Molecular characterization,vector identification and partial host range determination of phytoplasmas associated with faba bean phyllody in Iran

During surveys of phytoplasma diseases, faba bean phyllody (FBP) was observed in several locations in Fars and Bushehr provinces (southern Iran). Samples of affected plants from Borazjan (Bushehr province) and Fasa (Fars province) were used to transmit the phyllody agent to faba bean, mung bean, pea, alfalfa and periwinkle by grafting, dodder and/or vector insect. Orosius albicinctus (Distant) was identified as the vector of Borazjan (BFBP) and Fasa (FFBP) faba bean phyllody. Naturally affected faba bean plants and all inoculated plants were positive for phytoplasma by direct PCR using the P1/P7 primer pair and nested PCR using P1/P7 and R16F2n/R16R2 primer pairs. Sequencing of PCR products identified the associated phytoplasmas as members of 16SrII phytoplasma group. Phylogenetic analysis using full length 16S rRNA gene sequences also confirmed similarity of the BFBP and FFBP phytoplasmas to the 16SrII group phytoplasmas. In this analysis the FFBP phytoplasma was grouped with ’Candidatus Phytoplasma australasia’, representative of 16SrII-D subgroup, while the BFBP phytoplasma formed a discrete group close to the 16SrII-C subgroup. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) confirmed that BFBP and FFBP phytoplasmas belong to 16SrII group. Virtual RFLP confirmed that as members of peanut witches’ broom (16SrII) phytoplasma group, BFBP and FFBP phytoplasmas belonged to 16SrII-C and16SrII-D subgroups, respectively. Phytoplasmas associated with BFBP and FFBP were shown to be serologically related to the Fars alfalfa witches’broom phytoplasma, a member of 16SrII-C subgroup. It seems that witches’broom affected alfalfa fields are natural reservoirs of the FBP phytoplasma in southern Iran.     

花生丛枝病病原的血清学研究

本研究首次制备了花生丛枝病（ＰＷＢ）植原体的专化性鼠腹水抗体,效价为１：１２８０,比较了５种间接ＥＬＩＳＡ方法检测植原体的效果,并对６种植原体病原提纯物进行了血清学研究。结果表明,鼠腹水抗体除与ＰＷＢ有血清学反应外,还与豇豆从枝病原（ＣｏＷＢ）具有一定的血清学关系,而与ＴＷＢ、ＣｈＷＢ、ＳＷＢ和ＢＷＢ无血清关系。     

海南槟榔黄化病病原物的分子鉴定

槟榔黄化病是槟榔上的一种重要病害,如何快速检测该病原菌是防治该病的重要基础。利用植原体16SrDNA通用引物对海南感染黄化病的槟榔花苞总DNA进行巢式PCR扩增,获得约1.2kb的特异片段,并对扩增产物进行核苷酸序列测定。通过BLAST程序比较、系统进化树构建及iPhyClassifier分析表明,引起海南槟榔黄化病病原植原体属于翠菊黄化植原体组(16SrⅠ组),且为该组中一个新的亚组,即G亚组,现将其暂命名槟榔黄化植原体(Arecanut yellow leaf phytoplasma,AYL)。     

海南长春花变叶病病原物的分子鉴定

本研究分别利用植原体16S rDNA和核糖体蛋白(ribosomal protein,rp)基因的通用引物对自然表现变叶症状的海南长春花样品总DNA进行PCR扩增,获得16S rDNA基因片段长为1 432 bp,rp基因片段长为1 211 bp。BLAST程序比较、系统进化树构建及iPhyClassifier分析表明:海南长春花变叶病是由植原体引起的,该植原体株系属于16S rⅠ-B亚组,与候选种Ca.Phytoplasma asteris相关,将其暂命名为长春花变叶病植原体海南株系(Periwinkle phyllody strain Hainan,PP-Hn)。     

