猪IL-2和IL-6的原核表达及多克隆抗体的制备

IL-2和IL-6是机体重要的免疫调节因子,在佐剂的应用方面具有很好的发展前景。论文以pTIL-2和pTIL-6为模板进行PCR扩增得到猪白细胞介素2(pIL-2)和猪白细胞介素6(pIL-6)的全基因序列,通过EcoRⅠ和HindⅢ双酶切及连接反应将目的基因亚克隆到原核表达载体pET30a中构建了融合表达质粒pETIL-2和pETIL-6。将重组质粒分别转化大肠埃希菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3),37℃在IPTG诱导下高效表达了pIL-2和pIL-6,分子质量分别约为26ku和30ku。将包涵体纯化并复性后免疫家兔,制备的兔抗pIL-2和pIL-6的多克隆抗体经ELISA检测效价在1∶12800以上。     

猪白细胞介素-6的原核表达及其生物学活性研究

本研究采用RT-PCR方法自细菌脂多糖(LPS)刺激的猪脾脏细胞总RNA中扩增、克隆猪白介素-6(porcine interleukin-6,PoIL-6)成熟肽基因,并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的重组融合猪白介素-6(rPoIL-6)蛋白通过尿素变性、低浓度复性液复性、PBS透析等步骤进行复性、纯化,采用PoIL-6 ELISA试剂盒检测rPoIL-6蛋白与抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应的活性;采用MTS法检测rPoIL-6蛋白促猪脾脏细胞的增殖活性。结果表明,成功克隆了全长555 bp的PoIL-6成熟肽基因;表达的rPoIL-6蛋白分子质量大小约20 ku;纯化后的rPoIL-6蛋白纯度在95%以上,可和抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应,并且具有显著促猪脾脏细胞增殖活性。     

猪白细胞介素15基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

本研究通过RT-PCR方法从用ConA刺激的猪外周血淋巴细胞中扩增出猪IL-15(pIL-15)编码序列的cD-NA,将其克隆至T载体pMD18-T后,序列测定表明pIL-15基因长度为489 bp,编码162个氨基酸。进一步通过PCR方法获得缺失其N端48 aa的信号肽序列的成熟pIL-15蛋白基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-28a的6×His下游,构建重组表达质粒pET-pIL15,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导,重组菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到分子量约为15 ku的重组蛋白,其表达量占总菌体蛋白量的17.5%。Western blot试验也证实表达的重组融合蛋白6×His-pIL15能够很好地与抗6×His单抗发生反应。猪IL-15基因的克隆、表达为进一步研究其功能和应用奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌ompP2基因在猪肺泡巨噬细胞中的表达

为了进一步研究副猪嗜血杆菌(HPS)ompP2基因的功能,根据已发表的副猪嗜血杆菌核苷酸序列,设计并合成1对引物,PCR扩增HPS LZ株外膜蛋白ompP2基因,获得大小为1 158bp的核苷酸片段,该片段纯化后克隆至pEASY-Blunt载体,转化后鉴定,再与真核表达质粒pCI-neo经过酶切和连接反应,转化感受态大肠杆菌Trans-T1,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。通过脂质体法将pCI-neoompP2转染猪肺泡巨噬细胞,通过RT-PCR和Western blot方法检测重组质粒是否表达。结果显示,成功构建了含ompP2基因的副猪嗜血杆菌真核表达载体pCI-neo-ompP2,提取转染该质粒的猪肺泡巨噬细胞的mRNA,进行RT-PCR扩增,在1 000bp~2 000bp之间可见1条明显的条带。Western blot发现在42ku处出现目的条带。试验结果为后期研究副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞的机理奠定了基础。     

猪白细胞介素-18基因表达及重组蛋白的纯化

以pcDNA3.1-IL18为模板进行PCR扩增获得猪白细胞介素-18(IL-18)的成熟肽基因,以KpnⅠ、SacⅠ双酶切PCR产物作为供体,KpnⅠ、SacⅠ双酶切的pET41c和pET32c作为载体,连接载体供体,转化DH5α,经双酶切、PCR鉴定及测序筛选出阳性重组质粒,并命名为pET41c-IL18和pET32c-IL18。将pET41c-IL18和pET32c-IL18转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),用1 mmol/L IPTG 37℃诱导表达。SDS-PAGE及W estern-blotting分析结果表明,所表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,pET32c-IL18重组蛋白分子质量约33 ku,与预期大小相符。将包涵体提取物用8 mol/L脲变性,经N i-NTA柱纯化,透析复性,得到了纯化的IL-18蛋白。     

