长白猪Plin3、Plin5基因克隆及表达规律研究

脂滴包被蛋白3(Plin3)和脂滴包被蛋白5(Plin5)是细胞内脂滴包被蛋白(PAT)家族的成员,在脂滴合成方面具有重要作用。为探究Plin3和Plin5在长白猪中的序列和表达特征,利用PCR技术扩增该基因,采用生物信息学分析两者的序列特征,并利用实时荧光定量PCR技术检测其在长白猪11个不同组织中的表达特征。结果表明,长白猪Plin3序列全长1 403 bp,Plin5全长1 397 bp,两种蛋白二级结构均以α-螺旋为主,无规则卷曲次之,不存在跨膜结构,无信号肽结构,有多个磷酸化位点。检测两种基因在不同组织中的表达水平发现,Plin3在长白猪的11个组织中均有表达,其中在脾脏中的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05),肝脏次之;Plin5在脂肪组织中的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05),而在大肠和小肠中不表达。本研究为进一步探究长白猪Plin3和Plin5在脂质代谢中的作用机制提供了理论依据。     

亚洲棉NCED3基因克隆及其抗旱功能分析

9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是脱落酸(ABA)合成过程中的关键限速酶,被证实广泛参与植物的生长发育进程及对非生物胁迫的应答。为了挖掘、鉴定棉花抗旱相关的NCEDs基因,本研究克隆了亚洲棉(Gossypium arboreum)GaNCED3基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了干旱胁迫下该基因的表达特性;并遗传转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),研究了该基因在干旱应答中的功能。结果显示,GaNCED3基因开放阅读框(ORF)全长为1 794 bp,其编码的蛋白质包含597个氨基酸。该基因在干旱胁迫处理后上调表达,在处理3 h的根中表达量最高,是对照的27.6倍。在萌发期进行甘露醇模拟的干旱处理,超表达GaNCED3的转基因拟南芥种子萌发率和绿苗率均高于野生型。在幼苗期进行自然干旱处理后,转基因拟南芥植株叶片丙二醛含量显著低于对照(P<0.05),游离脯氨酸积累量显著高于对照(P<0.05)。本研究初步证明了外源超表达GaNCED3基因使植株抗旱能力增强,为进一步研究GaNCED3干旱应答的分子机制提供了理论依据,为抗旱育种提供了候选基因资源。     

红花花青素还原酶基因ANR的克隆及表达分析

花青素还原酶(ANR)是类黄酮代谢途径下游合成原花青素的关键酶,对花青素含量有一定的负调控作用。为探索ANR基因在红花(Carthamus tinctorius L.)中的序列特征及其与红花花色的关系,采用反转录PCR方法从红花中克隆ANR基因,对其进行生物信息学和系统进化分析,并检测了其在不同花色红花品种的不同组织部位及不同花期的表达量。结果表明,CtANR最长开放阅读框(ORF)为1 020 bp, 编码339个氨基酸,分子量为37 958.28,理论等电点为5.87,为不稳定的亲水性蛋白,属于NADB-Rossmann超家族,二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲组成。CtANR和刺菜蓟ANR的同源性最高,为83.98%,与刺菜蓟ANR的亲缘关系最近,与梅花、欧洲甜樱桃ANR的亲缘关系较远,模体基序相差较大。定量分析表明,红色和白色红花品种中,CtANR基因都是在果球形成初期表达量最低,其次是根和茎中表达量较低,而在花中的表达量相对较高。在花发育的不同时期,红色红花品种中CtANR基因的表达呈现降低-升高-降低的趋势,而白色红花品种中CtANR基因的表达呈现降低-升高的趋势。在不同花色的红花品种中,CtANR基因的表达量在花发育的S1、S3和S5时期差异极显著(P<0.01),S4、苞片、根、叶中差异显著(P<0.05),其他时期与其他组织中差异不显著。本研究为解析红花类黄酮生物合成的分子机制及红花花色相关基因的研究提供了理论基础。     

