基于MALDI-TOF-MS质谱技术对蜂蜜中芽孢杆菌的鉴定与分型

[目的]对分离自不同产地和品种的蜂蜜中的芽孢杆菌属进行鉴定分型,探索利用蜂蜜中芽孢杆菌特征指纹图谱对蜂蜜产地和品种进行溯源的可行性。[方法]从44种不同产地和品种蜂蜜中分离出44株芽孢杆菌,3株铜绿假单胞菌。采用基质辅助激光解析-电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)条件对分离的芽孢杆菌进行鉴定分型和聚类分析。[结果]44株芽孢杆菌中鉴定出蜡样芽孢杆菌(B.cereus)31株,短小芽孢杆菌(B.pumilus)5株,枯草芽孢杆菌(B.subtilis)3株,地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)2株,炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)1株,土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri.)2株。通过多次重复试验,表明从同一份样品或同一品牌蜂蜜样品中能稳定分离到芽孢杆菌,获得的蛋白指纹图谱具有极好的稳定性。[结论]MALDI-TOF-MS可根据获得的芽孢杆菌蛋白指纹图谱将芽孢杆菌划分为不同类型,可作为一种新的根据蜂蜜中芽孢杆菌的特征指纹图谱进行溯源的方法。     

作物病害高效生防菌株的定向快速筛选及其种类鉴定

[目的]筛选和鉴定能产Bacillomycin D的芽孢杆菌。[方法]通过PCR技术对36株具有抑菌活性的芽孢杆菌进行检测,筛选出具有Bacillomycin D合成酶基因的菌株,并利用快速蛋白液相色谱技术(FPLC)对筛选出的菌株进行检测,最后通过16S rDNA和gyrB基因序列对这些菌株进行分子鉴定。[结果]共筛选出4株能产生Bacillomycin D的菌株,其中2株为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus),2株为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。[结论]该研究为高效微生物农药的开发奠定了基础。     

纳豆芽孢杆菌的分离纯化及鉴定

根据纳豆芽孢杆菌耐热耐盐的特征分离纳豆芽孢杆菌菌株.由纳豆粉中分离纯化出1株纳豆菌株,由家庭自制纳豆中分离纯化出5株纳豆菌株,并对这6株纳豆芽孢杆菌的细胞、菌落形态及生理特性进行研究.结果表明,这6株纳豆菌均属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).     

基于实时荧光PCR技术快速检测饲料中的蜡样芽孢杆菌

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)在自然界中广泛存在,而且大部分菌株能产生肠毒素和呕吐毒素,是引起养殖动物中毒的常见致病菌。在饲料生产过程中,为对该病原菌进行有效监控,以蜡样芽孢杆菌肠毒素FM基因(entFM)和肠毒素T基因(bceT)保守区域片段为靶序列,利用DNAMAN设计两对特异性引物,建立一种基于实时荧光PCR (real-time PCR)技术的蜡样芽孢杆菌快速检测方法,并对所建立方法的重复性、特异性及灵敏度进行分析。结果表明:所设计的引物可以实现对蜡样芽孢杆菌的快速检测而且具有较高的重复性;对8株蜡样芽孢杆菌和8株非蜡样芽孢杆菌共16株菌株进行特异性检测,8株蜡样芽孢杆菌检测全部为阳性,8株非蜡样芽孢杆菌检测全部为阴性,无漏检和误检现象;对纯培养条件下蜡样芽孢杆菌提取的DNA模板进行10倍梯度稀释并进行灵敏度检测,两种肠毒素基因的检测限均为1.0×10~4CFU·mL~(-1);对人工染菌的饲料样品进行检测,在增菌18～20h后进行实时荧光PCR检测,检测限均可达到10CFU·mL~(-1),证明该方法具有良好的特异性和灵敏度,是快速检测饲料中蜡样芽孢杆菌的有效方法。     

