两种鼠蛲虫线粒体cytb基因的种间及种内序列变异研究

首次研究了小鼠四翼无刺线虫和隐管状线虫在线粒体细胞色素b(cytb)基因部分序列的种间及种内变异.从甘肃兰州地区LY和LS两个实验动物中心的小鼠肠道内收集了41个蛲虫样品(LY1-20、LS1-21),PCR扩增其cytb基因部分序列,经测序和序列分析结果发现:四翼无刺线虫cytb有效序列为531bp,而隐管状线虫有效序列为567bp.用软件ClustalX1.83截取两种鼠蛲虫cytb基因长度共同的序列,比对后发现无种内差异,但种间差异高达31.51%.研究结果初步表明,cytb基因序列在鼠蛲虫种内较保守,但种间存在较高的变异率,可作为两种常见鼠蛲虫种间分子鉴定的遗传标记.     

湖南省鸡蛔虫线粒体nad4基因序列的测定及分析

为阐明鸡蛔虫湖南分离株线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位4(nad4)基因部分序列(pnad4)遗传变异情况,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增鸡蛔虫的pnad4,并对序列进行比对。结果表明:所获得的pnad4序列长度均为408 bp。由于鸡蛔虫pnad4序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为种间遗传变异研究的标记,从而为鸡蛔虫的分类鉴定及进一步的分子流行病学调查奠定基础。     

弓首蛔虫和狮弓蛔虫线粒体nad1基因部分序列多态性研究

[目的]对弓首属犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓属狮弓蛔虫线粒体DNA（mtDNA）中烟酰胺脱氢酶亚基Ⅰ（nad1）基因部分序列（pnad1）进行比较研究，分析它们之间的序列差异和种群遗传关系。[方法]先用同位素（γ^33P）标记上下游引物，通过PCR方法扩增出单个虫体线粒体pnad1片段，然后采用单链构象多态性（SSCP）分析技术对pnad1片段进行多态性研究，最后挑选出代表性样品进行测序，并利用基因分析软件DNAStar（版本5．01）对序列进行分析比较。[结果]犬弓首蛔虫种内pnad1基因序列差异为0．3％-1．9％，与猫弓首蛔虫、马来亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫的种间序列差异分别为11．0％～14．1％、10．7％～12．4％、12．6％～13．7％和17．5％～18．2％。猫弓首蛔虫种内pnad1基因序列差异为2．8％，与马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫的种间序列差异分别是12．0％～13．0％、15．1％和18．6％～21．2％。马来西亚弓首蛔虫种内pnad1基因序列差异为0～0．3％，与牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫的种间序列差异分别是12．4％～12．8％和18．6％～19．0％。[结论]犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫和马来西亚弓首蛔虫不同地方虫株的pnad1序列都有一定差异（0～2．8%）。但种间pnad1的序列差异（10．7％～21．2％）明显高于种内的序列差异，说明nad1基因可以作为弓首蛔虫和狮弓蛔虫分子分类及种群遗传关系研究的遗传标记。     

人蛔虫和猪蛔虫线粒体nad5基因的序列分析

以采自中国不同地方的人蛔虫与猪蛔虫为研究对象,PCR扩增其线粒体烟酰胺脱氢酶亚基Ⅴ基因(nad5)的部分序列(pnad5)并进行序列测定,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对。结果显示:所获得的pnad5序列长度一致,均为556 bp;人蛔虫和猪蛔虫的pnad5序列差异仅为0.0%~2.6%,本研究结果支持人蛔虫与猪蛔虫是同一个种的结论。     