不同品种苹果叶片对外源水杨酸的生理响应

为探究富士和嘎啦对外源水杨酸的生理响应机制,采用叶片喷雾法,测定外源水杨酸(SA)对苹果叶片中丙二醛(MDA)含量、防御酶活性及病程相关蛋白(PR)基因表达的影响。结果表明,0.2mmol·L~(-1)SA处理后,富士和嘎啦叶片中MDA含量变幅较小且均与对照无显著差异;SA处理显著提高了叶片中过氧化氢酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,富士和嘎啦叶片中各酶活性峰值分别是对照的1.31倍~2.06倍和1.16倍~3.13倍。SA诱导后苹果叶片中PR5和PR8的表达明显上调,富士于处理后第3天基因表达量达到高峰,而嘎啦于处理后第1天基因表达量最高。研究表明,外源SA可提高苹果叶片中防御酶活性并诱导PR基因上调表达,但富士和嘎啦中酶活性水平和持续时间及PR基因的应答反应存在差异。本研究为利用植物诱导抗病性防治苹果叶部病害提供了科学依据。     

草鱼Rab1A基因的克隆表达、抗体制备及对微囊藻毒素-LR的响应

为了解草鱼(Ctenopharygodon idella)小分子三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白家族成员Rab1A的分子结构特点及其在微囊藻毒素-LR (MC-LR)胁迫中的作用,本研究根据草鱼肝脏(MC-LR诱导)转录组测序获得的unigenes序列,采用RACE技术克隆了草鱼Rab1A基因cDNA,其全长序列为806 bp,开放阅读框为609 bp,编码202个氨基酸。同源性分析结果表明,Rab1A与鲤鱼(Cyprinus carpio) Rab1A3相似性最高。系统进化分析表明草鱼Rab1A与鲤鱼、斑马鱼(Danio rerio)等鱼类聚为一大支。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析发现Rab1A在草鱼各组织中广泛分布,在血液和鳃等组织中的表达较丰富。构建了pGEX-4T-1-Rab1A重组表达载体,并制备了Rab1A多克隆抗体,通过酶联免疫(ELISA)检测抗体效价为1∶512 000以上,Western blot检测显示抗体具有特异性。草鱼肝脏经微囊藻毒素-LR(MC-LR)染毒,发现25和75 μg·g^-1感染96 h后对Rab1A基因和蛋白表达的影响不明显(P>0.05),但100 μg ·kg^-1 可导致草鱼肝脏Rab1A基因和蛋白表达显著下降 (P<0.05),表明Rab1A在参与草鱼抵御MC-LR胁迫过程中起着重要的作用。本研究为进一步了解Rab1A基因的功能及其在MC-LR胁迫过程中所发挥的作用奠定了基础。     

CIDEC的亚细胞定位及其功能初步研究

CIDEC(也称FSP27)高表达于脂肪组织,可以促进细胞内脂肪积累等。为探究CIDEC促进脂滴融合的机制,本研究利用脂肪酸处理HepG2细胞,测定细胞内脂滴直径和数目的变化,发现处理后脂滴的直径和数量无显著性差异。将含有CIDEC的重组载体转染细胞,脂肪酸处理24 h后测定脂滴直径和数量变化,进一步利用共聚焦显微镜分析其亚细胞定位,并检测与脂滴生成、生长等相关基因表达量的变化。结果表明,过表达CIDEC后脂滴的直径显著增加,脂滴的数量极显著减少;亚细胞定位发现,CIDEC位于脂滴周围。此外,PLIN1、CREB1、CREB8的表达量有所下降,CIDEA、CFD表达量有所上升,推测CIDEC可能与这些蛋白互作引起脂滴融合。本研究结果为探究CIDEC促进脂滴融合的分子机制奠定了基础。     