黄曲霉毒素B1生物降解菌的快速筛选及鉴定

通过48孔板微培养的方法对336株芽孢杆菌菌株进行黄曲霉毒素B1生物降解菌的快速筛选,获得14株能在以香豆素作为惟一碳氮源的培养基中生长的芽孢杆菌菌株。在投料浓度为100μg/kg条件下,对这14株芽孢杆菌进行复筛,获得1株黄曲霉毒素B1降解率为83.20%的芽孢杆菌菌株。通过16S r DNA序列比对分析,初步确定这株芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。     

污水中氯苯类化合物降解菌的筛选及降解特性的研究

采用传统的方法进行分离、纯化、筛选、检测,得到氯苯类化合物的降解菌,对其降解率进行研究,并通过16S rRNA进行分离鉴定。结果表明,共筛选出4株具有降解活性的菌株,在18℃、pH 7.2时降解率较高。初步鉴定4株菌株分别为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、炭疽杆菌(B.anthraci)、同温层芽孢杆菌(B.stratosphericus)。     

3株乳酸芽孢杆菌的筛选、初步鉴定及应用试验

通过对41株产酸芽孢杆菌Bacillus培养物的HPLC分析及抑菌活性和芽孢形成检测,筛选出3株能产生乳酸、有抑菌活性、易形成芽孢的乳酸芽孢杆菌.通过形态染色特性观察、Biolog系统鉴定及16S rDNA碱基序列分析,初步鉴定3株菌为芽孢杆菌SCBacillus sp.SC、芽孢杆菌TRB.sp.TR和蜡状芽孢杆菌SL1 B.cereusstrain SL1.动物饲养试验显示,乳酸芽孢杆菌益生素能提高三黄鸡血清钙、磷、总蛋白、球蛋白、溶菌酶、IgG、IgA含量及脾脏、胸腺和法氏囊指数;饲料中添加5 g/kg的乳酸芽孢杆菌益生素,可使56日龄三黄鸡的平均日增质量提高13.61%,料质量比降低18.37%.     

辣椒枯萎病主要致病菌的分离鉴定及农用拮抗菌筛选

[目的]分离鉴定辣椒枯萎病主要致病菌,探寻能够有效抑制该致病菌的生防菌株.[方法]采用植物病害组织致病菌划线分离方法分离致病菌,经形态学以及ITS区域PCR检测,确定菌株属性,通过平板拮抗筛选,确定对该致病菌具有拮抗作用的农用生防菌株.[结果]初步鉴定该致病菌为尖孢镰刀(Fusarium oxysporum),将该致病菌与11株农用微生物芽孢杆菌和3株农用微生物木霉菌进行拮抗试验,发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、海洋芽孢杆菌(Bacillus marinus)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)6株芽孢杆菌对该致病菌拮抗效果明显,长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)与哈茨木霉(Trichoderma harzianum)2株木霉菌对该致病菌具有明显的拮抗效果.[结论]筛选到了8株能够有效抑制该病原菌的生防菌株,为以后研究生防肥料奠定了基础.     

微流控芯片恒温扩增技术快速检测米饭中的蜡样芽孢杆菌

为建立米饭中的蜡样芽孢杆菌微流控芯片恒温扩增快速检测方法,利用蜡样芽孢杆菌公开的hblA基因序列设计引物,加入荧光染料SYTO-9,采用微流控芯片通过环介导恒温扩增进行实时荧光读数,并通过24株菌株验证其特异性;分别用阳性质粒和阳性菌株测试其灵敏度、检出限和重复性。结果表明:2株蜡样芽孢杆菌呈阳性,22株非蜡样芽孢杆菌呈阴性;微流控芯片恒温扩增技术检测蜡样芽孢杆菌菌液的灵敏度为170 CFU/mL,检测时间在35 min内;使用合成的蜡样芽孢杆菌阳性质粒样品,其灵敏度为10μL-1,检测时间在15 min内,比传统分离鉴定方法的灵敏度高10倍;人工污染米饭中蜡样芽孢杆菌的检出限为570 CFU/g,并可在45 min内完成结果判定;蜡样芽孢杆菌阳性质粒检测重复性好,其变异系数(coefficient of variation, CV)为2.02%。综上所述,微流控芯片恒温扩增快速检测方法特异性好、灵敏度高、结果准确,可用于米饭类食品中蜡样芽孢杆菌的快速检测。     

