乳酸克鲁维斯酵母乳糖酶基因的克隆及原核表达

从乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)菌株k 538中克隆获得乳糖酶基因klac,并将其插入到表达栽体pET -30 a(+)上构建重组表达质粒pETlac 4.将pETlac 4电击转化到大肠杆菌BL 21中,分别研究了阳性转化子在28℃,37℃下经IPTG诱导3 h后的蛋白表达情况.表达产物的SDS-PAGE分析和酶活性测定表明,klac基因在大肠杆菌中获得活性表达,其中低温条件28℃下的表达水平明显高于37℃,28℃诱导的细胞经超声波破碎所测酶活力为0.475 U/mL,37℃仅为0.134 U/mL.     

卡拉库尔羊TNF-α基因原核表达载体的构建及表达条件优化

利用反转录PCR (RT-PCR)技术扩增卡拉库尔羊肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因,连接到pET-28b载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同的IPTG浓度、时间、温度条件下诱导TNF-α的表达.结果表明,原核表达栽体pET-28b-TNF-α构建成功,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,优化的诱导表达条件为诱导温度37℃、诱导时间4h、IPTG浓度1.0 mmol/L.     

拟南芥AtCOR15a抗寒基因原核表达载体的构建及蛋白表达

[目的]通过RT-PCR获得拟南芥AtCOR15a基因的ORF全长,经酶切、连接,以pET-28a(+)为原核表达载体.构建成pET28a-COR15a的重组表达载体,研究该基因在大肠杆菌中的表达情况,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]根据拟南芥AtCOR15a基因序列设计特异引物,利用RT-PCR的方法扩增目的基因,构建原核表达载体pET28a-COR15a,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,验证其蛋白表达量,并对其体系进行优化.[结果]AtCOR15a在大肠杆菌中成功表达,在37℃条件下诱导表达量最大,而30和16℃条件下蛋白表达量降低,IPTG浓度0.2～1.0 mmol/L对蛋白的表达量影响不大,并没有明显差异.但通过在不同诱导时间取样分析,结果发现加入IPTG后诱导5 h蛋白表达量最大,而8 h后逐渐降低.[结论]构建的原核表达载体在大肠杆菌中能高效表达,AtCOR15a融合蛋白分子量大约为19 kD,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

解淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶基因的克隆与表达

为了获得高效的中性蛋白酶基因,试验用PCR方法从解淀粉芽孢杆菌中扩增中性蛋白酶基因(npr),通过Bam HⅠ、SalⅠ双酶切后,将该基因与表达载体PET-28a连接,同时转入到大肠杆菌BL21中表达,通过SDS-PAGE电泳技术对构建的工程菌的基因表达产物进行分析。获得特异npr基因序列含1 566 bp,编码522个氨基酸,含有完整的ORF,同源性达到100%。蛋白酶的分子量为57.4 k Da。IPTG能诱导中性蛋白酶基因在重组菌进行表达,通过改变IPTG诱导浓度、诱导温度及诱导时间等因素,得出在添加剂IPTG至终浓度为0.8 mmol·L-1,30℃诱导4 h为最佳诱导条件,获得最高酶活为450 U·m L-1。     

O型口蹄疫病毒VP0和VP1蛋白的可溶性表达与反应原性分析

为了高效可溶性表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP0、VP1结构蛋白,根据大肠杆菌密码子的偏爱性优化合成VP0和VP1基因片段,并将其克隆到p E-SUMO载体中,构建重组质粒SUMOVP0和SUMO-VP1,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,并优化诱导温度、时间和IPTG浓度等表达条件。结果显示,SUMO-VP0可溶性蛋白表达的最佳条件为:20℃条件下,0.1 mmol/L IPTG诱导表达8 h;SUMO-VP1可溶性蛋白表达的最佳条件为:37℃条件下,0.1 mmol/L IPTG诱导表达12 h。SDS-PAGE电泳和Western blot结果表明,表达的SUMOVP0、SUMO-VP1可溶性蛋白能够被抗FMDV的阳性血清识别,具有很好的反应原性。     

梁平柚葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达

基于GenBank公布的葡萄糖基转移酶(LGT)基因的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以梁平柚成年树幼叶总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增葡萄糖基转移酶基因,将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了该基因的融合表达载体pET28a-CmLGT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中.经1.0mmol/LIPTG诱导表达获得大小约为62Kd的目的融合蛋白.     

苏云金芽胞杆菌cry2Ac4基因在 大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)cry2Ac4基因;笔者以含有BtWB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板,利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因,进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接;成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109,从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4,再转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPFG诱导后,对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测;cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达.     