基于一种新的天花板培养方法分析猪成熟脂肪细胞去分化过程中关键基因表达模式

成熟脂肪细胞在天花板培养(ceiling culture)条件下可自发去分化为不含脂滴的成纤维细胞(dedifferentiated fat cell,DFAT),这种细胞体外可向多个谱系分化,因此近年来备受人们关注。为研究猪成熟脂肪细胞去分化过程中关键基因表达规律,本研究先分离、鉴定了猪成熟脂肪细胞,然后采用一种新的天花板培养法使其发生去分化,再用实时定量PCR(RT-qPCR)技术分析了猪成熟脂肪细胞去分化过程中关键基因的表达变化,最后用1μmol/L罗格列酮(Rosiglitazone)处理猪成熟脂肪细胞,研究增强成脂对去分化的影响。结果显示:分离的猪成熟脂肪细胞的纯度高达98.7%,并且新式天花板培养法能够高效的使其发生去分化;在去分化的过程中中后期成脂关键基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aP2)和脂蛋白酯酶(LPL)的mRNA水平分别上调了8、3和7.5倍,而脂肪分解关键基因激素敏感脂酶(HSL)和脂肪组织甘油三酯脂肪酶(ATGL)的mRNA水平分别上调了40倍和10倍;罗格列酮处理能够显著抑制猪成熟脂肪细胞去分化(P<0.05)。这些结果说明,成熟脂肪细胞去分化是一个以脂解为主并伴有一定水平成脂的脂代谢过程,这为进一步研究成熟脂肪细胞去分化机理提供了理论依据。     

转GhB301基因棉花响应枯萎病菌侵染的转录组分析

乙烯响应因子(ethylene responsive factor, ERF)可以激活或者抑制下游病程相关蛋白基因的表达,在植物抗病信号转导途径中发挥着重要作用。为探究ERF-B3亚组基因GhB301在棉花抗枯萎病中的分子调控机制,本研究利用已获得的转GhB301基因棉花株系,通过孢子悬浮液蘸根的方法对转GhB301基因棉花株系(N)和野生型对照(WT)进行接菌处理,抗病性鉴定结果表明,过表达GhB301的N株系增强了对枯萎病的抗病性,其病情指数为14.77,显著低于WT(病情指数为37.50);枯萎病菌侵染0、6、12、24、48 h后,利用RNA-seq技术对N和WT的根部组织进行测序分析,共得到273 111 170个clean reads,其Q30均大于87.64%,将clean reads与陆地棉参考基因组TM-1比对,获得了14 021个差异表达基因(DEGs)。与WT相比,转基因株系能够在病原菌侵染后更快速地做出响应。GO及KEGG富集分析发现共有135个DEGs参与氧化还原过程,67个DEGs参与防御反应,31个DEGs参与苯丙烷类生物合成,推测这些DEGs可能与转基因棉花的枯萎病抗性增强存在密切关系。本研究结果为阐明GhB301基因响应棉花枯萎病菌侵染规律奠定了基础。     

不结球白菜BcLBD37基因的克隆及其对硝酸盐吸收的调节

LBD转录因子是高等植物特有的一类转录因子。为研究不结球白菜LBD基因对硝酸盐吸收的影响,以紫色不结球白菜自交系NJZX3-4为材料,采用同源克隆的方法克隆BcLBD37基因;通过构建PRI101过表达载体,异缘转化拟南芥,实现BcLBD37基因的过表达;同时借助病毒介导的基因沉默技术(VIGS),使不结球白菜中的BcLBD37基因沉默;并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析BcLBD37基因过表达以及沉默后对硝酸盐吸收相关基因表达量的影响。结果表明,该基因片段长度为840 bp,编码279个氨基酸。与野生型相比,转基因拟南芥中硝酸盐代谢相关基因NIA1、NIA2、NRT1.1、NRT1.7、NRT2.1、NRT2.5的表达量均显著下调,硝酸还原酶活性和硝态氮含量亦显著降低。而在不结球白菜中沉默该基因后,沉默植株PTY-2/4中硝酸盐代谢相关基因的表达显著上调,硝酸还原酶活性和硝态氮含量亦显著提高。综上可知,BcLBD37基因通过抑制硝酸盐代谢相关基因的表达,调节硝酸还原酶的活性,进而抑制$\text{NO}_{3}^{-}$的吸收。本研究为提高不结球白菜营养品质提供了理论依据。     