猪白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过RT—PCR方法从用PHA和LPS刺激的猪脾脏细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA，克隆到T载体pUCm-T后，序列测定表明，pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474bp，编码157个氨基酸。将该基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a构建重组质粒pETIL18m，转化大肠杆菌BL21(DE3)，并用IPTG诱导。重组菌菌体裂解物SDS—PAGE可检测到相对分子质量为19000的重组蛋白，免疫印迹法证实该重组蛋白可以与人IL-18单抗发生特异性免疫反应。     

猪轮状病毒地方株JL94株VP6基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以猪轮状病毒地方分离株JL94株病毒核酸为模板,通过RT-PCR扩增内衣壳蛋白基因VP6 cDNA,将其插入克隆载体质粒pMD18-T,并进行测序。从T载体上将VP6基因亚克隆到表达载体质粒pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并利用Ni^2 金属螯合亲合层析纯化融合蛋白。结果表明,VP6基因全长1356bp,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量可占菌体蛋白的26．5％,在表达的蛋白中,除45ku主要蛋白外,还有几条分子量较小的蛋白表达出来,这些融合蛋白经纯化后均具有良好的反应特异性。     

猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列（GenBank登录号：XM_003124236.4）设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a（+）连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。     

猪白细胞介素2基因的克隆及腺病毒表达载体的构建

根据GenBank中收录的猪白细胞介素2(pIL-2)基因序列,设计1对特异性引物.运用RT-PCR技术从刀豆素(Con A)诱导的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到pIL-2基因,并将其克隆至pGEM-T Easy栽体上.核苷酸测序结果显示,获得的基因序列全长493 bp,含465 bp的开放阅读框,编码154个氨基酸,与已知pIL-2核苷酸序列和氨基酸序列的同源性都高达100%.将克隆的pIL-2基因编码阅读框亚克隆至腺病毒穿梭栽体pShuttle-CMV,电转化含腺病毒基因组(pAdEasy-1)的大肠埃希茵细胞BJ5183-AD-1,成功获得了重组腺病毒DNA,将纯化后的重组腺病毒DNA转染AD-293细胞,经过病毒基因组的PCR鉴定和转录水平的RT-PCR鉴定,初步表明,获得了表达pIL-2的重组腺病毒.     

猪白细胞介素-2的原核表达及其生物学活性研究

本研究采用RT-PCR方法自刀豆素（Con A）刺激的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增克隆了猪白细胞介素-2（porcine interleutin-2,PoIL-2）成熟肽基因,并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的融合重组猪白细胞介素-2（rPoIL-2）蛋白通过尿素变性、低浓度复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化,采用MTT法测定rPoIL-2蛋白促小鼠细胞毒性淋巴样系CTLL-2株细胞增殖活性以评价rPoIL-2的活性。结果表明,成功克隆了rPoIL-2的成熟肽基因,基因全长405 bp,编码134个氨基酸;表达的rPoIFN-α蛋白分子质量大小约为16.5 ku,与预期大小相一致;经纯化后的蛋白质纯度在96%以上;纯化的rPoIL-2蛋白促小鼠CTLL-2株细胞增殖活性最高值是对照细胞的3倍。本研究成功表达了具有生物学活性的PoIL-2蛋白,为新型基因工程抗病毒制剂和免疫增强剂的开发奠定了基础。     

猪白细胞介素2／6嵌合基因的融合表达及活性

采用重叠延伸PCR（SOE—PcR）方法通过一基因柔性接头（linker）将猪白介素2（PoIL-2）、6（PoIL-6）基因构建成PoIL-2linker-PoIL-6嵌合基因并克隆入pQE-30原核表达载体中进行融合表达;对表达的重组融合蛋白（rPoIL-2qinker-PoIL-6）进行纯化。分别检测rPoIL-2-linker—PoIL-6蛋白与抗PoIL-2、PoIL-6单抗发生特异性免疫反应及促猪外周血淋巴细胞和猪脾脏细胞的增殖活性。结果显示：成功构建了PoIL-2-linker-PoIL-6嵌合基因及其重组原核表达质粒（rpQE-30／PoIL-2-linker-PoIL-6）。表达的rPoIL-2linker-PoIL-6蛋白相对分子质量约28000,蛋白经纯化后纯度在96％以上。rPoIL-2-linker—PoIL-6蛋白分别具有与单一重组PoIb2、PoIL-6蛋白（rPoIL-2、rPoIL-6）对照相近的生物学活性,可与抗PoIL-2、PoIL-6单抗发生特异性免疫反应,并可显著促进猪外周血淋巴细胞和猪脾脏细胞的增殖。结果表明,rPoIL-2-linker—PoIL-6蛋白在体外具有单一rPoIL-2和rPoIL-6蛋白的双重生物学活性,这为下一步进行rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白在动物体内活性研究奠定了基础。     

