海岛棉GbTCP5基因沉默和过量表达载体的构建及拟南芥转化

海岛棉具有优良的纤维品质,TCP蛋白参与细胞生长和增殖调控,本研究构建海岛棉GbTCP5基因沉默和过量表达植物表达载体。以GbTCP5基因pGEM-T Easy-GbTCP5质粒为模板进行PCR扩增,并将该基因构建到植物表达载体pCAMBIA3301中,利用冻融法转入农杆菌GV3101菌株,通过农杆菌浸染法转化拟南芥植株,初步证明已获得转化海岛棉GbTCP5基因的拟南芥。利用重叠PCR方法替换拟南芥AtMIR319的成熟链和互补链序列,构建含有amiRTCP5前体的植物表达载体amiRTCP5-pCAMBIA3301,为深入研究海岛棉GbTCP5基因的生物学功能奠定基础,为研究棉花纤维发育机制提供理论依据。     

海岛棉与陆地棉不同纤维发育时期苯丙烷代谢相关基因表达差异比较

[目的]比较研究在海岛棉与陆地棉纤维发育过程中苯丙烷代谢相关基因(PAL和4CL)表达模式的差异.[方法]利用荧光定量PCR,检测不同品种来源纤维在不同发育时期目的基因表达量.[结果]发现PAL1及4CL1基因的表达量随纤维发育天数的增加而增加,在陆地棉军棉1号中,基因表达量在15 DPA达到最高,而在海岛棉新海20号中PAL1及4CL1基因的表达高峰期则为20DPA.[结论]发现PAL1基因与4CL1基因的表达模式在海岛棉与陆地棉纤维发育过程中出现差异,海岛棉中两个基因的表达高峰期均晚于陆地棉,为逐步揭示海岛棉和陆地棉纤维品质差异的分子机理奠定了一定实验基础.     

紫花苜蓿MsNST的克隆及对木质素与纤维素合成的功能分析

【目的】木质素和纤维素是植物次生细胞壁的主要组成成分,是影响牧草消化率和品质的主要因素之一。紫花苜蓿作为高蛋白饲草,是奶牛等草食家畜优质饲草的主要来源。因此,苜蓿木质素和纤维素合成机制一直是受到关注的研究热点。模式植物拟南芥NAC家族的NST转录因子（NAC secondary wall thicking promoting factor）调控次生细胞壁的合成,但紫花苜蓿NST的功能与调控机制尚不明确。本研究通过分析紫花苜蓿NST的表达模式,及在拟南芥与苜蓿中过表达揭示其对木质素和纤维素合成的影响。【方法】通过同源克隆获得MsNST CDs序列,并对该基因进行生物信息学分析。利用qRT-PCR检测该基因受赤霉素（GA3）,水杨酸（SA）和多效唑（PCB）诱导后的表达模式。通过转基因植株中过表达MsNST,研究其对木质素和纤维素含量及其合成相关基因的影响。【结果】克隆MsNST 的CDs序列,最大开放阅读框为945bp,编码314个氨基酸。生物信息学分析表明,MsNST主要由无规则卷曲组成（60.83 %）;三级结构预测显示,MsNST以同源二聚体的形式有效的促进蛋白质间的相互作用。进化树分析表明,单子叶和双子叶分为两个分枝,暗示存在一定程度的进化,而MsNST与蒺藜苜蓿和大豆的NST属于双子叶植物分枝中的亚分枝,表明豆科植物间亲缘关系较近。MsNST与拟南芥NST1-3的氨基酸序列相似性较高（49%—55.9%）,并含有NAC转录因子的5个保守结构域。qRT-PCR分析表明,MsNST受GA3、SA和PCB的诱导表达,相对表达水平（12h）分别是对照的2.19、3.67和3.65倍。过表达MsNST导致拟南芥下胚轴缩短,转基因拟南芥半矮化,花序茎束间细胞壁纤维增厚,细胞壁结晶纤维素（13%）、总糖（7%）和木质素（11.7%）含量增加。通过分析木质素和纤维素合成相关基因表达水平发现,拟南芥和苜蓿中过表达MsNST均能激活木质素合成关键基因（PAL,4CL等）及纤维素合酶复合体亚基CesA家族基因的表达。【结论】MsNST受外源激素GA3、SA和PCB诱导表达。转基因植物中过表达MsNST可激活次生壁木质素和纤维素合成相关基因的表达,同时茎束间纤维细胞壁增厚,细胞壁结晶纤维素、总糖和木质素含量增加,暗示MsNST对次生细胞壁木质素和纤维素的合成有重要的调节作用。     