野茼蒿变叶病病原物的分子鉴定

利用植原体16S rDNA通用引物R16mF2/R16mR1对海南表现变叶症状的野茼蒿样品总DNA进行PCR扩增,获得约1.4 kb的特异片段,并对扩增产物进行核苷酸序列测定。通过BLAST程序比较、系统进化树构建及iPhy Classifier分析表明,海南发生的野茼蒿变叶植原体在分类上属于花生丛枝植原体组中的A亚组,即16Sr II-A亚组。这是我国首次在野茼蒿上发现植原体病害。     

海南50个甘蔗品种黄叶病毒的分子鉴定

为明确国家甘蔗体系集成示范及区试甘蔗品种在海南省被甘蔗黄叶病毒(SCYLV)侵染情况及病毒基因型类型,从集成示范及区试的50个甘蔗品种上采集带有显著病症或不显病症样品50份,采用特异引物通过RT-PCR方法进行甘蔗黄叶病毒检测和病毒基因型鉴定。结果表明:50个甘蔗品种中有31个被检测到SCYLV,检出率为62%;病毒基因型有古巴(CUP)基因型、巴西-秘鲁(BAR-PER)基因型和留尼汪岛(REU)基因型3种,主要以CUP基因型为主,占58.06%,其次是BAR-PER基因型,占51.61%,REU基因型最少,占29.03%;未发现CHN1、CHN2、CHN3基因型。另外,不同基因型混合侵染现象普遍存在,总混合侵染率达32.26%。可见,海南国家甘蔗体系集成示范及区试甘蔗品种严重感染甘蔗黄叶病毒(SCYLV),且存在不同基因型混合侵染,建议推广种植脱毒种苗来控制甘蔗黄叶病的发生。本研究为在海南蔗区推广和种植甘蔗脱毒种苗及抗病育种提供了理论支持。      

海南蔗区甘蔗黄叶病与花叶病发生情况的分子鉴定

于2010年甘蔗生长季节,对海南甘蔗产区8个县(市)24个乡镇进行甘蔗病毒病的调查和检测,初步明确海南蔗区甘蔗病毒病种类主要有2种,即由甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)引起的甘蔗黄叶病和由高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)引起的甘蔗花叶病。其中甘蔗黄叶病最为普遍,检出率达到75%,可能是影响海南蔗区甘蔗产量的重要因素之一,而由高粱花叶病毒引起的甘蔗花叶病次之。同时针对甘蔗病毒病提出推广甘蔗脱毒健康种苗是其防治的主要措施,对指导海南蔗区乃至全国甘蔗生产具有重要的意义。     

海南香蕉褐缘灰斑病原菌的核酸分析鉴定

采用种的特异性引物,通过聚合酶链式反应(PCR)方法,对11个海南香蕉褐缘灰斑病菌菌株进行了鉴定。结果表明,11个菌株中,来自海南儋州、乐东、文昌、东方、澄迈、临高、琼海、昌江、琼山、三亚的10个菌株为Mycosphaerella fijiensis,而白沙菌株既不是M.fijiensis,也不是M.musicola,其Mycosphaerella种的分类地位有待进一步研究。采用随机扩增多态DNA(RAPD)分析,将这些菌株区别为2类,支持PCR鉴定结果。本研究的鉴定结果对指导海南综合治理香蕉褐缘灰斑病的的实践有参考作用。     

Species of Cercospora associated with grey leaf spot of maize

Grey leaf spot is a serious yield-reducing disease of maize (Zea mays) in many parts of the world where this crop is cultivated. The causal organism associated with the disease is Cercospora zeae-maydis. Two potential sibling species have been recognized as Groups I and II. The DNA sequences for the internal transcribed spacers (ITS1 & ITS2), the 5.8S rRNA gene, elongation factor 1-α, histone H3, actin and calmodulin gene regions suggest that Groups I and II are two distinct species. Furthermore, Cercospora zeae-maydis (Group I) can be distinguished from C. zeina sp. nov. (Group II) by its faster growth rate on artificial media, the ability to produce cercosporin, longer conidiophores, and broadly fusiform conidia. A PCR-based test that distinguishes the two species was developed using species-specific primers designed from the histone H3 gene.Taxonomic novelties: Cercospora zeina Crous & U. Braun sp. nov.     

