一株MDBK细胞的低血清悬浮驯化研究

研究选取一株背景清晰、纯净的MDBK贴壁细胞,通过直接驯化和逐级降低血清相结合的办法,获得了一株可以在低血清培养基中全悬浮培养的MDBK细胞。该细胞在含0.5%胎牛血清的培养基中悬浮培养48 h后的细胞密度稳定在5.0×10⁶/mL以上,培养72 h后细胞密度最高可达1.16×10⁷/mL,且细胞形态良好,活力在93%以上,具有良好的传代稳定性。应用筛选获得的悬浮培养MDBK细胞株分别接种伪狂犬病毒和传染性牛鼻气管炎病毒后,检测病毒敏感性。细胞在24 h均发生了皱缩,72 h大部分死亡。悬浮培养的MDBK细胞对传染性牛鼻气管炎病毒的滴度在24 h达到最大值107.6TCID50/mL,对伪狂犬病毒的滴度在48 h达到最大值107.6 TCID50/mL,说明虽然细胞的培养方式发生了改变,但并没有影响上述两种病毒在该细胞上的增殖特性。对MDBK细胞的全悬浮驯化研究可为相关病毒类疫苗规模化生产及工艺的升级改进提供细胞学基础资料。     

从小鼠类ES细胞分化群中分离培养一类衍生细胞及其培养特性

将小鼠囊胚在饲养层、无类LIF因子的培养基中培养出类ES细胞团,将该类ES细胞团传至第三代,暂停传代,继续培养,则4～5 d后该细胞团会向周围分化出一种圆而发亮的衍生细胞,该衍生细胞会不断地向周围生长,约20 d后该衍生细胞铺满培养皿底.将该衍生细胞传至铺有饲养层的培养瓶中继续传代至第七代,再将其传代至无饲养层的培养瓶中,约12 d后,其在无饲养层的培养瓶中长满瓶底.以后随着传代数的增加,该细胞长满瓶底所需时间越来越短,最后稳定在2～3 d.对传代至第30代的细胞进行生长曲线测定,并以不同的基础培养基、不同的血清浓度、不同的胰岛素浓度等条件培养该细胞,结果发现：该衍生细胞分别在DMEM高糖、DMEM低糖、DMEM-F12、PRMI1640等为基础的培养基中都能生长,但以DMEM-F12为最优.在血清浓度分别为10%、14%、18%的DMEM高糖培养基中培养显示：该细胞在高浓度血清的培养基中具有生长更好的趋势.在胰岛素浓度分别为0、0.25、0.5、1 μg/ml的DMEM高糖培养基中培养显示：该细胞在无胰岛素的培养基中无法正常生长,在0.5 μg/ml胰岛素浓度的培养基中生长最佳.     

表达抗鸡传染性法氏囊病病毒重组鸡源抗体CHO细胞的悬浮驯化

为将贴壁生长的表达抗鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)重组鸡源抗体的CHO细胞株驯化为在无血清培养基中悬浮生长、高产的工程细胞株,本研究利用流式细胞仪筛选得到高产贴壁细胞株;以快速降低血清法进行驯化,使其适应悬浮培养,经过摇瓶无血清培养扩增,持续监测葡萄糖消耗情况,最终检测抗IBDV抗体的表达量。结果显示,悬浮驯化培养的CHO细胞能够在无血清培养基中稳定生长,生产周期短,接种密度为4.8×10~5cells/m L,无血清单细胞悬浮培养120 h后最大活细胞密度可达6.0×10~6 cells/m L,相同体积下抗体表达量较贴壁生长的高3倍,平均每个细胞每24 h表达量达到15 pg~20 pg。以上结果表明,贴壁生长的CHO细胞经过悬浮适应,不仅可以在无血清培养条件下快速生长,而且细胞对葡萄糖的利用率高,抗体表达量高。本研究筛选获得的细胞株节省了工艺生产中原料成本,操作方便,减少污染,易于放大,为工业化大批量生产奠定了基础。     