CO2浓度升高与施氮对薏苡苗期营养元素吸收运输的影响

为明确大气CO₂浓度升高及氮肥施用对薏苡(Coix lacryma-jobi L.)苗期营养元素吸收运输的影响,本研究以兴仁白壳薏苡为试验材料,采用盆栽控制试验,通过人工气候箱模拟CO₂浓度升高,探究薏苡各器官中营养元素对CO₂浓度升高和施用氮肥的响应。结果表明,CO₂浓度升高使薏苡根中TOC含量显著增加15.82%;叶、茎中TP含量显著增加18.98%、29.41%(P<0.05);叶、根中N含量显著减少8.15%、8.31%(P<0.05);叶、茎、根中K含量无显著差异。施氮使薏苡叶、茎、根中N含量显著增加19.52%、28.42%、23.29%;叶、茎中TP含量显著增加14.60%、51.96%(P<0.05);根中K含量显著减少22.57%(P<0.05);叶、茎、根中TOC含量无显著差异。两者交互作用下,薏苡茎、根中N含量显著增加6.49%、8.99%;叶中TP含量显著增加15.33%(P<0.05);叶中N含量显著减少4.22%;叶、茎中K含量显著减少18.47%、33.25%(P<0.05);叶、茎、根中TOC含量无显著差异。在CO₂浓度升高条件下,薏苡叶片中中量元素S和微量元素Cu、Zn、Ni含量,分别显著减少18.06%、54.01%、37.96%、50.99(P<0.05);而茎中Mn、Cu、Zn、Ni含量,分别显著增加90.20%、70.55%、46.80%、149.50%(P<0.05)。CO₂浓度升高能促进Mg、S根向茎的运输以及Zn、Mn茎向叶的运输,施用氮肥能促进Fe茎向叶的运输。综上所述,CO₂浓度升高和氮肥施用会影响薏苡不同器官矿质离子的吸收及选择性运输能力,从而维持植物体内营养元素平衡。本研究结果可为深入认识未来大气环境变化下,薏苡对营养元素的需求变化特征,以及薏苡栽培中施肥策略的选择提供科学依据。     

丙酸睾酮对三疣梭子蟹氨基酸和脂肪酸组成的影响

为研究丙酸睾酮(TP)对三疣梭子蟹氨基酸和脂肪酸组成的影响,试验以三疣梭子蟹I期幼蟹为材料,随机分为对照组(饲料中无丙酸睾酮)、TP 200处理组(饲料含200 mg·kg^-1TP)和TP 400处理组(饲料含400 mg·kg^-1TP),养殖90 d后,采用液相色谱质谱联用法检测血清TP、睾酮(T)和雌二醇(E₂)含量,并测定各组生长指标及存活率,检测肌肉和肝胰腺的基本营养成分、氨基酸及脂肪酸组成。结果显示,三疣梭子蟹血清中性激素含量较高,表明其具有较强的性激素富集能力。添加TP对三疣梭子蟹肝胰腺指数及蜕壳频率无显著影响,但成活率显著降低(P<0.05),TP 200组三疣梭子蟹的增重率、特定生长率及全甲宽等指标显著高于对照组及TP 400组(P<0.05)。TP 200组和TP 400组的总氨基酸、必需氨基酸含量与对照组相比无显著差异,但精氨酸含量显著降低(P<0.05)。TP 200组和TP 400组肌肉脂肪酸组成和含量与对照组相比无显著差异,但肝胰腺中部分脂肪酸特别是高度不饱和脂肪酸(C20∶2...     