Rice spikelet rot disease in China - 1. Characterization of fungi associated with the disease

Rice spikelet rot disease (SRD) is an emerging disease of rice panicle in China, which affects both rice yield and grain quality. Four fungal pathogens were isolated from diseased rice grains. Morphological observation, biological testing and molecular characterization led to identify these fungi as Fusarium proliferatum, Bipolaris australiensis, Curvularia lunata and Alternaria tenuis. The four fungi can grow from 10 °C to 40 °C, and from pH 5 to pH 10. The most suitable temperature range is 25 °C-30 °C, however the optimal pH for sporulation of these fungi varies greatly. The four fungi can grow on media supplemented with different carbon and nitrogen sources. These differences in carbon and nitrogen requirements suggest differences in trophism, and have large effects on hyphal growth and spore production. The results suggest that rice SRD is caused by various fungi with diverse physiological characteristics.     

花生晚斑病抗性AFLP标记

以抗感晚斑病组合“中花5号×ICGV 86699”的F2分离群体为材料，经田间抗性鉴定明确抗性亲本ICGV 86699的抗性受隐性单基因或主效基因控制；AFLP分析结合BSA法筛选到与晚斑病抗性连锁较紧密的AFLP标记3个，即E35/M51、E37/M48和E41/M47，它们与抗性间的图距分别为7.40cM、7.40cM和8.67cM；所获得的3个标记间连锁紧密，位于同一连锁群上。这3个标记在具有野生种亲缘的7个抗病花生品种或材料中均能检测到，而在栽培种以多粒型为代表的抗病材料中均未检测到，表明ICGV 86699的抗性基因与栽培种花生中的抗性基因不同。这是国内外有关花生晚斑病抗性分子标记的首例报道。     

新疆甜菜根腐病病原种群鉴定

从新疆各主要甜菜产区采集669个甜菜根腐病样,共分离出735个分离物,其中真菌分离物715个,细菌分离物20个,说明真菌是主要的病原种群。真菌中镰刀菌501个,占分离物总数的68.2%;丝核菌113个,占15.4%;腐霉菌81个,占分离物总数11.0%。经鉴定,有6种镰刀菌,即尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、串珠镰刀菌(F.moniliforme)、茄病镰刀菌(F.solani)、木贼镰刀菌(F.equiseti)、砖红镰刀菌(F.lateritium)、禾谷镰刀菌(F.graminearum);3种腐霉菌,即瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、简囊腐霉(P.monospermum)和P.spp;丝核菌主要为立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani),AG-2和AG-4融合群,分别占丝核菌总数的50.4%和35.4%。用上述代表菌进行致病性测定,均可引起甜菜根部腐烂、维管束变色等典型根腐症状。     

国内新发危险性橡胶树拟盘多毛孢叶斑病鉴定及其病原学研究

基于目前橡胶树拟盘多毛孢叶斑病在境外主要植胶国爆发流行的态势,以及对天然橡胶产业经济带来的巨大影响。笔者前期对我国海南、云南、广东等省橡胶主产区的13个农场和胶园进行了病害踏查,在我国海南省乐东县志仲镇乐东保显农场发现了疑似橡胶树拟盘多毛孢叶斑病病样。本研究将该疑似病样病原菌进行分离、纯化和致病力测定,并通过形态学和分子系统学分析,确定该病原菌为新拟盘多毛孢属（Neopestalotiopsis）的Neopestalotiopsis aotearoa Maharachch., K.D. Hyde & Crous;基础生物学特性分析表明,该病原菌菌丝生长和孢子萌发的适宜温度为28℃,孢子致死温度为50℃;适宜pH为6.5,最适碳源为蔗糖和D-葡萄糖,最适氮源为硝酸钾和大豆蛋白胨;最适培养基为PDA,培养8 d后产孢。初步明确了该病的病原及其基础生物学特性,为提前储备防治该病的相关技术措施提供理论依据。     