利用基因芯片分析比较Giza75和SG747纤维发育差异表达基因

【目的】 利用适应性广、产量高的陆地棉和纤维品质优异的海岛棉进行高通量基因芯片比较分析,筛选和鉴定棉纤维发育相关的关键基因。【方法】 以SG747(Gossypium hirsutum L.)和Giza75(Gossypium barbadense L.)为材料,利用Affymetrix公司的棉花寡聚核苷酸基因芯片对其开花后10 d(10 days after anthesis, 10 DPA)的棉纤维进行表达谱分析。【结果】 材料Giza75和SG747共筛选到3 905个差异表达基因,其中功能预测基因占比17.80%,翻译、核糖体结构相关基因占比16.82%,翻译后修饰占比14.32%。Gra.2198.1.A1_at正向调控棉纤维发育过程,Gra.85.1.S1_at、Ghi.249.1.A1_at和Ghi.8448.1.S1_x_at负向调控棉纤维发育过程,可能参与了棉纤维发育过程。【结论】 利用陆地棉和海岛棉基因芯片并结合qRT-PCR筛选和鉴定到4个纤维发育相关的关键候选基因。     

花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因AhNRT2.7a响应低氮胁迫的功能研究

【目的】 氮素在作物生产中对生物量和产量起关键作用。高亲和硝酸盐转运蛋白基因NRT2在植物响应低氮胁迫时被激活并具有维持氮吸收和转运的作用。通过筛选花生低氮耐受相关的NRT2基因并解析其生物学功能,为培育高氮素利用率的花生新品种提供理论参考,最终有助于实现节氮、高效的绿色生产目标。【方法】 检测正常氮浓度及1/20正常氮浓度（15 mmol·L^-1）条件下5个具有典型跨膜结构的花生NRT2基因（AhNRT2.4、AhNRT2.5b、AhNRT2.5c、AhNRT2.7a和AhNRT2.7b）的时空表达情况。以花育6309的cDNA为模板,对AhNRT2.7a进行克隆和生物信息学分析,并通过亚细胞定位确定AhNRT2.7a的表达部位。进一步构建异源过表达AhNRT2.7a的拟南芥株系,分别在正常以及低氮胁迫条件下测定其叶绿素含量、氮积累量以及谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、硝酸还原酶（NR）、亚硝酸还原酶（NiR）、谷氨酸脱氢酶（GDH）5个氮代谢关键酶的活性。【结果】 5个NRT2基因中有4个NRT2基因在花生响应低氮胁迫条件下大量表达。其中,AhNRT2.7a能够响应低氮胁迫,并在花生茎和叶中高表达。获得AhNRT2.7a的cDNA序列,全长为1 380 bp,编码459个氨基酸。蛋白结构分析显示其为具有12个典型跨膜结构域的膜蛋白。该氨基酸序列与栽培种花生（Arachis hypogaea L.）相似性高达99.56%,其次是野生亲本AA和BB基因组花生。亚细胞定位显示其主要定位于细胞质膜上。构建异源过表达AhNRT2.7a的转基因拟南芥植株,在不同供氮条件下,成熟叶和幼叶叶片的叶绿素相对含量均显著高于野生型拟南芥。同时,对上述5个氮代谢相关酶活性以及氮、磷、钾积累量测定显示,转基因植株中2个氮代谢相关酶（GS和NR）的酶活性以及氮积累量均比野生型拟南芥有显著升高。【结论】 花生中4个NRT2基因响应低氮胁迫,其中AhNRT2.7a能够提高植物氮代谢过程的氮素利用率。AhNRT2.7a的表达在促进氮代谢过程的同时,促使碳代谢作用的进一步加强。因此,AhNRT2.7a适合作为花生氮素高效利用为目的的候选基因。     

