桃PpMADS1的克隆及对类胡萝卜素合成基因的调控研究

为探究桃MADS转录因子基因的序列特征、表达模式及其对类胡萝卜素合成的调控作用,本研究从桃果实中克隆得到一个MADS-box家族基因,命名为PpMADS1.结果 表明,PpMADS1的开放阅读框(ORF)为732 bp,编码243个氨基酸,蛋白具有亲水性,稳定性较差,其二级结构以α-螺旋为主要构成元件,且与三级结构相似...     

大白菜BrWRKY33基因上游调控序列的克隆及其功能研究

根据大白菜EST和基因组序列,利用PCR技术从大白菜品种龙白二号（Brassica rapa subp.pekinensis cv.LongbaiⅡ）基因组中克隆转录因子基因BrWRKY33起始密码子上游大小1755bp的调控序列。然后,构建5＇端缺失突变体,与gus基因融合,构建植物表达载体。将载体转化拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚生态型（Columbia ecotype）,进行植物组织GUS化学染色分析。结果表明,BrWRKY33密码子上游-1755～-315区域存在的多个W-box元件可能与该基因表达的负调控相关,-315bp区域含有BrWRKY33基因转录必需的基本元件。对接种软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora subsp.carotovora）后不同时期的植株进行染色,发现该病原菌侵染使转基因植株gus基因表达量增加,表明BrWRKY33基因在植物对软腐病抗性反应中具有一定的作用。     

华东葡萄抗白粉病转录因子基因的克隆及亚细胞定位分析

以抗白粉病华东葡萄（Vitis pseudoreticulata W.T.Wang）株系白河-35-1为材料,在经葡萄白粉病病原菌（Uncinula necator（Schw.）Burr.）诱导后获得的EST序列的基础上,本研究通过RACE技术克隆了一个具有转录域的转录因子全长1324bpcDNA序列,其阅读框为1053bp,编码350个氨基酸,命名为VpRFL1（GenBank登录号：FJ356672）。应用PCR技术,进一步获得了转录因子VpRFL1基因的DNA序列,其序列全长1599bp,VpRFL1基因包含3个外显子,2个内含子。生物信息学分析表明,华东葡萄白河-35-1VpRFL1基因编码的氨基酸序列在N端含有核定位信号,C端含有C4C4型RING锌指结构域。VpRFL1/PBI221-GFP在洋葱（Alliumcepa）表皮细胞中的瞬时表达分析表明,该转录因子主要定位于细胞核内。VpRFL1的序列特征与定位分析结果初步表明该转录因子基因在核内起作用,并可能参与了抗逆反应的相关途径。     

毛叶苕子磷饥饿响应基因VvPHR1的克隆及功能研究

【目的】磷饥饿响应因子PHR (phosphate starvation response)在植物根系发育和磷养分吸收中起重要作用,本研究主要阐明毛叶苕子VvPHR1基因生物学功能,为培育磷高效型绿肥作物提供理论依据。【方法】通过转录组测序获得毛叶苕子VvPHR1基因序列。采用酵母单杂交方法验证VvPHR1基因的转录激活功能,构建其过表达载体,利用花粉管通道法分别遗传转化野生型和突变体(Atphr1)拟南芥,获得超量表达VvPHR1基因和突变体功能回补转基因材料。对正常磷(1 mmol/L Pi)和低磷(1μmol/L Pi)的培养基中生长30天的拟南芥取样,采用实时荧光定量PCR对野生型和转基因拟南芥中VvPHR1及下游磷转运基因的表达进行分析,并对转基因材料进行表型分析,测定其主根长、鲜重、总磷及无机磷(phosphate,Pi)含量。【结果】毛叶苕子转录组中有13个PHR基因,转录本129590、96227、120424与拟南芥的PHR1相似度最高,其中转录本120424在低磷诱导下表达量最高,将该转录本命名为VvPHR1基因。该基因cDNA全长1008 bp,编码335个氨基酸...     

拟南芥AtEXPA1基因启动子的克隆及转录调控元件分析

扩张蛋白(expansin)是一类特异定位在细胞壁上具有酸生长活性的蛋白(Lee and Kende,2001;Chen and Bradford,2000),调控很多重要的生理过程(Cho and Cosgrove,2000),在时间和空间上的表达受到严格调控.本研究克隆了一个拟南芥expansin基因AtEXPAl的启动子,通过数种逆境胁迫诱导表达,对可能的活性响应部位进行了分析.     

多花水仙种球膨大期对乙烯的响应研究

为探讨乙烯在水仙鳞茎膨大过程中的作用以及种球对乙烯信号的响应,本试验以多花水仙种球膨大期的鳞片和内芽为供试材料,研究种球的生长与乙烯释放量和NtERFs基因表达之间的关系.结果 表明,多花水仙种球在3-5月间种球重量持续增加,为种球的膨大期.鳞片的乙烯释放量在5月中旬显著升高,内芽的乙烯释放量显著高于鳞片,在4月下旬出...     