无血清悬浮培养PK-15细胞及其对猪圆环病毒2型增殖的影响

【目的】 建立基于无血清悬浮培养PK-15细胞生产猪圆环病毒2型（PCV2）疫苗的工艺，提高PCV2疫苗生产效率，降低PCV2疫苗生产成本。【方法】 首先采用直接驯化法对贴壁生长的PK-15细胞进行无血清悬浮培养驯化，并在无血清悬浮培养体系下，采用连续传代的方法考察驯化成功的PK-15细胞的传代和生长稳定性。研究不同感染复数（MOI）（0.10、0.05、0.01和0.001）和不同PK-15细胞接种密度（CDI）（1.0×10⁶、3.0×10⁶、5.0×10⁶/mL）对PCV2增殖的影响，同时对感染病毒前后的细胞培养液中葡萄糖、氨基酸及代谢副产物乳酸和氨进行初步分析。【结果】 贴壁PK-15细胞经过30 d的直接驯化可以快速适应无血清悬浮培养，且驯化过程中细胞平均比生长速率由0.1 d^-1增加到0.6 d^-1；悬浮PK-15细胞可以至少连续稳定传15代，连续传代过程中平均比生长速率在0.6 d^-1附近波动，且细胞活率始终>90%；以1.0×10⁶/mL接种，第4天可达到峰值活细胞密度6.2×10⁶/mL，并可维持1 d，第4天前活率均>90%，此后快速下降；病毒增殖最佳工艺参数为：感染复数为0.05，细胞接种密度为1.0×10⁶/mL，最终收获时病毒滴度可达10^6.2TCID₅₀/mL；对细胞感染前后的代谢分析发现，病毒感染后细胞对葡萄糖和多数氨基酸代谢快于感染前，且感染组在感染后72 h附近出现葡萄糖和谷氨酰胺耗竭并伴随代谢副产物乳酸和氨快速积累，之后细胞改变代谢途径并利用乳酸。【结论】 30 d的直接驯化可以获得悬浮PK-15细胞株，PK-15细胞可用于PCV2增殖，结果可为大规模无血清悬浮培养PK-15细胞生产PCV2疫苗提供一定理论和实践基础。     

ST细胞全悬浮培养的驯化及其培养伪狂犬病毒的工艺研究

将Siat7e基因转染ST细胞,筛选,驯化得到一株可悬浮培养的ST细胞株,此株细胞能够稳定连续传代,适应无血清、高密度培养,最高密度可达6×10⁶/mL,从摇瓶放大至生物反应器,生长稳定;采用驯化的全悬浮ST细胞培养伪狂犬病毒,从接毒时细胞密度、接毒量、收获时间三个方面优化了伪狂犬病毒的培养参数,确定接毒时细胞密度为2.0×10⁶/mL~3.0×10⁶/mL,接毒量为0.1 MOI~1 MOI,收毒时间为接毒后24 h~36 h。经过50 L生物反应器3个批次的工艺验证,培养的病毒含量均不低于109.0TCID50/mL,说明驯化的ST全悬浮细胞适合伪狂犬病毒的培养。     

无血清悬浮培养BHK21细胞增殖伪狂犬病毒的参数研究

旨在筛选适合生物反应器悬浮培养BHK21细胞的无血清培养基,并利用该技术培养伪狂犬病毒。通过筛选市售的无血清培养基,以细胞形态、细胞活率和增殖倍数作为驯化指标,对BHK21细胞进行无血清驯化;对使用10 L和40 L生物反应器无血清悬浮培养BHK21细胞的参数进行研究;同时利用筛选的无血清培养基和悬浮细胞进行伪狂犬病毒增殖测试。结果表明,市售培养基Ⅰ符合筛选要求,其培养的细胞形态比较均一,结团少,细胞生长2 d的增殖倍数为3.5倍,细胞活率在95%以上;生物反应器悬浮培养BHK21细胞的最适参数为转速80 r/min、pH值7.2、DO 60%;利用该工艺技术培养伪狂犬病毒,当接种细胞密度为6×10⁶ cells/mL,接毒剂量为0.3%时,48 h收获的病毒液滴度可达10^9.5 TCID₅₀/mL。该试验实现了伪狂犬病毒的无血清悬浮生产,为其生产工艺的优化提供了可能。     