TETs与细胞程序性死亡相关基因在山羊妊娠早期输卵管及子宫角的表达

【目的】TET（ten-eleven translocation）家族蛋白在调控胚胎和胎盘发育等过程中具有重要作用,输卵管与子宫内膜细胞的死亡平衡会影响受精卵及早期胚胎的发育。因此探讨TETs、细胞程序性死亡相关基因和附植相关基因在妊娠早期山羊输卵管及子宫角中的表达规律及其潜在调控作用,以期为研究胚胎发育及附植的分子机制奠定基础。【方法】以合川白山羊为研究对象,采集妊娠19d（P19）山羊子宫角及输卵管组织,以空配19d（C19）为对照,利用H.E染色观察C19组和P19组山羊子宫角组织形态,利用qRT-PCR技术检测了胚胎附植相关基因（WNT5a、OPN、VEGFA）、TETs（TET1、TET2、TET3）、细胞程序性死亡相关基因（凋亡相关基因（BAX、BCL2、Caspase9）、焦亡相关基因（GSDMD、NLRP3、Caspase1）和炎症相关基因（NF-kB、TNF-α））的相对表达,并分析了TETs及细胞程序性死亡相关基因在输卵管和子宫角组织的表达相关性。【结果】H.E染色结果显示,在P19组中山羊子宫角的腺体增多,形态多变。qRT-PCR结果显示,OPN在P19组山羊子宫角中的表达量极显著高于C19组（P＜0.01）,BAX/BCL2的表达量显著增加（P＜0.05）,而WNT5a和 VEGFA表达差异不显著;TET1、TET2、TET3在山羊子宫角及输卵管中均有表达,在C19组和P19组山羊子宫角中TET1及TET2的表达量极显著高于C19组和P19组中TET3的表达（P＜0.01）;在P19组山羊输卵管中TET2（P＜0.01）、NF-kB（P＜0.01）、Caspase1（P＜0.01）、GSDMD（P＜0.05）显著增高。相关性分析表明,输卵管中TET2与TET3（P＜0.01）、NF-kB（P＜0.01）、Caspase9（P＜0.05）显著正相关;子宫角中,TET3与VEGFA（P＜0.05）、WNT5a（P＜0.01）显著负相关,胚胎附植关键基因OPN与Caspase1（P＜0.01）、NLRP3（P＜0.05）、GSDMD（P＜0.05）显著正相关,而细胞焦亡关键基因GSDMD在输卵管与子宫角中均与Bax（P＜0.05）、Caspase1（P＜0.01）、NLRP3（P＜0.05）呈显著正相关。【结论】在妊娠早期山羊子宫角和输卵管中TETs表达与细胞程序性死亡部分基因表达具有一定的相关性,推测TETs与细胞凋亡或焦亡的发生对输卵管、受精卵、早期胚胎及子宫的发育具有一定的调控作用。胚胎附植关键基因OPN与焦亡相关基因显著相关,暗示妊娠早期子宫角中细胞焦亡的发生可能参与胚胎附植。为研究TETs通过细胞程序性死亡相关基因在妊娠早期输卵管及子宫角中的表达规律提供了理论参考。     

利用RNA-Seq发掘玉米叶片形态建成相关的调控基因

【目的】叶片宽度和长度等叶形特性是决定植株形态,进而影响种植密度的重要农艺性状,通过转录组测序技术筛选并挖掘玉米叶片形态建成相关的代谢路径及调控基因,为深入认识叶片发育的分子机理和鉴定叶宽、叶长候选基因奠定基础。【方法】以极端窄叶自交系NL409和宽叶自交系WB665为材料,利用RNA-Seq技术鉴定7叶期第七片叶近基部的差异表达基因（DEGs）,通过生物信息学分析,筛选与叶片发育密切相关的代谢通路,利用qRT-PCR验证不同激素路径叶形相关基因的表达结果,并结合启动子区域的序列差异挖掘叶形功能基因。【结果】分析对照（WB665）和样品（NL409）高通量测序结果,在叶宽形成关键部位共筛选出5 199个DEGs,其中,2 264（43.55%）个基因表达上调,2 935（56.45%）个基因下调表达,下调基因明显多于上调基因;GO功能富集分析表明,差异基因主要富集在细胞膜相关的细胞组分中,涉及代谢过程和细胞响应刺激;KEGG富集分析表明,差异基因主要参与到核糖体、植物激素信号转导、苯丙烷类代谢、乙醛酸和二羧酸代谢等过程,其中核糖体、植物激素信号转导、鞘脂类代谢下调表达基因较多的路径与叶片发育密切相关。核糖体路径富集到多个PRS（PRESSED FLOWER）基因,分析发现PRS13（PFL2）可能在调控窄叶发育过程中发挥重要作用。鞘脂代谢路径富集的基因几乎全部下调表达,引起抑制叶片发育的AP1（APETALA1）类和MAPK（Mitogen-Activated Protein Kinase）类基因上调,以及促进叶片发育的LFY（LEAFY）下调,与窄叶发育受抑制的表型一致。植物激素信号转导路径富集到的油菜素内酯（BR）响应基因和赤霉素（GA）代谢基因下调,细胞分裂素（CTK）和大部分生长素（Auxin）响应基因上调,与窄叶中DELLA蛋白基因上调表达,抑制GA并促进CTK基因表达的作用模式一致。通过qRT-PCR对18个叶片发育相关基因进行分析,结果表明,其表达趋势与转录组结果一致,分析发现BR相关的ROT3、Auxin相关的NAL7-like、AGO7-like以及TCP类转录因子CYC/TB1等基因与窄叶的形成密切相关。【结论】明确了一些与玉米叶片发育密切相关的代谢路径,还发现植物激素间的动态平衡对叶片发育有着重要影响,尤其是生长素与油菜素内酯、细胞分裂素与赤霉素之间的相互作用对调控叶片形态可能发挥重要作用。     