前后盘吸虫梅花鹿源分离株的种类鉴定及遗传进化分析

旨在研究温州地区的梅花鹿源前后盘吸虫的种类和遗传进化,利用形态学和分子生物学方法,对虫体样本进行染色显微镜观察及pcox1和pnad1序列的PCR扩增和序列分析。形态学鉴定结果表明,前后盘吸虫梅花鹿源分离株在外部形态、大小以及内部组织器官与鹿前后盘吸虫(Paramphistomum cervi)相近。序列比较分析结果表明,3株前后盘吸虫梅花鹿源分离株样本的pcox1和pnad1序列完全一致,扩增产物长度分别为446和505bp,与GenBank中鹿前后盘吸虫(KT198987)同源性最高,分别为98.2%和97.7%。遗传进化分析表明,3株前后盘吸虫梅花鹿源分离株与鹿前后盘吸虫位于同一分支。表明,分离的虫株在形态学和遗传进化分析上均与鹿前后盘吸虫具有高度的一致性,提示获得的前后盘吸虫梅花鹿源分离株为鹿前后盘吸虫。     

赣南柑橘产区衰退病毒外壳蛋白基因初步分析

[目的]对江西赣南柑橘果园感染衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)样品的外壳蛋白(CP)基因进行克隆及序列遗传信息分析,为利用弱毒株交叉保护法预防该地区CTV的蔓延奠定基础.[方法]运用RT-PCR扩增样品的CP基因并测序,应用软件检测CP序列基因重组,分析碱基含量,再将所测序列与10个外国CTV分离株计算核苷酸遗传距离,比对序列同源性及构建系统发育树.[结果]214份柑橘样品中有78份感染了CTV,发病率为36.4％.78个样品中仅有一个存在基因重组现象;78个CTV分离株CP基因全长序列均为672 bp,无碱基缺失、插入等现象,CP基因平均GC含量为52.8％,AT(U)为47.2％;所有样品核苷酸遗传距离在0～0.072,与10个已知CTV分离株CP基因核苷酸遗传距离在0～0.106.78个样品的CP基因核苷酸及其推导氨基酸序列同源性分别为89.1％～100.0％和92.3％～100.0％,与10株已知CTV分离株的同源性分别为76.5％～98.9％和73.6％～99.5％.系统进化分析结果表明,78个分离样品与10株已知CTV分离株可聚为四大类群,第Ⅰ类群包含49个分离样品和7个症状不同的已知CTV分离株(6个强毒型和1个弱毒型);第Ⅱ类群包含21个样品,国外强毒株系Qaha和引发茎陷点、速衰症状的Mexico-ctv株系聚于此类群;第Ⅲ类群仅由采自瑞金的CRJ14组成;第Ⅳ类群包括一个国外强毒株系HA16-5和采自江口、宁都的样品.[结论]赣南柑橘产区CTV分离株的CP基因保守性较高,序列存在一定程度的变异;各分离株间亲缘性较高但关系复杂,大部分样品与强毒型和茎陷点型分离株相关.     

湖南地区Ⅰ型乙型脑炎病毒的分离鉴定及E基因序列分析

为探寻湖南汨罗地区猪场蚊子携带乙型脑炎病毒(JEV)的情况,对该地区3个猪场蚊子开展JEV的病原学调查研究。从该地区3个种猪场采集约3 900只蚊子,用RT–PCR方法扩增JEV NS5基因,结果从40份样品中检出17份样品呈阳性。将阳性样品研磨液接种BHK–21细胞分离病毒,经3次传代后获得了1株JEV,将新分离株命名为HNML1株。根据JEV的E基因序列设计1对引物,用RT–PCR方法扩增HNML1株的E基因,并进行序列测定和同源性分析,结果表明,该E基因的核苷酸序列与减毒活疫苗株SA14–14–2相应序列的同源性为86.9%;该E基因的氨基酸序列与减毒活疫苗株SA14–14–2相应序列的同源性为97.0%,二者存在15个氨基酸的差异(其中包括8个与关键毒力相关的氨基酸)。基因同源性分析结果表明,HNML1株为基因Ⅰ型JEV毒株。     