生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖伪狂犬病病毒工艺优化

旨在筛选伪狂犬病病毒（PRV）敏感的BHK-21细胞并分析其生长和病毒增殖特性,优化反应器中BHK-21悬浮细胞的培养和病毒增殖条件,建立生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖PRV工艺。本研究利用响应面和单因素优化法,以细胞生长动力学特性、TCID₅₀病毒滴度等参数为指标,优化1.2 L生物反应器中BHK-21悬浮细胞的最佳培养和增殖病毒条件,在5 L生物反应器中进一步批培养验证。结果显示,筛选获得PRV高敏感的BHK-21-02贴壁细胞和BHK-21-XF02悬浮细胞各1株,BHK-21-XF02悬浮细胞在含3%血清的SLM-BHK低血清培养基和SFM-BHK无血清培养基中均能实现良好的生长和病毒增殖。利用响应面法优化得到1.2 L反应器最佳培养条件为接种密度1.20×10⁶cells·mL^-1、搅拌转速120 r·min^-1、DO值40%,5 L反应器批培养72 h细胞密度可达（7.61±0.18）×10⁶ cells·mL^-1、细胞活率为（96.93±1.18）%。利用单因素法优化得到1.2 L反应器最佳病毒增殖条件为MOI 0.001、培养温度37℃、细胞密度2.0×10⁶cells·mL^-1、搅拌转速80 r·min^-1,5 L反应器批培养接毒后48 h病毒滴度达到最大值（7.13±0.11） lgTCID₅₀·mL^-1。本研究可为PRV疫苗相关研究和规模化生产提供参考。     

Marc-145细胞的无血清悬浮培养基开发

为开发适合Marc-145细胞生长的无血清悬浮培养基,试验将贴壁Marc-145细胞转入Celer-S001培养基中进行悬浮适应,通过混料试验和水解物筛选试验获得适应Marc-145细胞快速扩增的无血清悬浮培养基,对悬浮培养的Marc-145细胞进行猪繁殖与呼吸综合征病毒感染并检测病毒效含量,评价悬浮培养的Marc-145细胞的病毒扩增能力。结果表明：Marc-145细胞可以在Celer-S001培养基中悬浮培养,其比生长速率为(0.25±0.06)/d;适应Marc-145细胞快速扩增的最优无血清悬浮培养基由B3和B8培养基以0.54∶0.46比例混合,并添加2 g/L的水解物H3构成,Marc-145细胞的比生长速率为(0.51±0.03)/d,密度为3.73×10⁶ cells/mL;细胞接毒后的病毒含量最高可达(5.25±0.25)lgTCID₅₀/mL,表明细胞仍然保持着病毒扩增能力。说明试验成功开发了适合Marc-145细胞生长的无血清悬浮培养基,Marc-145细胞在该培养基中生长良好,具有病毒扩增能力。     

低血清培养PK-15细胞及其增殖猪圆环病毒2型的研究

依次采用含60、30、20、10mL/L血清浓度的低血清培养基驯化PK-15细胞,并给驯化好的细胞上接种猪圆环病毒2型(PCV-2),以确定PCV-2在该培养体系下的生长情况。结果用含60、30、20mL/L血清浓度的低血清培养基各进行3代次驯化,PK-15细胞能完全适应且生长状态良好;当血清浓度降至10mL/L时,传代1次细胞无法保持良好状态,细胞出现贴壁较差、生长停滞等现象。各血清浓度培养体系中细胞生长曲线测定结果显示,在细胞培养的0、24、48、72、96h各组细胞密度与常规培养的对照组差别不明显。因此用该低血清培养体系培养PK-15细胞时,血清最低添加量为20mL/L。用该体系培养的PK-15细胞接种PCV-2后,通过荧光抗体染色测定病毒滴度。结果显示,低血清培养的PCV-2病毒滴度为10~(6.5)TCID_(50)/mL,与常规条件培养的PCV-2对照(病毒滴度为10~(6.375 )TCID_(50)/mL)差别不明显,表明该体系可用于PCV-2的增殖。表明研究建立了PK-15细胞低血清培养PCV-2体系,为PCV-2的相关研究奠定了基础。     