拟南芥AtEXP1基因启动子的克隆及转录调控元件分析

为了研究拟南芥扩张蛋白AtEXPA1基因启动子上与转录调控有关的元件,我们通过PCR技术克隆了AtEXPA1基因上游897bp具有启动子活性的序列,再将启动子作不同程度截短,所有片段与GUS基因融合,构建植物表达载体,采用基因枪轰击拟南芥叶片和PEG介导转化烟草原生质体,通过定性和定量检测GUS的活性,发现在靠近翻译起始密码子的上游144bp之间存在增强转录活性的元件。将PEG介导转化的烟草原生质体,分别进行光诱导,冷诱导, 脱落酸（ABA）,盐处理,根据GUS定量检测的结果,推测（1）在AtEXPA1基因启动子上广泛存在与光调控有关的元件,（2） -897～-626 bp之间存在冷负调控元件, （3）-626～-444 bp之间存在与ABA负调控有关的元件,（4）-626～-282 bp之间存在与盐负调控有关的元件。     

葡萄ACO家族基因过量表达对番茄乙烯释放速率的影响

乙烯是启动和促进果蔬成熟和衰老的内源激素,ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO)是乙烯生物合成中的一个关键限速酶.葡萄ACO基因拥有一个基因家族,其中VvACO1和VvACO2基因在果实转色时期出现转录高峰,是葡萄果实发育过程中造成乙烯含量发生变化的关键基因.为验证葡萄(Vitis vinifera)ACO家族基因过量表达对番茄(Solanum locopersicum)乙烯释放速率的影响,本研究通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将葡萄ACO基因导入番茄基因组中,进行了PCR和RT-PCR分子检测,并对分子检测阳性的转基因番茄植株叶片的ACO酶活性和乙烯释放速率进行了分析.RT-PCR检测表明,在3个VvA CO1、4个VvACO2和6个VvACO3转基因番茄植株中目的基因均有一定的表达.所有转基因番茄植株的ACO酶活性和乙烯释放速率均比对照有所提高,其中以VvACO1基因的过量表达对叶片ACO酶活和乙烯释放速率增加的幅度最大,VvACO3基因的过量表达对果实的ACO酶活和乙烯释放速率增加的幅度最大,而转化VvACO2基因的番茄植株ACO酶活性和乙烯释放速率最低,比对照略有升高,且植株呈现矮化现象.本研究通过观察转基因番茄的生长状况以及测定转基因番茄的生理指标,探讨葡萄ACO家族基因的过量表达对番茄的影响,来预测葡萄ACO基因的初步功能.     

黄瓜果实CsMYB62克隆及其对CsGR-RBP3表达的调控

本研究前期证实,低温诱导的CsGR-RBP3表达与黄瓜果实耐冷性密切相关,但调控其表达的具体机理尚不清楚。为鉴定调控CsGR-RBP3表达的MYB转录因子,本研究采用转录组测序,分析了黄瓜果实在5℃低温处理后的转录组变化,并通过共表达趋势分析,鉴定了与CsGR-RBP3表达趋势一致的MYB基因。结果发现,CsMYB62与CsGR-RBP3表达的相关性很高,且低温处理能诱导黄瓜果实CsMYB62和CsGR-RBP3表达,推测CsMYB62转录因子可能调控CsGR-RBP3表达。为进一步分析CsMYB62基因的功能,从黄瓜果皮中克隆了CsMYB62基因全长序列。结果显示,CsMYB62基因全长834 bp,编码277个氨基酸残基。CsMYB62蛋白含有SANT保守域和MYB DNA结合域,定位在细胞核,在进化过程中高度保守。CsMYB62蛋白具有转录激活活性,能直接绑定到CsGR-RBP3启动子,增强CsGR-RBP3启动子活性,表明CsMYB62通过直接调控CsGR-RBP3表达而增强黄瓜果实耐冷性。本研究结果丰富了MYB调控网络,为进一步解析CsMYB62功能奠定了理论基础。     

中国野生华东葡萄抗白粉病转录因子VpRFP1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备

为揭示中国野生华东葡萄抗病转录因子基因在与葡萄白粉病互作过程中的作用机制,本研究以中国野生华东葡萄(Vitis pseudoreticulata W.T.Wang)高抗葡萄白粉病株系白河35-1为材料,接种葡萄白粉病菌(Unicinula necator(Schw.)Burr.)病原菌诱导后7个不同时期的反转录产物为模板,用RT-PCR扩增得到V.pseudoreticulata RING-finger protein1基因(VpRFP1)的开放阅读框1053bp;将其克隆到pMD19-T载体经测序后,亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(Escherichia.coli)BL21;经IPTG诱导表达出64kD的融合蛋白GST-VpRFP1,主要以包涵体表达形式存在;采用电透析法纯化融合蛋白,并以纯化产物免疫新西兰大白兔获得抗血清,Western blot检测免疫-抗原反应良好。本研究结果表明,在27℃、0.1mmol/L的IPTG诱导4h融合蛋白GST-VpRFP1的表达量最大,免疫大白兔获得的抗血清能够用于VpRFP1基因的功能分析。     

