细胞因子与猪瘟病毒E_2基因真核双表达载体的构建及其免疫增强作用

 构建了猪瘟病毒E2 基因与IL 2、IL 3基因的双表达真核表达载体 ,观察其表达水平 ,并对其免疫增强效果进行了观察。结果表明 ,构建了 2种猪瘟病毒E2 基因与白细胞介素 2、3的真核表达质粒pIRSTIL 2 ,pIRSTIL 3。将 2种质粒转染BHK 2 1细胞 ,均可在体外表达E2 抗原和有生物活性的IL 2、IL 3两种质粒能诱导产生CSFV的特异性免疫反应。pIRSTIL 2 ,pIRSTIL 3所诱导的免疫应答反应比使用单表达质粒 pIRST强。试验表明 ,细胞因子与目的基因构建的双表达基因疫苗能有效提高基因疫苗的免疫效果。     

慢性髓性白血病bcr-abl融合基因的克隆与表达

以慢性髓性白血病K562细胞总RNA为模板,采用RT PCR技术扩增包含bcr abl融合位点周围的基因片段,定向克隆到pGEX 6P 1载体谷光甘肽S转移酶(GST)的下游。将重组质粒转化大肠杆菌BL21菌株,以1.0mmol·L-1IPTG诱导bcr abl融合基因片段的表达,其产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,结果证实该融合蛋白分子质量约42ku。用该表达产物免疫ICR小鼠,所制备的抗血清可与K562细胞中特异性抗原反应,表明该bcr abl/GST融合蛋白具有bcr abl基因产物的特异抗原性。     

OsMAPK7基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以低温处理的耐盐水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板,用OsCDPK7基因特异引物通过RT-PCR扩增出1 700 bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该序列与GenBank上的OsCDPK7基因序列相比,缺失了CDS序列中157￣234处的78个核苷酸,其编码的蛋白序列缺失了53￣78的26个氨基酸。但是缺失部分位于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性中心和钙结合基序等结构域之外,因此预计该基因产物应具备钙依赖的蛋白激酶活性。进一步将OsCDPK7基因分别克隆至植物表达载体卡盒pBE12和pB29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的OsCDPK7基因植物表达载体pBC7E12和pBC729A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导法转化植物,分析OsCDPK7基因的功能奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒Nsp7基因真核表达载体的构建及表达

PEDV Nsp7蛋白是猪流行性腹泻病毒的一种非结构蛋白,它在病毒复制过程中表达,并与感染细胞的内质网和细胞膜相关,是病毒基因组翻译的两个大型复制酶的关键辅助因子。为了对PEDV Nsp7蛋白进行更加深入的研究,试验从病变猪小肠中提取总RNA,并通过RT-PCR扩增获取PEDVNsp7基因,最终将其连接到pCMV-Myc载体上。试验结果显示,成功构建了pCMV-Myc-Nsp7的重组质粒,并通过Western Blot技术和免疫荧光技术在真核细胞中验证了其蛋白表达情况,为后续研究PEDV Nsp7的生物学功能奠定了良好的基础。     

猪A组轮状病毒Vp7基因与双标记表达载体pW425et的重组及在大肠杆菌中的表达

以猪A组轮状病毒mRNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了981 bp的Vp7基因,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T载体中,构建出克隆质粒pGEM-T-Vp7。以SacⅠ和KpnⅠ双酶切pGEM-T-Vp7及双标记表达载体pW425et,并将纯化的Vp7基因亚克隆至双标记表达载体pW425et中,构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-Vp7。将pW425et-Vp7转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态Escherichia coliX13中,经生长功能弥补筛选阳性克隆和SDS-PAGE分析,可见约40 kD的融合蛋白。Western blot分析表明该蛋白具有与猪轮状病毒多克隆抗体的反应原性。     

番茄红素环化酶基因片段克隆及反义表达载体构建

根据已知的番茄红素环化酶基因,即13环化酶基因和s环化酶基因的保守序列设计特异性引物。提取番茄叶片的RNA,经RT—PCR反应,扩增出723bp和569bp的目的片段,将它们分别连接到pEASY—T1 Cloning Vector上,测序鉴定其正确性。克隆到载体上的13环化酶基因用BamHI和SmaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCb反义表达载体。同样连接到克隆载体上的s环化酶基因用BamHI和XbaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCe反义表达载体。     