褐飞虱GSK-3调控糖原与海藻糖代谢的潜在功能

【目的】昆虫胰岛素信号途径能够介导糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3,简称GSK-3或GSK3）调控体内糖原及海藻糖等糖代谢过程,从而控制昆虫的各项生命活动。论文旨在探究糖原合成酶激酶在褐飞虱（Nilaparvata lugens）体内对糖原与海藻糖代谢的调控作用。【方法】首先,基于GSK-3的cDNA编码序列,利用ExPASy工具翻译GSK-3氨基酸序列,预测蛋白分子量大小及等电点（pI）;然后利用SignaIP4.1Server对其信号肽进行分析。其次,以笔者实验室饲养的褐飞虱为研究对象,从4龄开始,每12 h取材,取至成虫48 h。利用Trizol法提取褐飞虱总RNA,根据反转录试剂盒合成第一链DNA,以18S作为内参基因,通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测褐飞虱GSK-3在不同龄期mRNA水平上的相对表达量。然后利用RNAi技术,向褐飞虱体内显微注射双链RNA(dsRNA)抑制GSK-3,以注射dsGFP的褐飞虱作为对照组。注射后48 h利用qRT-PCR技术检测GSK-3的表达情况,确定抑制效果。另外,取注射后48 h虫体,分别测定褐飞虱体内海藻糖、葡萄糖、糖原含量及海藻糖酶（trehalase,TRE）活性变化。最后采用qRT-PCR检测胰岛素信号通路胰岛素受体基因(insulin receptor,InR)、类胰岛素多肽基因(insulin-like peptides,Ilps)及海藻糖代谢途径TRE、海藻糖合成酶基因(trehalose-6-phophate synthase,TPS)、糖原磷酸化酶基因(glycogen phosphorylase,GP)、糖原合成酶基因(glycogen synthase,GS)中相关基因的表达,分析GSK-3在胰岛素信号通路及海藻糖代谢途径中的调控作用。【结果】褐飞虱GSK-3开放阅读框为1 914 bp,编码637个氨基酸;预测蛋白分子量为69.25 kD,等电点为9.15,为偏碱性蛋白,无信号肽结构,序列高度保守。发育表达模式结果显示GSK-3在不同发育阶段表达不一致,5龄若虫蜕皮前后低表达。GSK-3的dsRNA注射后48 h,与对照组dsGFP相比,GSK-3表达极显著下降,表明RNA干扰效果明显。糖原含量和两类海藻糖酶活性显著下降,而海藻糖含量显著上升,推测糖原和葡萄糖转化为海藻糖,作为其生理活动的能量来源。qRT-PCR检测发现,当GSK-3表达抑制后48 h,TRE1-2的表达量显著下降,而TRE1-1和TRE2的表达量极显著下降。另外,2个TPS基因、GS以及GP的表达量均极显著下降;胰岛素信号通路的2个InR基因和4个Ilps基因的表达同样被抑制,间接表明InR能够调控GSK-3的表达。【结论】褐飞虱GSK-3低表达后能够通过调控胰岛素信号通路及海藻糖代谢途径相关基因表达来调控糖原及海藻糖代谢。相关研究结果有助于更加全面地探索褐飞虱等昆虫糖原合成酶激酶调控海藻糖及糖类物质平衡的潜在分子机理。     

