中国实验用小型猪MC3R基因的CRISPR/Cas9敲除载体构建与验证

黑素皮质素受体(melanocortin receptors,MCRs)属于G-蛋白偶联受体家族,在黑素皮质素(melanocortin)刺激下,通过c AMP启动胞内信号。MCRs各成员表达于不同类型细胞,生理作用迥异,其中MC3R在控制动物食欲和调节能量平衡中发挥重要作用,但作用机理不明。猪的采食与能量分配对猪生长速度、胴体瘦肉率等经济性状具有重要影响,对MC3R基因敲除的研究不仅可以用于明确MC3R的生理作用,还可以评估其在猪分子育种中的价值。本文采用新型基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统,基于中国实验用小型猪(chinese experimental mini pig,CEMP)MC3R基因序列信息,在其起始密码子的上游12 bp和终止密码子下游45 bp设计靶位点,构建4个p X330MC3R基因敲除载体,以CEMP成纤维细胞为材料,验证4个载体均实现高效特异性切割,为构建MC3R基因敲除猪奠定了基础。     

MC4R基因、SIM1基因在从江香猪不同组织中的mRNA表达规律研究

研究MC4R基因、SIM1基因在从江香猪不同组织中mRNA差异表达规律,探寻影响从江香猪能量代谢和脂肪沉积的数量性状基因座(QTL),为分子标记辅助选择提供依据。研究以从江香猪为试验材料,应用实时荧光定量PCR技术,检测MC4R基因、SIM1基因在从江香猪不同组织的mRNA相对表达量。结果显示,MC4R基因、SIM1基因在从江香猪各组织中均有表达,不同组织之间的相对表达量存在差异,MC4R基因相对表达量依次为:脾脏小肠脂肪肝脏肺胃心脏肾脏背肌,SIM1基因相对表达量依次为:脾脏肾脏脂肪肝脏小肠胃肺心脏背肌。     

新民猪RYR1和MC4R基因的多态性检测分析

为了调查兰尼定1型受体(RYR1)基因和黑素皮质素受体4(MC4R)基因[其目前公认的数量性状基因座(QTN)]在新组建的民猪群体内的分布情况,试验采用PCR-RFLP的方法,对黑龙江省农业科学院畜牧研究所收集整理的23头民猪的RYR1基因和MC4R基因进行检测,并与其他已报道的猪种进行比较。结果表明:RYR1基因的N等位基因频率为86.96%,n等位基因频率为13.04%;MC4R的A等位基因频率为76.19%,G等位基因频率为23.81%,与其他猪种相比,n等位基因频率偏高。     

野猪和家猪MC4R基因的分子扫描及两个变异位点的PCR-RFLP分析

黑素皮质素受体4是在人类肥胖研究中发现的重要调节因子,参与调节动物的体重、采食量和能量稳态。猪MC4R基因第7跨膜结构功能域的一个高度保守区内的错义突变(G→A)与脂肪性状相关显著。本研究对野猪、民猪、大白猪MC4R基因进行克隆测序,寻找新的多态位点;并对其中的HindⅢ和ClaⅠ位点的突变进行了酶切多态性分析,建立了基于限制性内切酶HindⅢ和ClaⅠ的MC4R基因型的PCR-RFLP分子检测方法。     

MC3R和MC4R基因多态性位点与犬体型性状的关系

为了探讨犬MC3R和MC4R基因多态性与体质量等体型性状的关系,本研究利用PCR-RFLP、AS-PCR方法对已培育的北方实验用犬MC3R基因A167T,MC4R基因T101N多态性位点与体质量、体长、身高、胸围等体型指标的关系进行分析.结果显示,这2个多态性位点的基因型与犬的体质量、胸围和体质量指数(BMI)等呈显著性相关.另外,方差分析显示MC3R和MC4R合并基因型对体质量、胸围和体质量指数影响显著,MC3R和MC4R基因对体型性状的影响有协同作用.结果表明,MC3R、MC4R基因可以作为犬体型性状的候选基因,可选不同MC3R和MC4R合并基因型的犬用于培育小型或大型实验用犬.     