植物基因工程疫苗高效表达载体的构建

分别将编码HIV-1的gag基因、gpl20基因及gag-gp120嵌合基因,FMDV的P1全长基因和猪白细胞介素18(ILl8)基因克隆到含CaMV35S启动子控制下的双元表达栽体pBIl21中,并通过冻融法导入农杆菌LBA4404,成功构建了能在植物中高效表达的5种植物表达载体：pBIl21gag,pBIl21gp,pBIl21gg,pBIl21P1,pBIl21IL18。     

保卫细胞中特异表达启动子片段缺失后表达载体的构建

iMyAP基因启动子的核心启动子370 bp片段能启动基因在保卫细胞中特异性表达。将其进行缺失,克隆得到370 bp、308bp和150 bp的启动子片段,与pMD18-T载体连接并进行序列分析后用BLAST软件作同源分析的结果显示,它们的核苷酸序列与GenBank中登陆的iMyAP启动子片段的核苷酸序列一致。将这3个启动子片段分别与pCAMBIA-1303质粒相连,构建得到表达载体。     

eGfp/Gus融合基因植物表达载体的构建和转化验证

绿色荧光蛋白(Gfp)基因和葡萄糖醛酸糖苷酶(Gus)基因是广泛应用的2个报告基因,在定性和定量研究基因表达和启动子功能等方面各有优劣。为联合使用这2个报告基因,根据报告基因序列设计2对带有特异限制性内切酶位点的引物,PCR法分别扩增增强型Gfp(eGfp)和Gus基因,连接到植物表达载体pFGC5941中,构建含CaMV35S启动子驱动的eGfp/Gus基因融合表达载体,命名为pFGC-DR。注射农杆菌法转化烟草叶片,以及花器官农杆菌浸泡法转化拟南芥,发现融合基因成功地在烟草叶片中瞬时表达和在拟南芥中稳定表达,表明融合报告基因在烟草和拟南芥中都能高效表达。     

纤维素酶基因（BGLI、CBHⅡ）与DREBIA基因双价植物表达载体的构建

本研究以pAHCl7、pCD29A质粒为基础，分别构建了玉米泛蛋白（Ubi）启动子调控的纤维素酶基因（BGLI、CBHII）与rd29A启动子调控的DREBlA基因的双价植物表达载体pBDB，pBDC。其植物选择标记基因为乙酰CoA转移酶基因（BAR），该载体适用于单子叶植物的遗传转化。并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中，为利用农杆菌介导法进行BGLI，CBHlI和DREBlA基因对单子叶植物的基因工程研究奠定了基础。     

羊痘病毒P32基因与羊CD58基因共表达载体的构建

为了开发出一种可行的羊痘基因疫苗,尝试用羊P32基因与CD58基因建立共表达载体.试验根据GenBank中收录的羊痘病毒(GPV)P32和羊CD58基因组序列,设计了扩增GPV P32基因和CD58基因的特异性引物,运用PCR技术从GPV中扩增出P32基因,从羊的外周血中扩增出CD58基因,并将其分别克隆到pMD18-T载体,测序正确.将P32基因去掉后端疏水区一段与CD58基因先后克隆至载体pBudCE4.1,并转化大肠埃希菌JM109,提取质粒通过酶切鉴定和测序正确,且读码框正确.说明成功获得了真核共表达质粒pBudCE4.1/CD58/P32.     

杀虫基因高效植物表达载体的构建

以质粒pCAMBIA1200、pBI121、pMMAR和pC1300MAR为基础,通过酶切连接,构建植物中间载体pC2MARHyg;再利用pAVAc质粒、载体pGA1611和中间载体pC2MARHyg,构建含有Ubi-1启动子、顺向重复MAR和杀虫基因AVAc的高效植物表达载体pC2MAR-AVAc,然后转化农杆菌EHA105,经筛选鉴定获得阳性克隆,为进一步开展植物抗虫基因工程研究奠定基础。     

狂犬病毒CVS株G基因和IFN-a基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过RT-PCR方法扩增得到狂犬病毒G基因,PCR方法得到IFN-Αa基因并亚克隆入pIRES获得pIRES-a质粒.双酶切G基因和pIRES-a质粒并回收目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.线性化后的重组腺病毒质粒转染人胚肾293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒.结果表明:该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达,说明成功构建了G和IFN-a双基因共表达重组腺病毒载体.     