葡萄WRKY54基因克隆及表达特性分析

为了探究葡萄WRKY54基因的功能,以抗盐葡萄品种Vidal Blanc为材料,采用同源克隆法克隆得到Vv WRKY54基因,并对其进行生物信息学和表达特性分析。结果表明,Vv WRKY54基因c DNA序列为942 bp,编码313个氨基酸。生物信息学分析结果表明,Vv WRKY54蛋白分子量约为35.3091 k Da,等电点为5.45,不稳定系数为55.03,推测其为不稳定蛋白,与已知毛果杨及拟南芥WRKY54蛋白高度同源;亚细胞定位预测结果显示其主要存在于细胞核中。实时荧光定量PCR分析表明,Vv WRKY54在葡萄不同组织中均有表达,其中在梢尖中表达量最高;盐和低温等逆境胁迫因子均能诱导Vv WRKY54上调表达;此外,Vv WRKY54受水杨酸和一氧化氮诱导上调表达,其中水杨酸诱导Vv WRKY54相对表达量在12 h达到最大值,约为对照的50倍。推测Vv WRKY54在植物发育和抵御逆境胁迫中起着重要作用,这为进一步阐明Vv WRKY54的功能及作用机制奠定了分子基础。     

葡萄BBX基因家族的鉴定与表达分析

BBX转录因子家族参与植物幼苗的光形态建成、开花、光周期调控及避荫反应等,在高等植物的生长发育过程中起到重要作用。为了解葡萄中BBX基因家族功能,本研究利用生物信息学方法对葡萄BBX基因家族成员的数量、结构、启动子、氨基酸特性、染色体定位及基因进化进行分析。结果表明,葡萄BBX家族有25个成员,以酸性蛋白为主;亚细胞定位表明,有4个分泌途径信号肽,VvBBX2、VvBBX5、VvBBX7、VvBBX20;有2个叶绿体转运肽,VvBBX23、VvBBX24;有1个线粒体靶向肽VvBBX1。染色体定位分析发现,25个VvBBXs基因主要分布在1、3、4、5、7、9、11、12、14、18、19共11条染色体上;系统发育进化分析发现葡萄BBX家族成员分为5个亚家族;葡萄与拟南芥的同源性分析发现,葡萄BBX蛋白家族有很强的保守性;在葡萄BBX基因启动子序列中含有光相应元件、激素类响应元件、低温响应元件等多种顺式作用元件。葡萄BBX基因家族在不同发育时期不同葡萄组织中的表达谱显示,该基因家族具有一定时空表达特异性;不同光照条件下,葡萄BBX基因的相对表达量有显著变化,这表明葡萄BBX基因家族与光形态建成及光合作用有着密切的关系。本研究结果为葡萄BBX基因家族的进一步功能分析提供了重要研究基础。     

河西灌区酿酒葡萄水肥一体化栽培技术规程

酿酒葡萄是河西地区主要优势特色产业之一。为进一步完善酿酒葡萄水肥一体化技术体系,以节水控肥、提质增效为目标,基于多年定位试验基础,采用室内野外结合、实验分析与综合调查结合等研究方法,从适用范围、规范性引用文件、术语和定义、产地气候环境条件、水肥一体化系统组成与设备安装、栽培技术、肥水管理、设施维护等方面规范了河西酿酒葡萄水肥一体化高效栽培技术。     

钙和ABA在番茄果实乙烯生物合成中的相互作用

研究了钙和ABA对不同成熟阶段和不同成熟模式番茄(Lycopersicon esculentum cv．Lichun)果实乙烯生成的影响，分析两者在乙烯生物合成系统中的相互作用。普通番茄绿熟果实组织圆片在用100μmol／L ABA和100mmol/L钙处理后，乙烯生成均很快增加。当用这两种试剂同时处理番茄果实圆片时，乙烯生成增加量明显比单一处理增加量大，表明两者在对绿熟番茄果实乙烯生成的影响中有协同作用关系。钙离子鳌合剂EGTA(乙二醇双乙胺醚-N，N’-四乙酸)对乙烯生成有抑制作用，用ABA和EGTA同时处理番茄圆片时，乙烯的生成量比EGTA单一处理的生成量要高。当用这些试剂处理未成熟番茄果实则产生不同的效果，ABA明显抑制乙烯生成，而钙却依然促进乙烯的生物合成，ABA和钙同时处理果实时，乙烯生成量介于二者单一处理之间，表明ABA和钙在未成熟番茄果实乙烯生成中表现出相互抑制作用。在转反义ACS番茄中，ABA和钙抑制未成熟果实的乙烯生成，而都促进了绿熟果实的乙烯生成。这表明ABA和钙在番茄果实不同成熟阶段和不同成熟模式的乙烯生物合成过程中有着不同的相互作用关系。     