枇杷EjNAC82的克隆及其对类胡萝卜素合成基因EjPSY、EjBCH的转录激活分析

为了探讨NAC转录因子对枇杷果实类胡萝卜素代谢的调控机制,以大红袍(红肉枇杷)和白沙(白肉枇杷)为试验材料,利用RNA-Seq技术对大红袍和白沙进行转录组测序,通过分析两个品种间的转录组差异,初步筛选并克隆出了1个枇杷NAC转录因子,命名为EjNAC82。生物信息学技术分析结果发现,EjNAC82具有NAC转录因子特有的结构域、理化性质和蛋白质结构特点,是典型的NAC转录因子家族基因。亚细胞定位试验发现该转录因子定位于细胞核。实时荧光定量PCR结果表明,EjNAC82在枇杷老叶中的表达量高于根、芽、嫩叶、老叶、嫩枝、老枝、幼果和熟果。EjNAC82在果皮和果肉成熟过程中的表达模式相同,均呈先上升后下降再上升的趋势。随着果实的成熟,EjNAC82在大红袍果肉中的表达显著高于白沙(P<0.05)。EjNAC82在大红袍果皮S1、S2、S4时期的表达显著高于白沙。LUC/REN双荧光素酶试验结果表明,EjNAC82对EjPSY1、EjPSY2和EjBCH启动子具有激活作用。这些结果表明EjNAC82可能通过调控EjPSY1、EjPSY2和EjBCH基因的表达从而正向调控枇杷果实中类胡萝卜素的合成。本研究结果为揭示NAC转录因子对枇杷果实类胡萝卜素积累的转录调控功能提供了理论依据。     

Variation in soil nitrifiers and leaf nitrate reductase activity of selected tree species in a forest community

Nitrate reductase activity of green leaves of red oak, hemlock, basswood, sugar maple and beech were studied in relation to soil ammonifier and nitrifier populations and available mineral N of associated soils in a forest community near Ithaca, New York. Significant intersite, i.e. interspecific, differences were found for all plant and soil factors studied. Extractable NH⁺₄-N was higher than NO₃⁻-N under all species. Nitrate reductase activities (NRA) of the green leaves of the five dominant species were significantly correlated with soil NO₃⁻-N beneath the tree canopies (P < 0.001). Nitrosomonas and Nilrobacter counts were intercorrelated (P < 0.001), and Nitrobacter was found to be related to both soil NH⁺₄ (P < 0.05) and soil NO⁻₃ (P < 0.001). Nitrosomonas and Nitrobacter counts were highest under basswood, and leaf NRA was 20–50 times higher in basswood leaves than in any of the other four species. Basswood also had the highest total leaf N, 5.02 ± 0.06%. Our data suggest that in these forest stands, green-leaf nitrate reductase activity is a reliable index of soil mineral N usage by the five species. Moreover, we believe that the data support the notion that Nitrobacter populations, and thus nitrification rates, are inhibited by the dominant tree species to result in a more ammonium-based nutrition, which on the system level ultimately has a conserving effect on the N economy of these stands.     

内蒙古东部中晚熟区青贮玉米产量和品质与气象因素的关系

为研究青贮玉米(Zea mays L.)产量和品质与气象因素的关系,于2018—2019年在通辽市农业科学研究院试验基地,以北农青贮368、东科301、京科青贮516及京科968为材料,设置D1(4月24日)、D2(5月1日)、D3(5月8日)和D4(5月15日)4个播期,比较不同播期条件下青贮玉米产量和品质的变化,分析青贮玉米产量和品质形成与气象因素的关系。结果表明,随着播期的推迟,各品种青贮玉米生育期缩短,株高和茎粗均呈增加趋势,绿叶数变化不大,D2播期的穗位较高。各品种在D2播期的平均生物产量最高(35.2～40.2 t·hm^-2)。随着播期推迟,中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量呈增加趋势,粗蛋白含量变化不明显,D2播期淀粉含量较高。生育期日照时数(R²=0.381,P=0.031)和吐丝后日照时数(R²=0.507,P=0.003)与干物质产量呈负相关,生育期降雨量(R²=0.591,P<0.001)和吐丝后降雨量(R²=0.367,P=0.03...     