猪白细胞介素-2在BHK-21细胞中表达及其活性分析

为鉴定BHK-21细胞中稳定表达猪白细胞介素-2(PoIL-2)的活性,本研究利用RT-PCR技术从猪的淋巴细胞中克隆PoIL-2基因,将其连接于pcDNA3.1载体中,并转染BHK-21细胞.经过G418筛选及RT-PCR鉴定,获得稳定表达PoIL-2基因的BHK-21细胞系.采用实时定量PCR及ELISA测定PoIL-2在BHK-21细胞内的表达,同时以淋巴细胞增殖试验(MTT)检测PoIL-2蛋白活性.试验结果表明稳定整合PoIL-2基因的BHK-21细胞系其PoIL-2 mRNA的转录效率是阴性对照组1.43倍,蛋白表达量是阴性对照组1.29倍.MTT试验表明真核表达的PoIL-2促淋巴细胞增殖活性与阴性对照组相比差异极显著(p＜0.01),表明BHK-21细胞表达的PoIL-2具有良好的生物学活性.本研究为开发新型基因工程疫苗佐剂和抗病毒制剂奠定了基础.     

猪ROCK1基因克隆、序列分析及时空表达研究

为进一步获得猪肉质性状候选基因Rho相关激酶1（Rho-associated,coiled-coil containing protein kinase 1,ROCK1）的序列特征、生物学功能及时空表达规律等信息,本研究通过PCR、SMARTer RACE PCR的方法克隆了猪ROCK1基因,应用生物信息学方法分析该基因的蛋白质序列在不同物种中的进化关系,并采用RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法检测其在不同组织和不同猪种背最长肌不同发育阶段的表达。结果显示,ROCK1基因有2个转录本,包含4 065 bp的开放阅读框（ORF）,编码1 354个氨基酸;猪ROCK1基因ORF序列与人、小鼠和大鼠的ORF序列的同源性分别为95%、91%和91%,相应的氨基酸序列同源性分别为98%、96%和94%,该蛋白在不同物种间高度保守;ROCK1基因的组织分布较广泛,不同发育阶段在同一组织中的表达会发生变化;胚胎期ROCK1基因在梅山猪背最长肌中的表达极显著高于大白猪（P < 0.01）,出生后ROCK1基因在2个猪种背最长肌中的表达无显著差异（P > 0.05）。本试验结果为研究ROCK1基因在猪骨骼肌发育中的生物学功能及其分子机制奠定基础。     

血清对猪前脂肪细胞分化过程中聚脂相关基因表达的影响

为了探讨血清对猪前脂肪细胞诱导分化的影响,筛选更优的诱导方法.采用胶原酶消化法分离猪皮下前脂肪细胞,用含50 nmol·L~(-1)胰岛素、100 nmol·L~(-1)地塞米松、0.25 mmol·L~(-1)3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100nmol·L~1罗格列酮及添加(对照组)或不添加(试验组)10%FBS的分化培养液1和2对前脂肪细胞进行诱导分化,借助实时定量RT-PCR方法检测了细胞分化过程中聚脂相关基因PPARα、C/EBPα、FASN、ACOX1、GPAT和ENPP2的表达模式.结果显示:血清对PPARγ和FABP4两基因的表达有极显著的上调作用(P<＜0.01),而对其他6个基因的表达有极显著的下调作用(P＜0.01).试验组中FASN、GPAT和ACOX13个基因诱导分化各时间点的综合表达景均极显著高于对照组(P＜0.01),3基因表达量变化趋势间均达到极显著相关(P＜0.01).试验组中PPARα、PPARγ、C/EBPα和ACOX1 4个基因的基因表达最变化趋势间均达到显著或极显著正相关.研究表明:前脂肪细胞分化过程中,细胞内脂肪酸的生物合成和β氧化均在发生,细胞内脂肪含量积聚的快慢取决于2个途径力量的对比;PPARα、PPARγ、C/EBPα和ACOX14个基因间存在极强的协同表达现象;在细胞内脂肪积聚快慢上,含血清的分化培养液1要优于不含血清的分化培养液2.     

Cloning and Expression Analysis of Porcine JHDM2A Gene

The aim of this study was to clone the JHDM2A gene of porcine and study the expression of JHDM2A gene in porcine ovary. In this study, we cloned the porcine JHDM2A gene and constructed its eukaryotic expression vector, the expression of JHDM2A gene in porcine ovarian tissue was also analyzed. The results showed that the cloned CDS length of porcine JHDM2A gene was 3 945 bp, which encoded 1 315 amino acids. The results of multiple amino acid sequence comparison showed that the porcine JHDM2A shared 93.5%, 94.7%, 94.7% and 93.8% homologous compared with those of Bubalus bubalis, Bos taurus, Ovis aries and Homo sapiens, respectively. Phylogenetic tree analysis indicated that the JHDM2A gene was highly conservative in the evolutionary process. The pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A eukaryotic expression vector was constructed, and clear green fluorescent signal was observed when the plasmid was transfected into HEK293T cells by liposome method. The immunohistochemical results showed that the JHDM2A protein was expressed in porcine follicle of different development stages.The results showed that the porcine JHDM2A gene sequences was cloned, and the JHDM2A protein was highly expressed in porcine ovary, indicating that its function might be closely related to the development of porcine follicular.     