禽流感病毒PA基因的原核表达载体的构建及鉴定

以重组质粒pcDNA-PA为模板扩增PA全基因,并构建原核表达载体pGEX-6p-1-PA。根据GenBank公开发表的禽流感病毒PA基因的序列设计引物,用PCR方法从重组质粒pcDNA-PA中扩增禽流感病毒的PA基因,将该基因定向插入到原核表达载体pGEX-6p-1中,然后将连接产物转化宿主菌DH5α,挑取阳性克隆进行PCR和BamHⅠ、NotⅠ双酶切鉴定并测序。测序结果表明,禽流感病毒PA基因全长2151 bp,编码717个氨基酸,原核表达载体pGEX-6p-1-PA已构建成功。从而为禽流感蛋白PA的表达及其多克隆抗体的制备奠定了基础。     

大麦核糖体失活蛋白基因与天花粉蛋白基因双价植物表达载体的构建

大麦核糖体失活蛋白(B-RIP)和天花粉蛋白(TCS)均具有广谱抗病毒作用,研究构建了分别由2×CaMV35S启动子调控的大麦核糖体失活基因(rip)和天花粉蛋白基因(tcs)双价植物表达载体pABTR,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ),适用于双子叶植物的遗传转化。并通过三亲本杂交法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为通过农杆菌介导法将双价基因导入植物,培育理想的抗病毒转基因植物奠定基础。     

狂犬病毒CVS株G基因和N基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过引入内部核糖体进入位点序列,构建狂犬病毒G基因和N基因共表达的腺病毒载体。通过RT-PCR方法扩增得到RVG基因、N基因。N基因先亚克隆入pIRES质粒;G基因经Kpn I和Mlu I,pIRES-N质粒经Mlu I、Not I双酶切,回收目的基因后与经Kpn I和Not I双酶切处理的腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒。线性化后的重组腺病毒质粒转染293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒,RT-PCR 法检测狂犬病毒糖蛋白和核蛋白基因片段。该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR 法可检测到糖蛋白和核蛋白基因片段。试验成功构建了G和N双基因共表达重组腺病毒载体,为狂犬病活载体疫苗的研制提供了依据。     

水疱性口炎病毒N基因原核表达载体的构建及表达

针对水疱性口炎病毒(VSV)N基因设计特异性引物,在引物中分别加入EcoR 和Xho 酶切位点。RT-PCR扩增后得到目的基因,将其克隆到表达载体pET30c,连接产物转化于DH5α菌株,在含Kan+的平板上37℃培养24h,然后挑取白色菌落,鉴定为阳性者,转化于BL21菌株,再经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导获得高效表达。表达融合蛋白分子质量为53ku(目的蛋白大约47ku),同预期蛋白大小相近。Westernblot检测表明,其能与本病毒阳性血清发生特异性反应,表达蛋白有望成为有价值的VSV诊断抗原。     

广西巴马小型猪ApoE基因真核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因（ApoE）真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列（NM_214308）对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。     

鸡Prnp基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

试验旨在构建鸡Prnp基因原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,为制备鸡朊蛋白单克隆抗体提供材料。根据GenBank已报道的鸡Prnp基因组序列和pET-28a质粒多克隆位点设计引物,以健康的鸡全血基因组DNA为材料,采用PCR的方法扩增鸡的Prnp基因,将目的基因片段与pET-28a载体连接,构建重组原核表达载体。重组菌转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达的重组蛋白。结果表明,重组蛋白在诱导剂的终浓度为0.08 mmol·L^-1,16 ℃,220 r·min^-1诱导7 h,蛋白表达量最高。综上所述,本研究成功构建了pET-28a-ChPrnp重组表达菌株,为Prnp朊蛋白的结构、生理功能和致病机制研究提供方法。