哺乳动物黑素皮质素受体-4基因多态性研究进展

黑素皮质素受体-4(Melanocortinreceptor-4,MC4R)是下丘脑腹内侧核分泌的一类肽类物质,由中枢神经系统中的多个神经元群体表达,在哺乳动物体重以及能量平衡的调节中发挥重要作用。该基因可作为哺乳动物体重或生长性状的候选功能基因,且基因内存在多个与哺乳动物生长性状关联的单核苷酸多态性(SNPs)。文章对哺乳动物MC4R基因及其SNP对动物生长性状的影响进行简要综述,以期为MC4R基因SNPs的相关研究提供参考。     

犬MC4R基因单核苷酸多态性及其与体重的关系

人和几种动物的遗传学研究显示，MC4R基因在体重和能量平衡调控中具有重要作用，但未见有关犬的MC4R基因多态性、MC4R基因与性状关系的研究报道。以123只成年Beagle犬为试验材料提取血液DNA，利用软件设计PCR引物，经PCR扩增、克隆和测序后，发现了一个新的MC4R基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。该多态性恰好产生了限制性内切酶EcoO109Ⅰ的位点多态性。利用PCR-RFLP方法，分析了Beagle犬家系的MC4R基因，并利用SPSS软件分析该多态性与犬体重的关系。结果分析显示：MC4R该多态位点对犬的体重影响不显著。尚需进一步分析MC4R基因的其他片段。     

黑素皮质素受体4基因多态性及与肌内脂肪含量相关性研究

利用PCR-RFLP技术检测75头乌金猪和41头长白猪黑素皮质素受体4(MC4R)基因的第7跨膜结构功能域D298N主效位点的遗传变异,并用最小二乘法模型分析MC4R基因对猪肌内脂肪含量的遗传效应。结果:乌金猪和长白猪MC4R基因第7跨膜结构功能域TaqⅠ-RFLP位点均存在多态性,基因型为AA、Aa和aa。长白猪AA基因型肌内脂肪含量高于Aa和aa基因型,但差异不显著(P0.05);AA基因型对PCR-RFLP的最小二乘值最大,证明该基因在该位点对肌内脂肪(IMF)含量的效应值最大。乌金猪肌内脂肪含量aa基因型显著高于AA和Aa基因型(P0.05),aa基因型对PCR-RFLP的最小二乘值最大,证明该基因在该位点对IMF含量的效应值最大。提示,乌金猪和长白猪的MC4R基因对肌内脂肪的调控是由不同的基因型所控制的。乌金猪可通过提高MC4R基因aa基因型的频率来增加肌内脂肪含量,达到改善乌金猪猪肉品质的目的。     

陆川猪MC1R和KIT基因型鉴定

为了检测陆川猪种群的纯度,本研究以4个华南地方猪种（莆田黑猪、粤东黑猪、大花白猪、巴马香猪）和3个外来猪种（杜洛克猪、大白猪、长白猪）作为对照,利用PCR测序法对陆川猪群体56个样本的MC1R和KIT基因进行基因型鉴定。测序结果表明,大白猪和长白猪KIT基因内含子17的第1个碱基发生G>A剪接突变,而陆川猪和4个华南地方猪种,以及杜洛克猪中KIT基因型一样,均为野生型的GG基因型;MC1R基因编码区分析表明,以海南野猪MC1R基因型作为参考序列,陆川猪和4个华南地方猪种在MC1R基因编码区存在95Val > Met和102Leu > Pro两个错义突变;MC1R基因非编码区分析表明,与大白猪、长白猪和杜洛克猪相比,陆川猪和4个华南地方猪种MC1R基因的5'UTR分别存在5~6个SNPs,3'UTR存在1个A碱基的缺失。另外,试验对一窝毛色异常的陆川猪仔猪及其亲本的KIT和MC1R基因进行测序分析,结果表明,仔猪及其亲本的KIT基因型均为GG野生型,仔猪和母本的MC1R基因均存在E^D1和E^p两种不同的基因型,父本的MC1R基因型为E^D1,因E^p对应于皮特兰猪的斑块表型,所以初步判定母本渗入了外来猪种的血统。本研究通过检测陆川猪等8个猪种的毛色相关基因KIT和MC1R基因的基因型,证实了中外猪种间在毛色遗传上的分子差异,为今后深入研究猪毛色遗传的分子调控机理提供参考。     

比格犬MC3R和MC4R基因多态性与体重相关性的研究

犬体重是重要的经济性状,为探讨犬MC3R和MC4R基因多态性与犬体重性状的关系,本研究利用PCR-R FLP、AS-PCR方法对120只比格犬MC4R基因T101N位点,MC3R基因的A167T位点,G291A位点的不同基因型与体重的关系进行最小二乘分析、结果表明:对于MC4R基因NN基因型的比格犬体重显著高于其他2个基因型(P<0.05),而MC3R基因中TT和AA基因型的比格犬体重则显著高于其他2个基因型(P<0.05)。在MC4R基因型一致时,NNTT和NNAA基因型的犬体重显著高于其他合并基因型(P<0.01),NNTTAA合并基因型的犬体重最高,MMAAGG基因型犬体重最低。实验结果表明,MC3R和MC4R基因可以作为犬体型的候选基因,可筛选MC3R和MC4R合并基因型的犬用于培育不同体重的犬。     