中粒种咖啡新发砖红镰刀叶枯病病原菌鉴定及其病原生物学分析

针对引起海南省白沙农场中粒种咖啡成株叶片呈砖红色枯萎症状的一种未知病害的病原菌进行分离，分离得到菌株21BS02-1和21BS02-2。将分离菌株接种到叶片并观察症状，发现菌株21BS02-1的发病症状与田间症状一致，通过再分离获得的菌株发病症状也与初始病原菌症状一致，由此确定菌株21BS02-1即为致病菌。菌株21BS02-1的菌落主要呈白色，毡状，菌丝致密，菌落中央呈玫瑰色；其菌丝体细长，部分菌丝为有隔菌丝；大型分生孢子两端稍弯曲，形状似镰刀，其大小为(56.26~175.76)μm × (12.93~19.78)μm，有3~7个分隔；小型分生孢子较少，呈椭圆形，0~1个分隔；根据形态特征初步鉴定该病原菌为镰刀菌（Fusarium sp.）。进一步对菌株21BS02-1的ITS、β-tubulin、TEF基因序列进行克隆测序，经Blast搜索表明，其ITS、β-tubulin、TEF序列与Fusarium lateritium的同源性分别达到99.56%（MN686293）、100%（KJ00154）、99.68%（KF918550）。3个单基因聚类树均一致，表明菌株21BS02-1属于砖红镰刀菌（F. lateritium）。生物学特性测定表明，致病菌21BS02-1最适合的培养基为OMA和CMA培养基；碳源为蔗糖时的利用率最高；牛肉浸膏为致病菌最适生长的氮源；12 h光暗交替条件下菌丝生长最快；pH在7~9范围内最适合该致病菌生长。本研究是砖红镰刀菌（F. lateritium）侵染中粒种咖啡较为详细的报道。     

一个水稻低温移栽白条纹突变体wltt的鉴定和基因定位

【目的】叶色突变相关基因的鉴定与克隆为研究叶绿体发育、叶绿素合成和光合作用等分子机制提供理论基础。【方法】从常规粳稻镇糯19杂交后代中分离出一个低温移栽后叶色转成白条纹的自然变异突变体,命名为wltt (white stripe leaf after transplanting at low temperature)。成熟期测定野生型和wltt的主要农艺性状,分别在苗期、移栽后15 d和同时期直播条件下测定新生叶片的色素含量并观察叶绿体的超微结构;将wltt和野生型正反交进行遗传分析;用wltt与籼稻9311杂交产生的F_2作为定位群体进行基因定位;采用RT-qPCR分析叶绿体发育、叶绿素合成和光合作用相关基因在野生型和wltt中的表达水平。【结果】wltt突变体在苗期表现正常绿色,移栽15 d后心叶出现白条纹叶表型,至分蘖末期心叶叶色恢复;而不经移栽,突变体不会出现白条纹叶。人工模拟实验表明该表型是由低温条件下根损伤引起的。与野生型相比,wltt突变体移栽后的新生叶色素含量显著降低,光合速率下降;同时株高变矮,穗长、剑叶长和每穗粒数均显著降低。叶绿体的超微结构显示,突变体的叶肉细胞中,仅少数细胞含有正常的叶绿体,其余大部分叶肉细胞不含叶绿体。进一步研究发现,突变体中部分光合系统相关基因和叶绿体发育相关基因表达下调,叶绿素生物合成相关的14个基因表达也下调。遗传分析表明,该突变性状受一对隐性核基因控制。利用wltt突变体/9311的F_2群体,将该基因定位于水稻第2染色体着丝粒附近853kb区间内。目前,该区间内没有叶色相关基因的报道。【结论】WLTT是低温条件下移栽调控叶片转色的关键基因,在叶绿体发育过程中发挥重要作用。     