动物微生态制剂猪肠源芽孢杆菌的分离与鉴定

本次试验的菌种是从宁夏平罗县边远农村基本自然生长的健康肉猪的小肠、大肠和盲肠中分离获得的,共分离出28株菌株.通过对这28株菌株的菌落形态观察、革兰氏染色和芽孢染色镜检,筛选出12株芽孢杆菌(Bacillus)菌株进行了生理化学鉴定,其中有11株分属于芽孢杆菌的3个种.确定8株为蜡状芽孢杆菌(B.cereus),1株为枯草芽孢杆菌(B.subtilis),2株为短芽孢杆菌(B.brevis).这11株菌株的各项鉴定结果均符合芽孢杆菌属和相应种的菌落形态、革兰氏染色和芽孢染色特征以及生理生化鉴定标准.     

解淀粉芽孢杆菌Bs-18生防功能相关基因的初步鉴定

本研究利用平板筛选法,从转座子TnYLB-1转化的解淀粉芽孢杆菌Bs-18的突变体文库中筛选到生防作用发生明显变化的3株突变株。以这3株突变株为材料,通过反向PCR技术对突变体中转座子插入位点的侧翼序列进行BLAST比对分析,发现它们与野生芽孢杆菌的芽孢形成、细胞分离、细胞的一系列代谢活动等有关。     

海洋源芽孢杆菌的分离鉴定及其消化酶代谢产物的测定

【目的】从海洋生物和环境中分离鉴定出产消化酶代谢产物的芽孢杆菌,为微生态制剂的研制提供益生菌种。【方法】从雷州半岛近岸海域采集样品,用高温处理、富集培养和分离培养的方法获得分离菌株;通过菌落形态、细胞结构、染色特征、生化试验和16S rRNA基因测序对分离菌株进行鉴定;采用福林-酚比色法、淀粉-碘比色法和橄榄油乳化法测定分离菌株代谢产物中的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性。【结果】从22份样品中初步鉴定出疑似芽孢杆菌43株,筛选3种消化酶综合活性最强的8株,经生化试验和16S rRNA基因测序鉴定,有蜡样芽孢杆菌3株、暹罗芽孢杆菌3株、特基拉芽孢杆菌1株、解木糖赖氨酸芽孢杆菌1株。其中,解木糖赖氨酸芽孢杆菌BC1产脂肪酶活力最高,为52.13 U/mL;蜡样芽孢杆菌BC3产蛋白酶活力最高,为4.78U/mL;暹罗芽孢杆菌BC6产淀粉酶活力最高,为2.35 U/mL。【结论】成功筛选出产消化酶代谢产物的海洋源芽孢杆菌。     

1株烟草青枯病生防细菌的分离与鉴定

采用系列稀释法和平板涂布法从黔江烟区土壤中分离得到细菌菌株87株,经平板对峙法初筛得到1株对烟草青枯病病原菌有强烈拮抗作用的细菌,再通过滤纸片法验证其提取物对烟草青枯病病原菌有强烈的抑制作用,对该菌株进行全细胞脂肪酸分析,初步判断该菌为芽孢杆菌.16S rDNA分析结果表明,该菌为解淀粉芽孢杆菌.     

小麦全蚀病拮抗微生物的分离及其拮抗性能研究

从开封北郊的麦田土壤中分离筛选出11株对小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)有拮抗作用的细菌,通过对它们进行生理生化检验,确定为4个种,即:巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringien-sis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。分别利用平板拮抗和小麦活体拮抗对分离到的11株拮抗菌株的拮抗能力进行检测。结果表明,菌株的平板拮抗能力较强,在活体试验中,可以降低病害的发病强度。     

榨菜腐败微生物的分离、鉴定及生物学特性研究

    通过对发生"胖袋"现象的袋装榨菜微生物进行分离,得到7株细菌菌株、4株酵母菌菌株.根据反正试验和细菌学鉴定试验,确定了引起榨菜腐败变质的2株细菌菌株:坚强芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌.利用比浊法原理,以细菌在液体培养基中吸光度值的变化作为细菌生长指标,研究坚强芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌的生长曲线、耐温性、耐盐性及耐硝酸盐性.结果表明:坚强芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌的生长速度不同,前者较后者幔,但两者对数生长期持续时间差不多;低温(<10℃)、高盐(>12%)能有效地抑制坚强芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的生长;亚硝酸盐(0%～0.15%)对坚强芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的生长没有影响.     