动物细胞无血清培养技术研究进展

生物医药是21世纪的朝阳产业,动物细胞无血清培养技术在生物医药领域中发挥着重要作用。无血清培养技术包括无血清培养基的开发、适应细胞株的驯化以及细胞规模化培养技术等关键技术,以细胞生物反应器高密度培养技术作为基础的细胞无血清悬浮培养技术推动了生物制药的快速发展。     

猪毛色遗传的研究进展

本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。     

不同样本商品蜂蜜中硒含量的测定

用硝酸和高氯酸消化蜂蜜,使硒游离出来,在微酸性环境下,硒和2,3-二氨基萘(DAN)生成有较强荧光的物质,用环己烷萃取,在激发波长378nm,荧光波长518nm处测定其荧光强度。蜂蜜中硒含量范围:0.10～0.82μg/g。表明:蜂蜜应视为天然富硒营养品。     

乳酸杆菌益生作用机制的研究进展

乳酸杆菌作为益生菌广泛用于人和动物。本文综述了乳酸杆菌改善宿主健康的机制。乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢、细菌素,或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌;通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能,从而保护肠道。文章重点讨论了乳酸杆菌表面成分（表面蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖）与肠道受体（Ｃ型凝集素受体、Ｔｏｌｌ样受体和 Ｎｏｄ样受体）,阐述了他们结合后启动免疫调节信号,调控肠道免疫功能以发挥改善健康作用的机制。     

Comparison of four techniques of arthrocentesis of the lateral compartment of the femorotibial joint of the horse

Reasons for performing study: Clinical experiences indicate that centesis of the lateral compartment of the femorotibial joint is often unsuccessful. Objective: To determine the accuracy of 2 published and 2 unpublished techniques of centesis of the lateral compartment of the femorotibial joint. Hypothesis: It was hypothesised that a drug can be administered into the lateral compartment of the femorotibial joint via a diverticulum of this joint that surrounds the medial aspect of the long digital extensor tendon and that this technique is more accurate than described techniques of centesis of this compartment. Methods: Twenty‐four stifles of 12 horses were divided equally into 4 groups and a radiocontrast medium injected into the lateral compartment of the femorotibial joint of each group using a hypodermic needle inserted: 1) caudal to the lateral patellar ligament and proximal to the tibial plateau, 2) caudal to the long digital extensor tendon and proximal to the tibial plateau, 3) between the long digital extensor tendon and bone of the extensor groove of the tibia or 4) directly through the long digital extensor tendon until it contacted bone. Twelve veterinary students who had no experience using any of these techniques performed the injections. Accuracy of each technique was determined by examining radiographs obtained after injecting the contrast medium. Results: The most successful technique for arthrocentesis was by inserting a needle through the long digital extensor tendon. This approach was successful in all attempted cases, whilst other techniques had lower rates of success. Conclusions: The lateral compartment of the femorotibial joint can be accessed accurately by inserting a needle through the long digital extensor tendon as it lies within the extensor groove. Other techniques may not be as accurate for clinicians inexperienced in arthrocentesis of the lateral compartment of the femorotibial joint.     