超声波微波协同提取沙棘叶黄酮及其组成和活性研究

沙棘叶中富含黄酮类化合物等多种活性成分,为提高其提取率和利用率,本研究采用常规溶剂萃取、超声辅助、微波辅助、超声波微波协同提取4种方法对沙棘叶黄酮进行提取,测定沙棘叶黄酮得率并观察沙棘叶的微观组织结构,比较筛选沙棘叶黄酮的最佳提取方法。并采用响应面法对最佳提取方法进行工艺优化,同时测定沙棘叶黄酮组成和体外抗氧化活性。结果表明,超声波微波协同提取法是提取沙棘叶黄酮的最佳方法,黄酮得率较常规溶剂萃取法提高了42.54%(P<0.05),沙棘叶细胞损伤最严重。超声波微波协同提取沙棘叶黄酮的最佳工艺为乙醇体积分数61%、提取时间18 min、微波功率446 W,此时黄酮得率为42.09 mg·g^-1。沙棘叶黄酮提取液中共鉴定出6种黄酮类成分,分别为儿茶素、丁香酸、山萘酚、槲皮素、异鼠李素、杨梅素,其中儿茶素含量最高,为1.474 8 mg·g^-1,其余5种的含量均在0.1~0.3 mg·g^-1之间,山萘酚最低,为0.125 2 mg·g^-1;沙棘叶黄酮提取液具有较强的还原力及较高的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和羟基自由基清除率,抗氧化活性较高。本研究为沙棘叶黄酮的工业化生产提供了科学依据。     

猕猴桃AdMSD1和AdMSD2的克隆及其在果实后熟软化中的表达

锰超氧化物歧化酶(MnSOD)在植物生长发育与衰老及应对逆境胁迫中发挥重要作用。为探究MnSOD基因在猕猴桃果实后熟软化及采后贮藏过程的作用,本研究以米良1号猕猴桃为试材,克隆了2个MnSOD基因,分别命名为AdMSD1和AdMSD2。AdMSD1包含675 bp的开放阅读框(ORF),编码224个氨基酸,登录号为KY471358;AdMSD2包含690 bp的ORF,编码229个氨基酸,登录号为KY471359。生物信息学分析结果表明,AdMSD1和AdMSD2均编码稳定的碱性亲水蛋白,包含保守金属结合域DVWEHAYY、Mn²⁺金属结合位点和特征氨基酸。AdMSD1和AdMSD2均由6个外显子和5个内含子组成。进化树结果显示,2个蛋白聚在双子叶植物组的不同分支,属于MnSOD家族的不同成员。定量分析结果表明,AdMSD1在叶片的转录水平最高,在花中的转录水平最低;AdMSD2在花中的转录水平最高,在成熟果中的转录水平最低。2个基因在果实后熟软化过程的转录呈动态变化,但均在软化初期上调,软化Ⅰ期和Ⅱ期下调,进入软化Ⅲ期后再次回升。果实中AdMSD1和AdMSD2的转录水平均在低温贮藏过程中下降。AdMSD1在脱落酸处理的第1和第5天表达上调,而AdMSD2在脱落酸处理后表达下调;AdMSD1在赤霉素处理后表达下调,而AdMSD2在赤霉素处理的第1天表达上调,之后下调。研究结果表明,AdMSDs基因参与猕猴桃果实的后熟软化和采后贮藏过程,为进一步研究SOD在猕猴桃果实采后品质调控中的作用机制奠定了基础。