烟草黑胫病拮抗芽孢杆菌的筛选及生防效果评价

为了防治烟草疫霉对烟草引起的病害,从不同烟田健康烟株根际土壤中筛选分离42株根际细菌,经平板对峙初筛、细菌发酵液115℃处理后复筛得到10株对烟草黑胫病病原菌(Phytophthora parasitica)具有较好抑制效果的芽孢杆菌。经分子生物学鉴定可将其分为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis)3类。选取枯草芽孢杆菌GJ1、解淀粉芽孢杆菌GJ7和贝莱斯芽孢杆菌GJ11对各类芽孢杆菌进行纤维素酶和蛋白酶分泌特性检测、烟草根际土壤、根和茎定殖能力检测以及田间试验,得出这3种芽孢杆菌均可分泌纤维素酶和蛋白酶,均能在烟草根际土壤、根和茎中定殖,在根际土壤中定殖能力为GJ1GJ7GJ11,在根和茎中定殖能力均为GJ7GJ1GJ11。GJ1、GJ7、GJ11对烟草黑胫病田间相对防治效果分别为33.33%、80.00%、28.60%,初步确定拮抗芽孢杆菌田间防治效果取决于其在烟草内定殖能力。     

几种芽孢杆菌共培养对产蛋白酶的影响

[目的]为了研究芽孢杆菌的共发酵对蛋白酶产量的影响。[方法]对4株具有产蛋白酶能力的芽孢杆菌,通过菌株两两配伍发酵或三者配伍共发酵培养,分别检测单一菌株发酵产物和不同菌株共发酵产物的蛋白酶活性。[结果]枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌均具有一定的产蛋白酶能力,枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌共发酵培养48 h后蛋白酶活力有显著提高。[结论]菌株之间的科学配伍在共发酵中可以显著提高蛋白酶的活性。     

6株芽孢杆菌的分离鉴定和生物学特性

为了筛选适合渔用微生态制剂的益生菌,从池塘边发酵鱼肉汤中分离芽孢杆菌,结合形态学、生理生化特征、16S rRNA及gyrA、gyrB、rpoB和purH基因序列比对分析对其进行鉴定,并对其产淀粉酶、产蛋白酶能力及生长情况进行研究.结果表明,分离筛选的6株芽孢杆菌分属于4个种,1株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),1株为阿氏芽孢杆菌(B.aryabhattai),2株为贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis),2株为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens),6株菌在LB液体培养基中生长良好,均具有产蛋白酶能力,其中4株具有产淀粉酶能力.     

细胞分裂素生产菌对马铃薯早期生长生理的影响

选用马铃薯合作-88为试验材料,进行了土壤盆栽试验,通过向土壤中分别加入巨大芽孢杆菌溶液和枯草芽孢杆菌溶液,比较不同细胞分裂素生产菌对马铃薯早期生长生理的影响,探讨细胞分裂素生产菌对马铃薯生长影响的生理基础。结果表明:细胞分裂素生产菌处理后,马铃薯的株高、株鲜重、根鲜重都有所增长;马铃薯的水分利用率、根系活力和干物质储存量上也有所增加;经细胞分裂素生产菌处理的马铃薯光合速率、根系活力、水分利用率均高于对照组。     

产纤维素酶芽孢杆菌筛选及发酵条件的初步研究

通过刚果红染色法和DNS分光光度法对10种芽孢杆菌分泌胞外纤维素酶进行筛选,得到1株芽孢杆菌(菌株编号为Pab02)酶活达170.948U/mL.并进一步对其发酵培养基的初始pH值、发酵温度及时间进行优化,结果显示该菌株在pH值为8.0、温度37℃、时间48h条件下酶活达到358.751U/mL酶液,比优化前提高了2.1倍.