青花菜乙烯反应传感蛋白基因BoERS的克隆与表达分析

乙烯反应传感蛋白在乙烯信号转导中起着重要作用,可作为负调控因子使下游的CTR1失活,并激活之后的一系列反应。为明确青花菜ERS基因的序列特征和表达特点,本研究以青花菜为试验材料,在克隆乙烯反应传感蛋白基因BoERS的基础上进行表达分析,以明确其在核盘菌和根肿菌侵染下的表达模式。结果表明,BoERS的基因组DNA全长为1 928 bp,含有1个长度为68 bp的内含子;编码区全长为1 860 bp,编码619个氨基酸,编码蛋白有4个跨膜结构域、1个GAF结构域和1个HisKA结构域。序列比对结果表明,BoERS与芸薹属ERS序列的差异最小,在系统发育树上处于同一分支,但与萝卜属、盐芥属和拟南芥属植物ERS序列的差异较大,在系统发育树上处于不同的分支。实时荧光定量PCR结果表明,BoERS的表达受核盘菌的诱导,36 h时表达量最大,为对照的3.53倍,但BoERS的表达不受根肿菌的诱导。本研究结果为进一步开展BoERS基因功能鉴定和应用研究奠定了理论基础。     

猕猴桃AcbHLH137功能鉴定及对淀粉降解基因AcBAM3转录激活分析

为探究猕猴桃果实中bHLH转录因子的功能,本试验从青皮红香猕猴桃(Actinidia chinensis Qingpihongxiang)中克隆得到bHLH家族基因AcbHLH137,并对该基因的功能进行初步分析.结果表明,AcbHLH137(PSR95969.1)含有长度为969 bp的开放阅读框(ORF),共编码3...     

白藜芦醇合成酶(RS)基因转化胡萝卜及高白藜芦醇转基因胡萝卜株系的筛选

白藜芦醇是具有抗病及多种保健功能的芪类次生代谢物,胡萝卜(Daucus carota var.sativa)则是富含β胡萝卜素等多种营养成分的重要蔬菜。研究着眼于创建具有白藜芦醇保健功能的胡萝卜新种质资源,在对葡萄(Vitis vinifera L.)白藜芦醇合成酶(resveratrol synthase,RS)基因在胡萝卜中高效表达的密码子优化基础上构建无潮霉素磷酸转移酶(HPT)抗性基因的转化载体pCB-RS-hyg-,应用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将pCB和pCB-RS-hyg-共转化到胡萝卜并获得再生植株。经过T0、T1和T2代的逐代筛选,获得2个白藜芦醇含量较高(11.34和15.23mg/g)的转基因胡萝卜株系。     

枇杷EjNAC82的克隆及其对类胡萝卜素合成基因EjPSY、EjBCH的转录激活分析

为了探讨NAC转录因子对枇杷果实类胡萝卜素代谢的调控机制,以大红袍(红肉枇杷)和白沙(白肉枇杷)为试验材料,利用RNA-Seq技术对大红袍和白沙进行转录组测序,通过分析两个品种间的转录组差异,初步筛选并克隆出了1个枇杷NAC转录因子,命名为EjNAC82。生物信息学技术分析结果发现,EjNAC82具有NAC转录因子特有的结构域、理化性质和蛋白质结构特点,是典型的NAC转录因子家族基因。亚细胞定位试验发现该转录因子定位于细胞核。实时荧光定量PCR结果表明,EjNAC82在枇杷老叶中的表达量高于根、芽、嫩叶、老叶、嫩枝、老枝、幼果和熟果。EjNAC82在果皮和果肉成熟过程中的表达模式相同,均呈先上升后下降再上升的趋势。随着果实的成熟,EjNAC82在大红袍果肉中的表达显著高于白沙(P<0.05)。EjNAC82在大红袍果皮S1、S2、S4时期的表达显著高于白沙。LUC/REN双荧光素酶试验结果表明,EjNAC82对EjPSY1、EjPSY2和EjBCH启动子具有激活作用。这些结果表明EjNAC82可能通过调控EjPSY1、EjPSY2和EjBCH基因的表达从而正向调控枇杷果实中类胡萝卜素的合成。本研究结果为揭示NAC转录因子对枇杷果实类胡萝卜素积累的转录调控功能提供了理论依据。