湖南地区I型乙型脑炎病毒的分离鉴定及E基因序列分析

为探寻湖南汨罗地区猪场蚊子携带乙型脑炎病毒(JEV)的情况,对该地区3个猪场蚊子开展JEV的病原学调查研究。从该地区3个种猪场采集约3 900只蚊子,用RT–PCR方法扩增JEV NS5基因,结果从40份样品中检出17份样品呈阳性。将阳性样品研磨液接种BHK–21细胞分离病毒,经3次传代后获得了1株JEV,将新分离株命名为HNML1株。根据JEV的E基因序列设计1对引物,用RT–PCR方法扩增HNML1株的E基因,并进行序列测定和同源性分析,结果表明,该E基因的核苷酸序列与减毒活疫苗株SA14–14–2相应序列的同源性为86.9%;该E基因的氨基酸序列与减毒活疫苗株SA14–14–2 相应序列的同源性为97.0%,二者存在15个氨基酸的差异(其中包括8个与关键毒力相关的氨基酸)。基因同源性分析结果表明,HNML1株为基因I型JEV毒株。     

马铃薯Y病毒广东分离物HC-Pro基因的克隆和序列分析

利用RT-PCR法对广东烟草样品的马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)辅助成分蛋白质(Helpercomponent proteinase,HC-Pro)基因进行了克隆,并对其进行了序列分析。测序结果表明广东PVY HC-Pro(命名为PVY-HC-GD)基因(用PVY-HC-GD表示)全长1 395 bp,编码465个氨基酸。与已报道的PVY HC-Pro基因核苷酸序列相比发现,PVY-HC-GD与PVY NTN株系(PVYNTN)(AB331517)的PVYHC-Pro基因核苷酸序列相似性最高,达99.6%。而氨基酸序列比较表明,PVY-HC-GD与PVY N株系(PVYN)(AM268435)的PVY HC-Pro氨基酸序列相似性最高,为99.1%。进一步将PVY-HC-GD的核苷酸和其编码的氨基酸序列与其他报道的同源基因比对构建了系统关系树,结果显示广东烟草样品中PVY-HC-GD与PVYNTN PVY HC-Pro亲缘关系最近。     

进境黄盖鲽鱼寄生的异尖科线虫rDNA-ITS序列的PCR扩增及分析

以俄罗斯进境的冻黄盖鲽鱼体内分离出的异尖科线虫为研究对象,采用寄生虫通用引物NC5和NC2 PCR扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)序列,并进行克隆,转化、测序和序列分析,对样品进行分子鉴定。结果表明,扩增的异尖科线虫样品的ITS序列片段大小为1 034 bp。包含部分的18S、28S及全部的ITS1(431 bp)、5.8S(157 bp)和ITS2(349 bp)序列,ITS1和ITS2序列与GenBank已登记的Hysterothylacium aduncum同源性均在99.5%以上,与其他科线虫的相似性较低。由ITS1和ITS2序列构建的系统进化树可知,从黄盖鲽鱼中分离到的线虫ITS1和ITS2均与H.aduncum处于同一分支。研究结果为异尖科线虫种属的确定及进一步分子生物学研究奠定基础。     

银鲳皮肤和肌肉组织的基因表达谱分析

采用目前国际上最为通用的cDNA文库构建方法,构建了银鲳皮肤和肌肉组织的cDNA文库,通过一定规模的序列测定,并借助生物信息学技术,分析了164个序列,得到了105个不同的基因(或表达序列标签),在105个不同的基因中,68.6%基因没有冗余,1倍、2倍、3倍和4倍冗余的分别占23.8%,3.8%, 2.8%和1%.皮肤和肌肉组织表达基因的组成中,除了21个没有同源序列的未知基因外,可初步归为代谢相关的酶(38个)、DNA有关的酶(7个)、结构蛋白(4个)、膜蛋白(13个)、线粒体蛋白(1个)、转录因子(9个)、信号传导相关的蛋白(10个)和未知蛋白(2个)等8大类,其中,转录因子、膜蛋白,和DNA有关的酶的基因冗余程度相对较高.这些研究结果,为积累银鲳遗传方面的基础信息,了解银鲳皮肤和肌肉组织的基因表达提供了较好的研究基础.     