MC4R基因主效位点在中外猪种中的遗传多样性及其与生长肥育性状的关联性分析

采用PCR-TaqI-RFLP技术,检测了9个中国地方猪种、3个外来猪种和1个培育猪种的612个个体及白色杜洛克×二花脸资源家系418头F2个体在MC4R基因D298N主效位点的遗传变异,统计分析了MC4R基因型与日增重、腹脂率及肩、胸、腰、臀部膘厚等生长肥育性状的关联性。结果表明:(1)G等位基因在中国地方猪种、长白和杜洛克中呈高频分布,而大白和南昌白猪具有高频率的A等位基因;(2)GG基因型个体的胸、腰、臀部膘厚较AA基因型和AG基因型个体厚,GG基因型个体的240日龄重、至240日龄平均日增重大于AA基因型个体,GG基因型个体的腹脂率高于AA基因型个体,差异显著。试验结果进一步验证了MC4R基因对猪生长肥育性状的影响效应。     

四环素诱导的猪黑素皮质激素受体-4基因真核表达载体的构建

猪黑素皮质激素受体-4(melanocortin-4 receptor,MC4R)基因是影响猪生长肥育的主效基因之一,为了进一步研究MC4R基因的生物学功能,制备高成活率转基因猪,通过采用条件性诱导表达载体系统,PCR方法扩增了猪MC4R基因完整编码区,四环素诱导表达系统(Tet-on)的启动子调控区与转录调节元件。采用双酶切和连接等方法将上述元件连接到pcDNA3.1(+)上,构建了重组质粒pcDNA3.1(+)-rtTA-P_Tight-MC4R。经双酶切和测序鉴定,结果显示片段正向连接且片段全长测序正确。试验成功构建了四环素诱导的pcDNA3.1(+)-rtTA-P_Tight-MC4R真核表达载体, 并能在时间特异性方面调控MC4R基因的表达。     

转猪MC4R基因小鼠模型的建立与检测

为了进一步探讨黑素皮质素4受体(melanocortin-4 receptor,MC4R)基因对动物采食量和生长性能的影响,本研究利用基因重组和显微注射的方法建立了转猪MC4R基因的小鼠模型。采用PCR扩增、克隆测序的方法对每代转基因小鼠进行阳性鉴定,然后采用常规测定方法对F3代转基因阳性鼠与同期阴性对照鼠的体重和采食量进行了测定。结果显示:成功构建了转猪MC4R基因小鼠模型,阳性鼠与阴性鼠相比,体重和采食量均略有增加,但未达到显著水平(P>0.05)。据此推测体内超表达MC4R基因并不能像敲除掉该基因一样显著地改变机体性能。     

陆川猪黑皮质激素受体4基因克隆及序列分析

试验旨在对陆川猪黑皮质激素受体4（melanocortin-4 receptor,MC4R）基因进行克隆及相关信息学分析。通过提取陆川猪背最长肌总RNA,采用RT-PCR、克隆等方法获得含目的基因MC4R的质粒pMD18-T-MC4R,经菌落PCR和测序鉴定正确后,应用相关生物信息学软件对陆川猪MC4R基因的理化性质、蛋白质的结构、修饰结构和亚细胞定位等进行预测分析。结果表明,MC4R基因CDS区长999 bp,编码332个氨基酸,与NCBI上公布的野猪MC4R基因序列中的CDS区存在4个碱基差异,其中175和906 bp处为同义突变,110和278 bp处为错义突变,分别引起第37位谷氨酸变为甘氨酸和第93位缬氨酸变为丙氨酸。同源性比对结果发现,MC4R基因在不同物种及进化的过程中具有较高的保守性。陆川猪MC4R蛋白有明显的疏水区域,不存在信号肽,但有7个跨膜结构域,其编码蛋白的二级结构元件有α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲。修饰结构预测表明,MC4R蛋白存在多处N糖基化位点,但无O糖基化位点,可能主要分布于内质网和囊泡。本研究成功克隆了陆川猪MC4R基因,为更好地开发利用地方品种陆川猪及其繁育奠定理论基础。     

MC4R基因多态性在海南地方猪中的分布

通过PCR—RFLP方法对90头海南五指山猪和36头临高猪进行了MC4R基因型检测。结果表明,MC4R基因中的TaqI酶切位点在五指山猪中均为AA基因型,在临高猪中该位点A等位基因和G等位基因频率分别是0．92和0．08。该结果为海南地方猪的杂交选育提供理论依据。     

