5.6;米胚GAD的热稳定较差,80℃时酶几乎完全失活;米胚GAD在pH 4.5~8.0较为稳定,能保持88%以上的酶活。米胚GAD对谷氨酸Glu的Km为32.3 mmol/L,Vmax为1.159 mg/min;对磷酸吡哆醛(PLP)的Km为1.7μmol/L,Vmax为1.171 mg/min。K+和Ag2+对米胚GAD的活力有较大抑制,Mg2+、Mn2+、Al3+和Li2+等对活性影响不大,500μmol/L Ca2+对米胚GAD有较强的激活作用。【结论】米胚GAD的性质与其他植物GAD存在差异。     

茶树谷氨酸脱羧酶基因(GAD)的原核表达及酶活快速检测

L-谷氨酸经脱羧酶反应可生成γ-氨基丁酸(GABA),此过程受谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)催化。从茶树转录组库中筛选GAD基因,通过NCBI比对获得其cDNA序列(GenBank登录号为KT728367.1)。序列分析表明,GAD基因的ORF全长为1 482 bp,共编码493个氨基酸,该蛋白为细胞质蛋白,分子量为55.49 kDa,理论等电点为5.44。从舒茶早茶树根部中克隆该基因,并构建pMAL-c5X-GAD表达载体,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测,得到分子量约为55 kDa的目的蛋白。体外酶活反应后用薄层色谱法(TLC)分析,经BAW(Butanol:Acetic acid:H_2O,4:1:2)和75%苯酚水溶液(Phenol:H_2O,3:1)2种展开剂分离酶促产物,均可检测到GABA的生成。通过实时荧光定量PCR对GAD基因在不同茶树组织的表达水平进行检测,发现GAD在根中表达量最高,而在芽中表达量最低,在其他组织中表达各不相同,其表达具有组织特异性。     

羟基马桑毒素及其衍生物对粘虫体内GAD和GABA-T活性的影响

为了探明羟基马桑毒素及其衍生物(T1、T2、T3、T4)对粘虫神经系统的影响以及快速检测对比分析新合成的药物对试虫神经递质γ-氨基丁酸(GABA)相关酶谷氨酸脱羧酶(GAD)和γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T)活性的影响,通过胃毒和离体2种处理方式提取粗酶液并采用分光光度法对试虫酶活性进行测定。结果表明,经羟基马桑毒素及其衍生物处理后试虫的GAD酶活受到了抑制,而GABA-T活性被提高,这2种酶影响着试虫体内GABA的含量。离体测定的结果与胃毒处理后试虫体内酶活的变化相似,因此可以采用离体处理方法快速检测新药物对试虫的活性。     

添加不同组合生物菌、γ-聚谷氨酸、腐殖酸的新型肥料在小麦生产上的应用

在复混肥料基础上,添加生物菌、腐殖酸、γ-聚谷氨酸的不同组合搭配,形成4种新型肥料,在小麦大田上进行肥效试验,通过观察小麦植株个体长势长相和群体生长发育变化,测定小麦经济性状和实际产量,分析不同组合搭配添加物对作物生长发育、产量、抗性等方面的影响。结果表明,添加γ-聚谷氨酸+生物菌、γ-聚谷氨酸+腐殖酸、γ-聚谷氨酸+生物菌+腐殖酸组合的处理,有促进分蘖、提早返青、延长灌浆期的作用,小麦植株健壮茂盛,生长势强,株型匀称紧凑,茎秆粗实,分蘖力强,成穗率、结实率高,增产效果显著;添加γ-聚谷氨酸+腐殖酸、γ-聚谷氨酸+生物菌+腐殖酸组合的新型肥料,还表现出成大穗的作用;添加γ-聚谷氨酸+腐殖酸组合对总养分35%(N、P2O5、K2O含量分别为16%、8%、11%)复混肥料的田间肥料效果增值最大。     

氮代谢相关酶的研究进展

氮代谢是植物体内的基本生理代谢过程之一,包括氮素同化、积累和蛋白质合成等过程,与植物的生长发育、产量和品质的联系非常密切。氮代谢的生理过程在酶的催化下完成,与氮代谢的生理过程密切相关的酶有：硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、转氨酶(谷氨酸草酰乙酸转氨酶、谷氨酸丙酮酸转氨酶)、谷氨酸合酶、谷氨酸脱氢酶等关键酶。这5种酶在植物氮代谢过程中具有重要的作用,简要介绍这几种酶的基本结构与特性、对作物生长发育的调控等,为进一步探究氮代谢研究机制提供有益的参考。     