鸡新城疫病毒Lasota株HN蛋白主要抗原表位基因在大肠杆菌中的表达

用RT-PCR法从NDV Lasota疫苗株中扩增出HN基因,将其克隆到pGEM-T easy vector中,构建了重组质粒pT-HN.设计了1对引物,用PCR法扩增出HN蛋白主要抗原表位基因(442～1 734 bp共1 239 bp),将其连接到原核表达载体pET-28a( ),构建重组质粒pET-HN.用IPTG诱导使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.SDS-PAGE结果表明,NDV HN主要抗原表住基因在pET-HN中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子量为28 kD.同时,通过试验摸索并确定了表达HN蛋白主要抗原表位基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.4 mmol·L-1,诱导时间为4 h,温度为37℃.     

β-甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质

以能水解魔芋葡甘聚糖的野生筛选菌种枯草杆菌A33为材料，通过PCR技术从A33基因组中扩增β-甘露聚糖酶基因编码序列．经过克隆、测序及BLAST比对分析，证实该基因编码β-甘露聚糖酶，属于β-甘露聚糖酶家族中的一员，该基因已往册GenBank．将该基因克隆到原核表达载体pRSET—A中并转入大肠杆菌表达系统BL21（DE3）pLysS，经过诱导获得了此酶的高效表达．其表达量达到37．78U／mL。酶学特性分析表明其作用的最适pH为5．0．最适温度为60℃．     

CRP基因原核表达载体的构建和表达及其免疫原性检测

采用大肠杆菌表达体系来获得C-反应蛋白(CRP)融合蛋白。以pDNR-CRP质粒为模板,用PCR方法扩增获得全长的CRP基因,将其克隆入表达载体pET28 a( )中,再转化到宿主菌BL21(DE3)中,加入IPTG诱导表达,表达产物做SDS-PAGE电泳分析,最后做免疫原性检测。成功地构建了CRP基因原核表达载体pET28 a( )-CRP,经IPTG诱导SDS-PAGE电泳分析表明C-反应蛋白能在大肠杆菌中获得表达,但免疫原性检测初步结果为阴性。结果证明CRP能以融合蛋白的形式在宿主菌BL21(DE3)中得到大量表达,表达产物缺乏免疫原性,其机理还有待进一步试验探讨。     

来源于嗜热古细菌Pyrococcus furiosus乳糖酶基因的原核表达及酶学性质分析

以嗜热古细菌Pyrococcus furiosus的基因组DNA为模板,通过PCR克隆获得乳糖酶基因celB。将celB基因插入到表达载体pET．30a（＋）上构建原核重组表达质粒pET-celB,转化大肠杆菌B121,阳性转化子在28％下经IPTG诱导4h后进行SDS．PAGE电泳和酶活性测定,结果表明celB基因在大肠杆菌中获得高效表达,乳“糖酶基因celB表达的乳糖酶蛋白CELB分子质量约为58kDa。CELB是耐高温酶,其酶促反应最适温度为105％,在95％至110％之间热稳定性较好;pH5．0时该乳糖酶水解活力最高,在pH5．0～10．0之间,pH稳定性较好,该酶对金属离子依赖性不强。     

猪肠道乳糖酶的研究进展

乳糖是仔猪的主要能量来源,乳糖酶对乳糖的消化吸收起着至关重要的作用。乳糖酶缺乏导致乳糖不耐受,产生肠胃胀气、腹痛甚至腹泻等症状,严重影响着仔猪的成长。本文围绕猪乳糖酶的来源、乳糖酶缺乏与腹泻以及乳糖酶缺乏的治疗展开综述,旨在对仔猪的饲养提供一定的参考价值。     

阳离子交换树脂D151固定化乳糖酶研究

以吸附率最高的阳离子交换树脂D151为载体,戊二醛为交联剂,用吸附交联法对黑曲霉乳糖酶进行固定化研究,优化固定化条件,以期改善乳糖酶性质,使黑曲霉乳糖酶适于低乳糖乳的生产。结果表明:固定化酶的最适温度为60℃,比游离酶低10℃;最适pH较游离酶稍向碱性方向移动;固定化酶比游离酶热稳定性降低;固定化酶与游离酶的酸碱稳定性有较大差异。在最适温度条件下,固定化酶较游离酶而言,在牛奶天然pH条件下使用更为适宜。在pH 6.5、50℃条件下,游离酶的半衰期仅为9 d;而固定化酶在此条件下反复使用20 d,仍具有59%的残余活力。该研究为工业化利用固定化酶生产低乳糖乳提供了技术依据。     

壳聚糖凝胶固定化绿豆乳糖酶的研究

以壳聚糖凝胶颗粒为载体,采用共价键偶联法固定绿豆乳糖酶.研究结果表明,以体积分数为 0.6%的戊二醛在常温下处理壳聚糖凝胶颗粒40 min后固定绿豆乳糖酶,固定化的最佳条件为:给酶量1.025 mg/g(蛋白质质量浓度为2.0 mg/mL)、pH7.0、温度4 ℃下固定 8 h,固定化酶活力为105.33 U/g、活力回收30.1 %.     