花青素代谢对陆地棉叶片和纤维色泽呈现的影响

【目的】棉花作为一种重要的经济作物和油料作物,其叶片和纤维均可积累色素物质,呈现不同颜色。叶绿素、类胡萝卜素和花青素的含量及其比例是棉花叶片呈色的主要原因,而棕色纤维中主要色素成分为花青素单体氧化聚合而成的原花青素及其衍生物。通过分析陆地棉不同的叶色突变体叶片和纤维中的花青素含量,花青素和原花青素合成途径中关键基因的表达,探究棉花叶片和纤维颜色呈现与花青素合成的关系,为叶色突变体的利用和彩色棉纤维色泽的改良奠定基础。【方法】通过测定21个陆地棉叶色突变体的叶片花青素含量,根据叶色突变体叶片、纤维颜色和花青素含量差异,筛选了其中6个典型的棉花叶色突变体作为研究材料,比较叶片和纤维（开花后15 d）中的花青素含量,分析花青素含量与叶片、纤维颜色呈现的关系;同时检测叶片及不同发育时期纤维（开花后5、10、15和20 d）中花青素合成关键基因GhCHS和原花青素合成途径关键基因GhLAR和GhANR的表达水平,分析目标基因对叶片和纤维颜色呈现的影响。【结果】21个陆地棉叶色突变体叶片中的花青素含量差异显著,呈现紫红色或紫色的叶片花青素含量高。在筛选的6个陆地棉叶色突变体及其对照叶片和不同发育时期纤维中,叶片花青素含量显著高于纤维,棕色纤维的花青素含量显著高于白色纤维。叶片中,GhCHS表达量较高,而GhANR和GhLAR表达量较低,花青素积累与颜色呈现与其表达量没有显著的相关性;而在纤维中,GhANR和GhLAR在棕色纤维的表达量极显著高于白色纤维中,且主要集中在纤维发育的5—15 DPA高表达。【结论】陆地棉叶片和纤维的颜色呈现均与花青素含量有关,紫色及紫红色叶片以及棕色纤维中花青素含量高,但纤维颜色的形成与棉花叶片颜色呈现没有显著的相关性,其花青素含量与原花青素合成途径的关键基因GhANR和GhLAR表达水平直接相关,表明棉花叶片和纤维中的呈色机制不一致,原花青素主要在纤维中积累显色。     

棉花EXO70基因家族全基因组的鉴定及种间比较

【目的】当前四倍体棉花的主栽品种是陆地棉与海岛棉，陆地棉产量高且适应性好，海岛棉纤维品质优异但产量一般。EXO70是胞外分泌体（exocyst complex）中的关键亚基，在植物生长发育、胁迫响应等方面发挥重要作用。通过全基因组水平鉴定和分析陆地棉与海岛棉EXO70基因家族成员，并研究其在纤维发育、环境适应等方面的功能，有助于揭示陆地棉与海岛棉种间性状差异形成的分子基础。【方法】从拟南芥数据库（TAIR）获取EXO70家族蛋白序列作为参考序列，采用HMMER、ExPASy、MEME、TBtools等分析工具对陆地棉TM-1和海岛棉Hai7124基因组中EXO70家族成员进行鉴定与分析，系统比较该家族在基因表达模式、重要农艺性状的相关性、逆境响应等方面的异同点。【结果】通过对陆地棉和海岛棉的基因组水平分析，均鉴定出54个EXO70家族成员，根据系统进化发育可将其分为8个分支。陆地棉和海岛棉同源基因可一一对应，分布在陆地棉与海岛棉的20条染色体上，绝大多数成员为单外显子，但是两者间有12对同源基因在阅读框序列上存在较大差异。陆地棉与海岛棉大部分同源基因表达模式类似，但在同一纤维发育时期表...     

陆地棉GhPKE1的生物信息学分析及功能验证

为研究棉花重金属结构域基因GhPKE1在棉花中的作用，采用生物信息学方法对GhPKE1 DNA序列的结构特性及其编码蛋白质的理化性质、疏水性和蛋白二级结构等进行分析，并根据GhPKE1的结构特点构建了GhPKE1的病毒诱导基因沉默（VIGS）载体侵染棉花。结果表明，GhPKE1基因序列全长1 048 bp，蛋白质相对分子质量27.54 kD，等电点9.3，不稳定系数35.56。分别用硫酸钠（Na₂SO₄）和氯化镉（CdCl₂）胁迫处理沉默GhPKE1的三叶期棉苗，处理后植株表现出明显的表型差异。qRT-PCR表达模式分析表明，用pYL156：GhPKE1侵染过的棉花中GhPKE1转录水平与对照相比显著降低；与对照相比，沉默GhPKE1棉花幼苗的抗Na₂SO₄和抗CdCl₂性显著减弱。综上所述，GhPKE1基因在棉花响应逆境胁迫过程中发挥重要作用，为进一步研究棉花的抗逆机制奠定基础。     