16S rRNA在兽医病原菌分类鉴定中的应用

介绍16S rRNA基因的特点，阐述其用于病原菌分类鉴定的基本原理，综述其在兽医病原菌分类鉴定中的应用。     

烟草叶斑病病原菌Epicoccum latusicollum的鉴定、生物学特性及室内药剂筛选

叶斑类病害是危害大田期烟草的主要病害之一，大多由真菌侵染所致，病害易暴发流行，对烟草的品质及产量造成重大影响。本研究采用组织分离法从广西‘K326’烟叶具有典型病斑的叶片上分离、纯化获得菌株，通过致病性测定结合形态学特征以及分子生物学手段对病原菌进行鉴定，同时采用菌丝生长速率法测定不同培养基、温度、pH、碳源、氮源、光照，致死温度处理以及10种常用化学药剂对病原菌菌丝生长的影响。该叶斑病的典型病症为：初期烟叶产生灰白色小圆斑，病害加重圆斑逐渐扩散成不规则状，病斑中心形成穿孔，颜色为灰白色，边缘棕褐色，伴随褪绿的黄色晕圈。通过分离纯化获得2个菌株，分别命名为HZFC36和HZZS76。致病性测定结果表明，2个菌株均可在叶片无伤条件下导致健康‘K326’烟叶部产生病斑。结合形态学特征和多基因位点（LSU、ITS、RPB2和TUB2）系统发育进化分析将引起广西烟草叶斑病的病原菌鉴定为Epicoccum latusicollum。该病原菌在CMA培养基上生长最快，最适生长温度为28℃，最适pH为6，最佳碳源、氮源为蔗糖和牛肉浸粉，全光照条件更利于病原菌的生长，致死温度为47℃，水浴10 min。室内药剂初步筛选结果显示，50%啶酰菌胺和25%吡唑醚菌酯对病原菌的抑制效果最好，平均EC₅₀值分别为4.752×10^-2、4.989×10^-2 mg/L。本研究结果为E. latusicollum引起烟草叶斑病的田间防控奠定了一定的理论基础。     

小麦叶片谷氨酰胺合成酶的分离纯化及鉴定

为了解谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）同工酶在小麦中的种类、活性及亚基组成状况,利用盐析、凝胶过滤、阴离子交换层析等技术对小麦苗期叶片中的GS同工酶进行了分离纯化及鉴定。通过测定GS活性跟踪GS的纯化过程,利用NativePAGE结合活性染色技术检测GS的纯化效果,利用SDSPAGE鉴定GS的亚基组成。结果表明,在小麦幼苗叶片中检测到3种GS同工酶GS1、GS2和GSx,其中Gsx含量少,但活性高。从小麦幼苗叶片中纯化得到2个GS同工酶即GS1和GS2。GS1由39 kD的亚基组成,GS2由45 kD的亚基组成,没有纯化得到GSx。     

小麦穗发芽抗性鉴定及相关分子标记的有效性验证

为筛选出抗穗发芽小麦种质及可用于种质评价和分子标记辅助育种的高效分子标记,以41份黄淮南片区试品系和309份中外小麦品种为材料,选用4个与穗发芽抗性相关的标记,即STS标记Vp1B3和MST101、STMS标记wmc104及SSR标记Xgwm155,结合整穗发芽鉴定试验,评价筛选抗穗发芽小麦种质,同时对上述4个分子标记进行有效性验证。结果表明,标记Vp1B3和wmc104可有效用于小麦穗发芽抗性筛选,而标记Xgwm155和MST101与穗发芽抗性不相关;350份供试材料中41份国家区试材料的整穗发芽率普遍偏高,均值达到43.94%;而另外309份材料中,淮麦20、轮选987、长旱58等18份材料为高抗穗发芽品种,平均整穗发芽率为2.56%,是穗发芽抗性育种中的重要抗性资源。     

可可种质抗黑果病离体鉴定方法研究

利用可可离体叶片和离体果实鉴定可可种质对黑果病抗性的方法。结果表明：接种方法、接种物浓度、叶龄或果龄等因素影响离体叶片、果实黑果病发生程度;离体叶片接种鉴定方法最适条件是采用针刺法接种、接种物浓度3 × 107 个/mL、叶龄50～60 d;离体果实接种鉴定方法最适条件为采用滴接法、接种物浓度为3×105 个/mL、果龄2～3个月。采用离体叶片接种和离体果实接种方法均能鉴定出可可种质对黑果病抗性的差异,鉴定结果与田间成株期的抗病性表现基本一致。