银鲳皮肤和肌肉组织的基因表达谱分析

采用目前国际上最为通用的cDNA文库构建方法,构建了银鲳皮肤和肌肉组织的cDNA文库,通过一定规模的序列测定,并借助生物信息学技术,分析了164个序列,得到了105个不同的基因(或表达序列标签),在105个不同的基因中,68.6%基因没有冗余,1倍、2倍、3倍和4倍冗余的分别占23.8%,3.8%, 2.8%和1%.皮肤和肌肉组织表达基因的组成中,除了21个没有同源序列的未知基因外,可初步归为代谢相关的酶(38个)、DNA有关的酶(7个)、结构蛋白(4个)、膜蛋白(13个)、线粒体蛋白(1个)、转录因子(9个)、信号传导相关的蛋白(10个)和未知蛋白(2个)等8大类,其中,转录因子、膜蛋白,和DNA有关的酶的基因冗余程度相对较高.这些研究结果,为积累银鲳遗传方面的基础信息,了解银鲳皮肤和肌肉组织的基因表达提供了较好的研究基础.     

侵染昆明园林植物的4个HCRV分离株核壳体蛋白氨基酸序列分析

【目的】比较分析侵染昆明园林植物HCRV核壳体蛋白氨基酸序列,探究地理分布和寄主来源与病毒变异的相关性。【方法】2016年,在云南省昆明市园林景区采集疑似感染番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒样品,利用RT-PCR技术测定出葱莲(Zephyranthes candida)、文殊兰(Crinum asiaticum)、喜林芋(Philodendron schott)和酢浆草(Oxalis corniculata) 4份感染朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus,HCRV)的样品,通过克隆、测序获得4份样品的S RNA序列,利用ORF Finder获得核壳体蛋白(nucleocapsid protein,N)并进行序列分析。【结果】文殊兰、喜林芋和酢浆草是首次报道的HCRV新寄主;4个HCRV分离物的N蛋白与NCBI首次报道的HLS1-2 N蛋白(登录号:AFX74694)一致性达到99.34%;系统进化树分析显示:4个HCRV分离物与GenBank公布的同样来自云南的株系聚为1支。【结论】病毒的地理分布相关性强于寄主相关性。     

文昌鸡线粒体DNA控制区序列遗传多样性分析

运用PCR产物直接测序的方法对海南省文昌市90只文昌鸡样品的线粒体DNA控制区(mtDNA D-loop)第Ⅰ高变区序列进行了分析。用CLUSTAL X 1.81软件进行序列比较,其中38只个体共检测到27个核苷酸多态位点,全部为转换无颠换,序列突变率为5.29%。用DnaSP软件估计出序列存在16个单倍型,单倍型多样度(Hd)为0.935,核苷酸多样度(π)为0.01479,平均核苷酸差异数(k)为7.541。运用Mega4.0软件计算出不同个体间的遗传距离,并据此构建了NJ系统树。文昌鸡样品在NJ无根树上聚为4大分支。研究结果表明,文昌鸡群体内个体序列变异程度较大,遗传多样性丰富,揭示文昌鸡在遗传组成上具有4个母系来源。     

金钱鱼循环水养殖系统水体细菌的多样性

以实验室循环水养殖系统养殖金钱鱼1周和1个月后的2组养殖水体样品(分别为A、B)作为研究对象,滤膜抽滤富集水样中的细菌,提取细菌基因组DNA,采用Mi Seq高通量测序方法测序16S r DNA的PCR扩增产物,进行细菌多样性比较分析、物种组成分析及聚类分析。结果表明:从2个样品测序中获得15 259条有效序列,其中A样品为9 092条,B样品为6 167条;在97%相似度下将其聚类,共产生90个OTUs(operational taxonomic units);多样性指数分析表明,A样品细菌群落多样性明显大于B样品的;样本中的细菌种类包含8个门、16个纲、28个目、38个科、48个属,其中A样品以变形菌门(Proteobacteria)的海单胞菌属(Thalassospira)和弧菌属(Vibrio)占优势,相对丰度分别为14.51%和13.29%,B样品以拟杆菌门(Bacteroidetes)的Aureispira和Dyadobacter占优势,相对丰度分别为44.67%和17.63%。表明随着时间的推移,鱼体生长产生的可溶性代谢产物和溶解性有机物逐渐积累以及水体p H的变化,改变了细菌生长的微环境,出现了细菌种群演替和适应的现象。     