棉蚜茧蜂对不同品种、不同生育期棉花的趋性行为反应

【目的】研究棉蚜茧蜂对不同品种、不同生育期棉花的趋性行为反应,为了解天敌昆虫与寄主之间关系,利用棉蚜茧蜂对棉蚜等害虫进行防控。【方法】以生产上大面积种植的GK-12(对照为泗棉3号)、新棉33B(亲本为新棉33)和SGK321(亲本为石远321)等3组棉花品种为材料,于棉花7叶期、现蕾前期和现蕾期,设计无虫棉植株、被棉蚜为害后剔除虫体的植株以及棉蚜+有虫株等3种不同处理,借助“Y”型嗅觉仪,检测棉蚜茧蜂在棉花不同生育期对这3种不同处理的趋性。【结果】棉蚜茧蜂无法识别健康的常规棉和转基因棉花植株;对不含棉蚜的被害棉来说,转基因棉对棉蚜茧蜂更具吸引力。而对含有棉蚜的有害棉来说,除7叶期GK12、新棉33B和现蕾期GK12这3组处理外,其他各组的转基因棉对棉蚜茧蜂均具较强的吸引作用。【结论】两类不同的棉花品种对棉蚜茧蜂不存在排斥性,棉蚜为害转基因棉花后更能吸引棉蚜茧蜂。     

HIGS-SsCCS转基因拟南芥的菌核病抗性鉴定

【目的】菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的一类真菌病害,核盘菌寄主范围广泛,严重危害多种作物的品质。本研究利用寄主诱导基因沉默（HIGS）的方法在寄主中诱导核盘菌致病相关基因的沉默从而增强寄主的菌核病抗性,为菌核病抗病育种提供新的思路。【方法】铜锌超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化剂,以核盘菌铜锌超氧化物歧化酶铜伴侣基因（copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase,SsCCS）为靶基因,通过生物信息学分析该基因的结构特点,并利用MEGA6.0软件构建系统发育树;通过分别比对拟南芥及核盘菌基因组,选择特异的干扰片段进行扩增;采用农杆菌介导的浸花序法,将HIGS载体转入拟南芥Col-0,通过DNA鉴定以及标记筛选出稳定的HIGS-CCS转基因拟南芥;选取4—5周龄的HIGS-CCS转基因拟南芥植株叶片接种核盘菌野生菌株1980,于接种24 h后统计病斑面积,分析转基因株系的菌核病抗性;通过qRT-PCR分析核盘菌侵染转基因植株过程中SsCCS的表达情况;同时在接种6、12、24 h后利用DAB染色的方法检测转基因植株与核盘菌互作过程中H₂O₂的积累。【结果】生物信息学分析结果表明,SsCCS（SS1G_00102）全长为1 010 bp,编码序列长759 bp,共编码253个氨基酸,该蛋白分子质量为27 176.96 Da,等电点（PI）为5.04,与灰霉病菌BcCCS（EDN25358）亲缘关系最近,氨基酸同源性达到87%,与拟南芥AtCCS（AT1G12520.1）亲缘关系较远;通过与核盘菌以及拟南芥基因组比对,选择314 bp特异干扰片段,成功构建SsCCS的HIGS表达载体,转化拟南芥。T₁及T₂代转基因拟南芥接种核盘菌24 h后的病斑面积均小于野生型拟南芥。从T₂代中获得3个稳定表达的T₃代HIGS-CCS转基因拟南芥株系：HIGS-CCS-5、HIGS-CCS-8、HIGS-CCS-13;与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥在接种核盘菌24 h后,病斑面积显著减小46%—61%;qRT-PCR结果显示核盘菌在侵染转基因植株过程中,SsCCS的表达量显著低于侵染野生型拟南芥。DAB染色结果表明,在侵染过程中,转基因拟南芥植株中H₂O₂的积累明显少于野生型拟南芥,ROS水平降低。【结论】利用HIGS方法在拟南芥中干扰核盘菌SsCCS的表达能够显著提高拟南芥的抗病性,研究结果为油菜等农作物菌核病抗病改良提供了参考。     