中国主要地方品种猪的产仔数性状相关基因多态性的研究进展

本文选取产仔数性状基因作为研究对象,展示其在中国地方品种猪的分子育种现状,分析分子育种运用于临床实践的可能性和意义,为地方品种猪的保种、育种实践奠定基础。猪产仔数性状受多基因调控,遗传力偏低,分子育种手段可能加快该性状的育种进程。本文综述了与产仔数性状相关主效基因(雌激素受体、促卵泡素β、催乳素受体、视黄醇结合蛋白4、骨桥蛋白)的多态性及其与产仔数性状关联程度,分析其在中国主要地方品种猪中育种实践的进展情况,并对分子标记辅助育种技术的实践提出了建议。     

猪毛色基因黑色素受体1的基因型分析

为检测黑色素受体1(melanocortin receptor 1,MC1R)基因型在不同毛色猪种中的分布,研究该基因在猪毛色决定中的地位和作用,本试验使用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法对军牧1号白猪、杜洛克猪、西藏小型猪和大白猪的MC1R基因型进行了检测。结果显示,长白猪、大白猪存在nt894insCC和G1197A突变;杜洛克猪存在G668C、C1318T和G1554A突变;西藏小型猪存在C1318T和G1554A突变,而在nt894insCC位点则表现出其他基因型。通过对4个猪种的MC1R基因型的检测,为研究MC1R基因对毛色的作用机理奠定了基础。     

雷公山山区放牧山羊黑素皮质素受体-4mRNA表达的研究

为研究放牧山羊黑素皮质素受体-4(melanocortin-4receptor,MC4R)mRNA表达水平的组织差异和品种差异,试验以β-actin基因为内参,应用双标准曲线法实时荧光定量PCR技术检测放牧饲养的黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊和南江黄羊的7个组织MC4R基因mRNA的表达水平。结果表明,5个放牧山羊品种7种组织中均有MC4R mRNA表达,其水平以皮下脂肪和肾脏最高,肝脏其次,肺脏和心脏第三,半膜肌和背最长肌最低。肝脏MC4R mRNA的表达水平无品种差异,皮下脂肪、肾脏、肺脏、心脏、半膜肌和背最长肌MC4R mRNA的表达水平都以贵州白山羊最高。结果提示,放牧山羊MC4R mRNA的表达水平存在组织差异。除肝脏以外,其余组织MC4R mRNA的表达水平存在品种差异。本研究为开展放牧山羊的生长、胴体、肉质等性状的分子标记辅助选择育种奠定了基础。     

陆川猪黑皮质激素受体4基因克隆及序列分析

试验旨在对陆川猪黑皮质激素受体4(melanocortin-4receptor,MC4R)基因进行克隆及相关信息学分析。通过提取陆川猪背最长肌总RNA,采用RT-PCR、克隆等方法获得含目的基因MC4R的质粒pMD18-T-MC4R,经菌落PCR和测序鉴定正确后,应用相关生物信息学软件对陆川猪MC4R基因的理化性质、蛋白质的结构、修饰结构和亚细胞定位等进行预测分析。结果表明,MC4R基因CDS区长999bp,编码332个氨基酸,与NCBI上公布的野猪MC4R基因序列中的CDS区存在4个碱基差异,其中175和906bp处为同义突变,110和278bp处为错义突变,分别引起第37位谷氨酸变为甘氨酸和第93位缬氨酸变为丙氨酸。同源性比对结果发现,MC4R基因在不同物种及进化的过程中具有较高的保守性。陆川猪MC4R蛋白有明显的疏水区域,不存在信号肽,但有7个跨膜结构域,其编码蛋白的二级结构元件有α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲。修饰结构预测表明,MC4R蛋白存在多处N糖基化位点,但无O糖基化位点,可能主要分布于内质网和囊泡。本研究成功克隆了陆川猪MC4R基因,为更好地开发利用地方品种陆川猪及其繁育奠定理论基础。     

MC4R基因在5个猪群体内的多态性分析

试验检测猪黑素皮质激素受体4基因（melanocortin-4 receptor, MC4R）在杜洛克猪、长白猪、大白猪、申农猪和梅山猪群体内的基因型频率、等位基因频率以及群体遗传学指标。结果表明：MC4R基因在杜洛克猪、长白猪、大白猪和申农猪群体内检测出AA基因型、GG基因型和AG基因型,在梅山猪群体内检测出GG基因型和AG基因型。在杜洛克猪和大白猪群体内AG基因型为优势基因型,A等位基因频率为优势等位基因;在长白猪、申农猪和梅山猪群体内GG基因型为优势基因型,G等位基因频率为优势等位基因。群体遗传学指标分析结果显示,MC4R基因在杜洛克猪和大白猪群体内PIC值在0.25～0.5之间,表现为中度多态;在长白猪、申农猪和梅山猪PIC值小于0.25,表现低度多态。