商会自治的基石——商会自治规范研究

在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。     

鸡败血支原体垂直传播模式及其阻断方法

以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。     

Prevalence of diseases of the spinal cord of cats

A retrospective review of records of 205 cats with histologically confirmed disease of the spinal cord was performed to identify the prevalence of disease in this nonrandomly selected population of cats. Clinical records were reviewed, and age, duration of neurologic illness, and clinical and histopathologic findings in cats with spinal cord disease were abstracted. Disease processes were classified into 7 categories and 23 groups. The most common diseases affecting the spinal cord of cats were feline infectious peritonitis (FIP), lymphosarcoma (LSA), and neoplasia of the vertebral column secondarily affecting the spinal cord. Information on age, onset and duration of clinical signs, and lesion localization at the postmortem examination in cats belonging to the 7 categories of disease were analyzed to create a practical list of differential diagnoses. Cats were also subcategorized into 3 groups based on their age at death. FIP was the most common disease of cats younger than 2 years of age. LSA and vertebral column neoplasia were the most common diseases affecting cats between 2 and 8 years of age. Vertebral column neoplasia was the most common disease affecting cats older than 8 years of age. Results of this histopathologic study showed that FIP and LSA were the most common disease processes affecting the spinal cord of cats. However, at least 21 other groups of diseases and their relative prevalence were identified.     

高效液相色谱法测定鸡肉中土霉素残留量的不确定度评定

根据JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》建立了高效液相色谱法测定鸡肉中土霉素残留测量的不确定度评定方法,评定过程包括建立测量程序、分析不确定度来源、对不确定度分量进行量化。将不确定度归类为两大类。随机效应导致的不确定度可以通过一系列具有统计意义的重复观测值进行A类评定;系统效应导致的不确定度通过各测量器具、设备的说明书、校准证书提供的参数进行B类评定。本方法鸡肉中土霉素残留量的相对合成标准不确定度约为3.9%。     

几个柑橘品种实生苗的抗旱性评价研究

以5个金柑属品种、枳壳、软枝酸橘及广西土柠檬实生苗为材料,进行复水成活率、旱害指数、叶片相对含水量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、脯氨酸等生理指标及隶属函数的综合分析,为柑橘抗性砧木品种选育提供参考。结果表明：胁迫20d复水后的成活率融安滑皮金柑和长寿金柑最高,为100%,软枝酸橘最低,为88.9%;随着干旱胁迫加剧,各品种的旱害指数呈上升趋势,长寿金柑的旱害指数最低,为0.25,软枝酸橘的旱害指数最高,为0.61;从叶片相对含水量的结果来看,长寿金柑的变化幅度最小,软枝酸橘的变化幅度最大,在第18d时分别为61.19%和37.85%;3种保护酶之间相互协同作用减轻植株受害程度,其活性变化幅度与丙二醛和脯氨酸的含量变化相似。利用隶属函数法综合分析,得出各品种的抗旱性强弱依次为长寿金柑>枳壳>融安滑皮金柑>融安金柑>山金柑>广西土柠檬>金枣>软枝酸橘。     

两种绿头鸭肌肉营养成分分析及评价

本试验旨在研究两种绿头鸭（白羽绿头鸭和绿头鸭）肌肉营养组成和价值,为绿头鸭肉产品的开发利用提供基础数据和理论依据。选择白羽绿头鸭和绿头鸭60只（每个品种各30只,公母各半）,依照国家标准测定胸肌粗蛋白质、粗脂肪、胆固醇含量及氨基酸、脂肪酸、微量元素和维生素的组成和含量,并对胸肌进行氨基酸评价及脂肪酸营养价值评价。结果显示,白羽绿头鸭肌肉粗蛋白质含量显著低于绿头鸭（P<0.05）;两种绿头鸭肌肉中均检测到17种含量大于0.01%的氨基酸,其中白羽绿头鸭肌肉苏氨酸、组氨酸、丝氨酸和脯氨酸含量显著高于绿头鸭（P<0.05）,赖氨酸、谷氨酸和精氨酸含量显著低于绿头鸭（P<0.05）;检测到13种含量均大于0.01%的脂肪酸,其中白羽绿头鸭硬脂酸和油酸含量显著低于绿头鸭（P<0.05）;检测到9种矿物质元素（钠、镁、钾、钙、锰、铁、铜、锌和硒）,两种绿头鸭差异不显著（P>0.05）;检测到8种维生素,白羽绿头鸭肌肉维生素B₁含量显著高于绿头鸭（P<0.05）,维生素D和维生素E含量显著低于绿头鸭（P<0.05）。两种绿头鸭肌肉氨基酸比例接近世卫组织推荐的理想模式,富含人体所需的矿物质元素和维生素,具有广阔的开发利用前景。