谷氨酸脱羧酶和谷氨酸脱氢酶基因的串联表达及其对GABA产量影响

为构建一株无外源L-谷氨酸(L-Glu)条件下可直接转化葡萄糖生产γ-氨基丁酸(GABA)的安全基因工程菌,将植物乳杆菌GABA合成途径的关键酶——谷氨酸脱羧酶基因gadB与L-Glu合成途径中的关键酶谷氨酸脱氢酶基因gdh进行串联表达,导入产谷氨酸菌株谷氨酸棒杆菌SF016中,检测其对L-Glu及GABA产量的影响。经摇瓶发酵40h重组菌SF016-pgg谷氨酸脱羧酶的酶活达0.63mol·min~(-1)·g~(-1),而谷氨酸脱氢酶的酶活达0.131mol·min~(-1)·g~(-1),比原始菌株提高了约2.0倍。重组菌SF016-pgg以葡萄糖为碳源,通过40h发酵罐发酵可积累产生23.12g·L~(-1)的GABA,说明串联表达gadB和gdh基因有效实现重组菌在以葡萄糖为单一碳源、无外源L-Glu存在的培养基中直接发酵生产GABA。该生产方式的成本明显降低,且产品的安全性高,可用于食品、饲料或医药等行业。     

貉微卫星DNA富集文库的构建与鉴定

貉基因组DNA经限制性内切酶MboI酶切,用2.0%琼脂糖凝胶电泳回收200～800bp的DNA片段,与MboI连接头连接,连接产物与生素物标记的(AC)n微卫星探针变性及退火,再通过链亲和素偶联磁珠亲和捕捉,经吸附、洗涤及洗脱,然后以洗脱产物为模板,通过PCR扩增,与pUCm-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,构建貉(AC)n微卫星DNA富集文库,经测序分析表明该文库含重组克隆约2800个,其中含有(AC)n微卫星DNA序列的阳性克隆占71.4%。     

1，3，4-噁二唑并1，2，4—三唑类双杂环的合成

采用生物活性基团拼接的分子设计方法,将两类活性杂环N－多氟烷基-4－苯基5对碘苯基-1,2,4三唑-3-硫酮和N－多氟烷基－5－对碘苯基－1,3,4-噁二唑－2-硫酮以Sonogashira偶联的方式进行拼接,设计并合成了几个新型双杂环化合物,其结构经过^1HNMR,^19F NMR,IR和MS谱以及元素分析确证．     

烟草Nt-GAD的氨基酸序列分析

为从分子层面研究烟草Nt-GAD的氨基酸序列,采用Protparam、Interpro、Blast、Muscle、Phyml和Treedyn工具,分析烟草Nt-GAD氨基酸序列的理化特性、结构域和进化树。结果表明：烟草Nt-GAD成员的等电点均处于5.5～6之间,且Nt-GAD1和Nt-GAD2同源性最高,此外Nt-GAD2的耐热性最好,Nt-GAD3的稳定性最强;烟草Nt-GAD属于磷酸吡哆醛依赖性脱羧酶家族和谷氨酸脱羧酶家族,且具有磷酸吡哆醛依赖性转移酶同源超家族结构域,C末端存在独特区域钙调蛋白结构域,通过进化树分析烟草Nt-GAD成员被划分为三组,其中烟草Nt-GAD3(第一组)分化较为突出,而Nt-GAD2(第三组)则较为保守,而Nt-GAD1和Nt-GAD4被划分为第二组。     

有机溶剂对棉铃虫N-乙酰氨基葡糖苷酶活力的影响

以棉铃虫为材料,经 (NH4 )2SO4 分级沉淀、SephadexG 200分子筛凝胶过滤柱层析和DEAE 32离子交换柱层析分离纯化,获得棉铃虫N 乙酰氨基葡糖苷酶酶制剂.研究几种有机溶剂对棉铃虫N 乙酰氨基葡糖苷酶 (EC3. 2. 1. 14)的活力与构象的影响.结果表明:甲醇、乙醇和乙二醇对酶有先扬后抑的作用,正丙醇和丙三醇对酶有失活作用.低含量的丙酮 (体积分数为 12. 5% )对酶有可逆失活作用,随着丙酮含量的提高,其酶促反应的动力学参数也随之改变,Vmax值降低,Kmapp值不变.在 278nm波长激发下,天然酶内源荧光在 339nm处有特征的荧光发射,其强度随着丙酮含量的上升而减弱,荧光发射峰也逐渐蓝移.这表明丙酮改变了酶的构象.     