猪NDUFS2基因的定位、克隆和组织表达谱分析

利用辐射杂种克隆板对猪NDUFS2(NADH dehydrogenase(ubiquinone)Fe-S protein 2)基因进行了染色体定位,克隆了该基因的CDS序列,用相关软件进行了基因结构和功能预测,并利用半定量RT-PCR对基因的组织表达谱进行了分析。研究结果表明:NDUFS2基因定位于猪的4号染色体SSC4q,与标记SW589紧密连锁。获得NDUFS2基因的CDS为1 392 nt,编码463个氨基酸。物种间系统进化树分析表明:猪与牛的NDUFS2基因序列同源性更高。结构预测发现猪NDUFS2基因具有一个NuoD保守结构域,与能量的产生和转化功能有关。根据组织表达谱分析结果,NDUFS2在猪的11种组织中的表达量有差异。     

猪JHDM2A基因的克隆及表达分析

试验旨在克隆猪JHDM2A基因,并研究其在猪卵巢组织中的表达情况。首先克隆猪JHDM2A基因,并构建pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体,同时对JHDM2A基因在猪卵泡发育过程中的表达情况进行分析。结果显示,克隆得到的猪JHDM2A基因编码区长度为3 945 bp,编码1 315个氨基酸。通过多重氨基酸序列比对发现,猪JHDM2A基因与黄牛、水牛、绵羊和人相应氨基酸序列的同源性分别为93.5%、94.7%、94.7%和93.8%。蛋白质分子系统进化树分析结果表明,JHDM2A基因在物种进化过程中高度保守。通过脂质体转染法将构建的pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体导入HEK293T细胞,可观察到清晰的绿色荧光蛋白表达。免疫组化结果显示,JHDM2A蛋白在不同发育阶段猪卵泡中均有表达。本试验通过克隆获得猪JHDM2A基因序列,JHDM2A蛋白在猪卵巢中高度表达,表明其功能可能与猪卵泡发育密切相关。     

猪轮状病毒GD株VP6基因的克隆及序列分析

参考GenBank中发表的PRV OSU毒株VP6基因核苷酸序列ORF两端保守区序列,设计1对特异引物,以PRV GD株反转录cDNA为模板,通过PCR方法扩增出长约1.4 kb的基因片段,并克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。测序结果表明:VP6基因全长1320 bp,含有一个1194bp的开放阅读框,编码397个氨基酸。与国内外已知的11个毒株VP6基因的核苷酸及其推导的氨基酸序列比较,同源性分别为76.5%-95.6%和88.7%-99.2%;核苷酸系统发育进化树结果表明,GD毒株与轮状病毒JL94,CN86,OSU毒株亲缘关系较近,为一个进化群。     

藏系绵羊IGF-1基因表达水平的实时荧光定量PCR检测

采用实时荧光定量PCR SYBR GreenI荧光染料法,对藏系绵羊皮肤细胞中IGF-1基因的表达水平进行了相对定量分析,建立了快速检测IGF-1基因表达量的方法。通过该方法检测出了IGF基因在藏系绵羊皮肤细胞中的相对表达量,且表达量有差异。该方法具有灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快等优点。     

Cloning and Eukaryotic Expression Plasmid Construction of Porcine Interleukin-18 Gene

To obtain recombinant eukaryotic expression plasmid of porcine interleukin-18(IL-18), the whole gene of porcine IL-18 gene was amplified from porcine spleen, lung and lymph nodes by RT-PCR and cloned into eukaryotic expression vector pZJ-1. The recombinant expression plasmid pZJ-IL-18 were identified by enzyme digestion and sequencing analysis, and was transfected into 293T cells.The expression of IL-18 was detected by Real-time PCR and Western blotting in both gene and protein levels. The results showed that the eukaryotic expression plasmid of porcine IL-18 was constructed and could express transiently in 293T cells. Western blotting result confirmed that porcine IL-18 polyclonal antibody could react specifically with approximately 17 ku expression products,and indicated that IL-18 could express correctly and be responsive.This study constructed the eukaryotic expression plasmid of porcine IL-18 gene which could express transiently in 293T cells, and laid the foundation for studying function of IL-18.