棉花品种抗旱性相关指标分析与综合评价

为揭示与陆地棉抗旱性紧密关联的农艺性状及生理生化指标，筛选出抗旱能力强的品种资源，以国内外203份陆地棉品种资源为试验材料，设置干旱胁迫和正常灌溉2个处理，测定不同棉花品种在2个处理下农艺性状及生理生化指标的差异，利用灰色关联度、抗旱综合度量值、综合抗旱系数、加权综合抗旱系数等方法，对203份陆地棉材料的抗旱性进行综合评价。结果表明，各性状指标与抗旱综合度量值（D值）间的紧密关系依次为：叶绿素含量>单铃重>衣分>株高>果枝数>始节位>叶面积>始节高>脯氨酸含量>果节数>有效结铃数>单株产量>丙二醛含量>超氧化物歧化酶活性；叶绿素含量、单铃重、衣分、株高、果枝数、始节位、叶面积、始节高与加权综合抗旱系数的关联度较大，可作为棉花抗旱性鉴定的重要指标。聚类分析表明，203份种质资源被划分为5个类群：第Ⅰ类为高抗旱型，包含鄂抗棉10、赣棉10、土库曼陆地棉等共12份品种，占5.9%；第Ⅱ类为抗旱型，包含KK-1543、豫棉15、皖棉8407等共62份品种，占30.5%；第Ⅲ类为中等耐旱型，包含晋棉6、新陆中48、鲁棉28等共80份品种，占39.4%；第Ⅳ类为敏旱型，包含豫棉17、17N8、农垦5等共35份品种，占17.3%；第Ⅴ类为高度敏旱型，包含新陆早24、新陆早29、冀棉12等共14份品种，占6.9%。研究成果为棉花抗旱育种提供了理论依据及材料支持。     

棉蚜取食被棉长管蚜危害棉花后其相关酶的活性

【目的】 研究棉蚜取食受蚜害胁迫棉花后,其体内酶活性的变化。【方法】 测定棉蚜取食受棉长管蚜危害24、48、72 h,及棉长管蚜、棉蚜交互危害的棉花后,其体内过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性。【结果】 棉蚜取食经棉长管蚜危害的棉花后,体内过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性均呈上升趋势。除SOD在棉长管蚜危害48 h后达到最大值86.03 U/mg,CAT、POD、AChE、GST均在棉长管蚜危害72 h后达到最大值,分别为452.82、8.12、0.080 9和52.24 U/mg。棉长管蚜和棉蚜交互危害中,2种蚜虫取食次序和取食时间对后取食棉蚜体内酶活性变化影响较大。第1次棉长管蚜危害对后取食棉蚜CAT、SOD、AChE、GST活性变化产生显著影响,第2次棉蚜危害对后取食棉蚜CAT、POD活性产生显著影响,第3次棉长管蚜危害对后取食棉蚜POD、AChE活性产生显著影响。对CAT活性影响最大的处理为:棉长管蚜-棉蚜-棉长管蚜依次危害72 h-72 h-24 h;对POD活性影响最大的处理为:棉长管蚜-棉蚜-棉长管蚜依次危害72 h-72 h-48 h;对SOD活性影响最大的处理为:棉长管蚜-棉蚜-棉长管蚜依次危害48 h-24 h-72 h;对AChE活性影响最大的处理为:棉长管蚜-棉蚜-棉长管蚜依次危害24 h-72 h-48 h;对GST活性影响最大的处理为:棉长管蚜-棉蚜-棉长管蚜依次危害72 h-48 h-48 h。【结论】 棉长管蚜危害棉花 72 h,对其后取食棉蚜体内酶活性影响最大;棉长管蚜和棉蚜交互危害中,第1次棉长管蚜危害对后取食棉蚜酶活性影响最大,第2次棉蚜危害和第3次棉长管蚜危害对后取食棉蚜酶活性影响均较小。     

海岛棉GbPR10基因的克隆及其抗枯萎病表达分析

【目的】为棉花抗枯萎病分子育种的基因来源提供依据。【方法】根据前期转录组测序和抗病表达数据,从棉花EST数据库中筛选出抗枯萎病有关的基因(登录号为CD486053)序列,在NCBI搜索与该基因同源性为94%的海岛棉抗病相关PR10基因(登录号为AY588276)并设计引物,从枯萎病接菌的抗病海岛棉材料“06-146”克隆一个海岛棉同源基因,命名为GbPR10基因。进行生物信息学和在枯萎病菌、乙烯、水杨酸处理下基因表达量分析。【结果】GbPR10基因有480 bp的ORF序列,编码159个氨基酸。该蛋白序列中具有PR10蛋白特有的Bet-v1结构域和改变的甘氨酸环P-Loop(GXGGXG)。蛋白质序列同源比对表明该蛋白与其他生物PR10蛋白有较高的一致性。亚细胞定位预测表明GbPR10分布于细胞质。qRT-PCR表达分析表明,GbPR10基因在不同抗病海岛棉品种的不同组织上表达量不均匀而较高于感病海岛棉品种;在乙烯和水杨酸处理的1对抗/感海岛棉根系中,抗病品种出现先上调后下调趋势,感病材料后期诱导表达,抗病品种的表达量几乎高于感病品种。【结论】GbPR10基因在海岛棉抗枯萎病信号途径中起重要作用。     