5—氨基—4—咪唑—N—琥珀酸羧基酰胺核糖核苷酸的合成

5-氯基-4-咪唑-N-琥珀酸羧基酰胺核糖核苷酸(SAICAR)是从头嘌呤合成中的双功能酶腺苷酸琥珀酸裂解酶(EC 4、3、2、2)的底物之一,被成功地用腺苷酸琥珀酸裂解酶合成.从72.00×10~(-?)mmol的5-氨基-4-咪唑羧基酰胺核糖核苷酸(AICAR)得到43.78×10~(-3)mmol的SAICAR,产率约为AICAR的60.8%.     

活性三肽法氏囊素的液相合成

以保护性氨基酸Boc-Lys-(Boc)-OH、Fmoc-His-(Trt)-OH和Gly-NH2-HCl为原料,N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)为缩合剂,按照由C端向N端依次接肽的合成策略,采用液相法完成了法氏囊素(L-Lys-His-Gly-NH2)的合成,总产率≥62.7%,其纯度≥90%.对DCC缩合反应中,羧基的活化、反应溶剂的选择、反应物投料比及顺序、反应温度及时间对反应结果的影响以及Boc、Fmoc、Trt三种保护基团的脱除条件也进行了研究和优化.     

华北不同利用强度潮土酶生态化学计量特征比较

为探究土壤酶活性和微生物养分限制水平对土地利用强度的响应特征，本研究设置1个高强度（小麦-玉米轮作，MW）、2个中强度（临时草地-小麦，GW；玉米-临时草地，MG）和1个低强度（多年生草地，PG）共4个处理，6 a后采样解析土壤酶活性及酶生态化学计量特征。结果表明：土壤pH值随土地利用强度降低而下降（仅PG达到显著），PG和GW均增加了土壤有机碳（Organiccarbon，OC）含量；PG还增加了土壤全氮（Total nitrogen，TN）与有效磷（Available phosphorus，AP）含量，进而提高了土壤C∶P和N∶P的比值。与MW和MG相比，PG和GW提高了β-1，4-葡萄糖苷酶（β-1，4-glucosidase，BG）、β-N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶（β-N-acetyl-glucosaminidase，NAG）+亮氨酸氨基肽酶（Leucine aminopeptidase，LAP）和碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性，以及土壤酶碳磷比（C/P ratio of extracellular enzymatic activities，EEAC∶P）和土壤酶氮磷比（N/P ratio of extracellular enzymaticactivities，EEAN∶P），显著降低了土壤微生物P限制。相关性分析表明：土壤C、N和P关键代谢酶活性均与OC、TN、C∶P和N∶P显著正相关，而与NH+4-N显著负相关；EEAC∶P和EEAN∶P均与OC、C∶P和N∶P显著正相关，但仅EEAN∶P与NH+4-N显著负相关。随机森林模型分析表明，pH是土壤微生物C限制的主要解释因子，而C∶P、N∶P和NH+4-N对土壤微生物P限制的解释度最高。研究表明，将临时草地模式引入农田能够增强土壤固碳和供氮能力，提高土壤酶活性并降低土壤微生物P限制，可为集约化农业管理下提升农田土壤生态系统质量提供理论依据和技术支撑。     

三氯苯胺类化合物的植物生长调节活性研究

试验了6个三氯苯胺类化合物在500mg/L含量下对水稻、油菜的植物生长调节活性。结果表明，它们都具有不同程度的生物活性。其中N－硝基－N-（N′-间羧基苯基）－氨基甲酰－2，4，6－三氯苯胺对水稻成活、根长、根鲜重的促进活性最强，但对茎长、地上部鲜重无明显抑制作用；其对油菜成活、根长、地上部鲜重、根鲜重的促进活性也是最强的。同时，也讨论了各化合物的生物活性与其分子结构之间的相关性。     

N-硝基-N-氨基(取代)甲酰-2,4,6-三氯苯胺类化合物的生物活性研究

试验了N－硝基－N-（N'－间羧基苯基）－氨基甲酰－2，4，6－三氯苯胺对单子叶和双子叶作物的植物生长调节活性及对单子叶和双子叶杂草的除草活性，确定了其植物生长调节活性和除草活性的EC50。试验表明，该化合物对水稻、油菜具植物生长调节活性，对稗草、青葙具除草活性。