关中奶山羊线粒体Cyt b基因遗传多样性研究

测定了关中奶山羊品种10个个体的细胞色素b基因全序列(1 140bp),比较分析了群体中细胞色素b基因的碱基组成和序列间碱基的变异情况,结果表明:在该品种(群体)中细胞色素b基因序列中10个变异位点上观察到17次T-C间的碱基转换,除了有1次T-C间碱基转换发生在密码子第1位点以外,其余的16次碱基转换都发生在密码子第3位点,均为同义突变;观察到5种单倍型,单倍型多样度为0.756。并以绵羊为外群构建系统发生树(NJ树),结果显示:关中奶山羊有2个母系起源,其中支系A占90%(9/10),支系B占10%(1/10)。     

中国几省市猪萨佩罗病毒巢式RT-PCR检测与遗传进化分析

为了准确了解猪萨佩罗病毒(Porcine Sapelovirus,PSV)在中国流行情况及遗传进化规律,试验针对PSV 5'-NTR基因利用巢式RT-PCR方法对2015～2017年来自中国部分省市规模化猪场采集的368份样品进行检测,将阳性样品对VP1基因进行克隆、测序、构建进化树。巢式RT～PCR检测结果表明,368份样品中24份样品为阳性,总阳性率为6.52%;8份样品测序成功,序列分析结果表明核苷酸同源性为77.0%～99.7%,推导的氨基酸序列同源性为83.6%～100.0%,遗传进化分析结果显示,中国地区的PSV病毒呈现出遗传多样性,其中3个毒株与德国参考毒株亲缘关系较近,2个毒株与国内外参考毒株的亲缘关系均较远,变异较大。研究丰富了PSV分子流行病学资料,为进一步研究该病毒提供了参考。     

Illumina MiSeq高通量测序分析核桃内生细菌多样性

应用Illumina Mi Seq高通量测序技术测定核桃内生细菌的16S r DNA-V4变异区序列,使用Uparse等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元(OTUs)数量,分析内生细菌的丰度和α-多样性。获得了用于分析的有效序列63 183条,OTU数为103。稀释曲线表明测序深度充分,OTU数量接近于饱和。核桃样品的Chao1指数为105.143,Shannon多样性指数为1.823。核桃内生细菌主要分布于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas,27.27%)、盐单胞菌属(Halomonas,27.27%)、土壤杆菌属(Agrobacterium,45.45%),这3个属是核桃内生细菌优势菌属。     

鲤鱼白细胞介素10(IL-10)基因cDNA克隆及序列分析

[目的]获取鲤鱼全长IL-10(interleukin 10)cDNA,并对其序列进行分析。[方法]利用DD-RTPCR(differential display RT-PCR)方法获得差异表达IL-10 cDNA片段,以地高辛标记做为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IL-10全长cDNA,并对该序列进行序列分析和同源性比较。[结果]鲤鱼全长IL-10 cDNA共1 117 bp,包含55 bp的5'端非编码区,一个540 bp的编码179个氨基酸的开放阅读框及522 bp的3'端非编码区,其中,3'非编码区包含3个mRNA不稳定基序"ATTTA";该蛋白序列具有IL-10家族的典型序列特征;序列同源性比较表明,所获得的序列与GenBank上登录的鲤鱼IL-10基因同源性为89.1%。[结论]该试验为进一步研究IL-10在体内的表达方式、功能特点、调控机理及其在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。