陆地棉BGLU基因家族成员的全基因组鉴定与表达分析

植物BGLU基因在生物和非生物胁迫防御中起着重要作用，利用生物信息学手段对陆地棉（Gossypium hirsutum） BGLU家族成员进行全基因组鉴定，对序列特征、保守域结构、染色体定位、启动子元件等家族特征进行了分析，并进一步结合转录组数据和qRT-PCR分析了BGLU基因家族的病菌胁迫响应模式。结果表明，共鉴定出53个陆地棉BGLU基因，根据系统发育进化关系分为6个亚族，部分基因在病菌胁迫下特异性表达。荧光定量和转录组测序结果表明，GhBGLU5、GhBGLU14、GhBGLU18、GhBGLU26、GhBGLU34在抗病棉花中的表达水平显著高于感病品种，推测这些基因正向调控棉花黄萎病抗性。上述结果为进一步分析棉花BGLU家族基因的功能以及分子机制提供一定的理论基础。     

低磷胁迫下3种不同种源葛藤的生长生理响应

为揭示葛藤（Pueraria lobate）幼苗对低磷胁迫的适应机制，选取来自澳大利亚和我国湖南和江苏的3个不同种源的葛藤为试验材料，设置0.5（常磷）、0.05（低磷）和0.005 （极低磷） mmol·L^-1 3种不同KH₂PO₄浓度处理，测定不同磷处理下3个不同种源葛藤幼苗的生长及生理响应。结果表明，0.05 mmol·L^-1磷处理下，3个不同种源葛藤的根长、根表面积、根直径等根系指标和叶面积、叶周长等叶片指标均呈显著上升趋势（P<0.05），表明葛藤具有一定的耐低磷性；在0.005 mmol·L^-1磷处理下，湖南和江苏葛藤的根系指标较澳大利亚葛藤受到了明显抑制，但湖南葛藤的叶片形态指标呈增长趋势。3个不同种源葛藤在低磷胁迫下的根和叶中脯氨酸、可溶性糖、丙二醛含量及抗氧化酶活性均显著增加（P<0.05），但可溶性蛋白含量下降。综上所述，澳大利亚葛藤的耐低磷能力强，具有较高的种植推广价值。     

小麦热激蛋白基因TaHSP90-1的克隆与表达分析

热激蛋白（heat shock protein，HSPs）是一类广泛存在于植物体内的应激蛋白，在植物响应逆境过程中发挥重要作用。为进一步了解小麦HSP90-1基因并探究其相关生物学功能，搜索小麦基因组序列数据库，获得了小麦A、B、D 3个基因组上的同源序列，根据其染色体位置分别命名为TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B和TaHSP90-1-D，通过同源克隆从12个小麦品种中得到TaHSP90-1 DNA序列。序列分析表明，TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B和TaHSP90-1-D分别含有2 121、2 136和2 130 bp的完整开放阅读框，分别编码707、712和710个氨基酸；其蛋白序列C端均含有1个HSP90结构域，为HSP家族HSP90亚家族成员。TaHSP90-1在不同小麦品种中存在SNP位点，分别位于TaHSP90-1-B第2个内含子区域和TaHSP90-1-D启动子区域。系统进化分析表明，TaHSP90-1-A与二粒小麦处于同一分支；TaHSP90-1-B和TaHSP90-1-D处于同一分支。顺式作用元件分析发现，TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B和TaHSP90-1-D启动子区域均含有干旱响应元件（MBS element）和热响应元件（HSE element）。RT-PCR结果显示，TaHSP90-1-A、TaHSP90-1-B和TaHSP90-1-D在苗期和成熟期的叶片中表达量较高。在干旱胁迫条件下，TaHSP90-1表达量在耐旱小麦品种中较高，为旱敏感小麦品种表达量的150倍；在热胁迫条件下，TaHSP90-1在热敏感与耐热小麦品种中均上调表达，其中，TaHSP90-1-A和TaHSP90-1-D在耐热小麦品种中上调表达倍数更高。