高温乳糖酶产生菌株的诱变选育

以产高温乳糖酶的黑曲霉菌株(Aspergillusniger)D2-26作为出发菌株,经1次紫外线和3次γ射线诱变后,获得1株产高温乳糖酶的黑曲霉突变株UCo-3,其菌落形态较出发菌株略有差异,菌落呈圆形年轮状,菌落背面只在接种处有明显的皱褶。该突变株产生的高温乳糖酶活力达16 27U mL。     

7~35日龄羔羊胃肠胃蛋白酶、凝乳酶、乳糖酶活性与其mRNA相对表达量和胃肠发育的关系研究

先后选取56只初生体重为(3 360±338)g的小尾寒羊公羔,随机分为14组(每组n=4),从4日龄起分别饲喂牛奶粉代乳和鱼粉代乳(各28只),并在第21日龄将饲喂牛奶粉代乳和鱼粉代乳的羔羊各8只转喂开食料。分别在7,14,21,28,35日龄将各组扑杀,取皱胃和十二指肠组织,测定皱胃胃蛋白酶、凝乳酶和十二指肠乳糖酶活性以及相应mRNA相对表达量,以研究饲喂不同代乳及开食料条件下7~35日龄羔羊3种消化酶与其mRNA相对表达量和胃肠发育的关系。结果表明,新生羔羊皱胃组织中凝乳酶活性随日龄平均每天降1.3U/g(r2=0.92,P0.05);而胃蛋白酶活性与日龄相关性低;十二指肠组织中的乳糖酶活性随日龄平均每天降低0.044U/g(r2=0.75,P0.05)。羔羊胃肠组织中的胃蛋白酶、凝乳酶、乳糖酶活性与相应mRNA相对表达量间的相关性差,胃蛋白酶与凝乳酶mRNA表达量随日龄呈高-低-高波动,而乳糖酶变化不显著。饲喂鱼粉代乳时羔羊的胃蛋白酶、凝乳酶活性降低,皱胃7日龄时重量为(36.0±3.0)g,35日龄时为(38.3±5.4)g,生长停滞。21日龄羔羊改喂开食料时对于原先饲喂牛奶粉代乳羔羊的胃蛋白酶、凝乳酶、乳糖酶活性影响不显著,但胃肠增重和日增重减少,而原先饲喂牛奶粉代乳羔羊的凝乳酶、乳糖酶活性呈降低趋势,对胃肠增重和日增重影响则明显。由本试验得出结论,羔羊胃肠胃蛋白酶活性与日龄相关性低,而凝乳酶和乳糖酶活性随日龄降低;羔羊代乳的性质对羔羊后期的消化、生长都有一定的影响;羔羊鱼粉代乳的消化障碍可能主要是由于皱胃发育停滞而非小肠消化障碍。     

Ca2+ Fe2+ Mg2+ Zn2+ Na+ K+对哺乳仔猪乳糖酶活力的影响

乳糖和矿质元素是哺乳仔猪十分重要的营养素,对7日龄的哺乳仔猪乳糖酶研究结果表明:哺乳仔猪乳糖酶的酶活力常数是65.825μg(ONP)/mL.m in,矿质元素钠、铁和钙能促进乳糖酶的酶活力。     

乳糖转化试验及低乳糖奶初步研究

研究了不同作用条件下，乳糖酶对原料奶中乳糖的转化率，并对低乳糖奶的相关技术进行了初步研究。结果表明：37℃下，加酶量0.1%，水解4h，乳糖转化率达到了75．28％；而6℃下加酶量0．2％，水解20h左右，乳糖转化率达到了68．54％。     

低乳糖乳工艺的研究

乳糖酶在 3 -6℃下水解牛乳中乳糖 ,1 6h水解率达 5 5 % ,添加 0 .0 1 %质量分数的柠檬酸钾使水解时间缩短为 1 4h;工艺简便可行 ,适合规模化生产 .国产乳糖酶与进口乳糖酶水解效果相同 ,而生产成本显著降低 .     

应用融合标签技术提高乳糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

双歧杆菌来源的乳糖酶具有催化效率高,安全性好等优点,在乳糖水解和低聚半乳糖生产等领域中应用潜力巨大。以来源于动物双岐杆菌（Bifidobacterium animalis B106）的乳糖酶基因bg42-106m为对象,将4种标签蛋白基因cherry、cbd(cellulose-binding domains)、gst(glutathione S-transferase)、mbp(maltose-binding protein)分别与bg42-106m基因连接,然后以pPIC9为载体构建融合蛋白重组表达载体,并在毕赤酵母GS115中进行诱导表达。结果表明,当融合Cherry标签蛋白基因后,可显著提高bG42-106M在毕赤酵母中的蛋白分泌表达量,培养基中乳糖酶活力可达到7.42 U/mL。与未融合标签的野生型菌株相比,乳糖酶bG42-106M的分泌表达量提高了290%。而其他3种标签蛋白没有提高bG42-106M的分泌表达量。