武夷菌素高产菌株的选育

武夷菌素（Wuyiencin）是从不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var．wuyiensis）产生的一种农用抗生素，其主要成分A是具有胞昔骨架的新型核苷类抗生素。武夷菌素对多种农作物病害有较好的防治效果，如黄瓜白粉病、番茄叶霉病、灰霉病、黄瓜黑星病等。随着人民生活水平的提高和食品消费档次的不断上升，人们对绿色食品的需求量将逐渐加大.     

中生菌素高产菌株的选育

通过中生菌素高产菌株初筛研究，得到在培养基的ｐＨ值为７．０时，菌落琼脂柱对指示菌抑制圈的大小与其产素量成正相关；在此基础上，比较了用紫外线处理、低温和紫外线复合处理、原生质体加紫外线复合处理及原生质体融合等４种育种方法，结果所用方法都能有效地提高中生菌素产生菌的效价，其中原生质体加紫外线处理的方法最佳。最终得到了４株高产菌株，产素量比亲株提高了５０％￣９０％，达到５０００￣６５００μｇ／ｍＬ。     

乙基伊维菌素高产菌株选育及其发酵工艺优化

基因工程菌Streptomyces avermitilis AVE-H39产生的甲基和乙基伊维菌素(methyl and ethyl ivermectins),为新型高效低毒的阿维菌素(avermectin)衍生物,具有很好的开发应用前景。活性测试结果显示,乙基伊维菌素对朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus和松材线虫Bursaphelenchus xylophilus等农林作物害虫的活性优于甲基伊维菌素。鉴于菌株S. avermitilis AVE-H39的乙基伊维菌素产量低,制约了产业化开发,本研究经过多轮诱变选育,筛选获得了一株乙基伊维菌素发酵单位高的突变菌株,并通过Plackett-Burman试验设计及Box-Behnken设计-响应面法(response surface methodology, RSM)对该突变菌株的发酵培养基进行改良。经优化后的发酵条件为：玉米淀粉149.8 g/L,黄豆粉38.1 g/L,(NH₄)₂SO₄ 3.04 g/L,甘露醇30.0 g/L,酵母抽提物20.0 ...     

中生菌素高产菌株的效果评价

经测定，中生菌素高产菌株ＵＶ－７与亲株Ｂ－７都比较稳定，但产素水平较亲株Ｂ－７提高了８０％左右；在６个有效组份中Ａ、Ｂ、Ｃ３组份的含量明显减少，而Ｆ组份的比例明显增加；有效组份的比例也发生了较大变化，产物杀菌能力也与中生菌素标准品不同，其杀细菌的能力增大，杀真菌的能力下降，防治真菌病害的效果略有下降     

武夷菌素高产基因工程菌发酵培养基的优化

为进一步提高武夷菌素的产量,以基因工程菌Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis W273为试验菌株,采用单因子试验确定发酵培养基的最适6种营养成分为玉米粉、葡萄糖、黄豆面、氯化铵、碳酸钙和氯化镁;应用SAS软件中的Plackett-Burman设计法,对影响菌株发酵生产武夷菌素的6个因素进行了筛选,确定葡萄糖和碳酸钙为影响摇瓶发酵生产武夷菌素的主要因素。利用响应面分析法对2个主要因素的最佳水平及其交互作用进行研究,建立了二次回归方程,Y=218.18+270.28X₁+1274.74X₂-3.28X₁²-5.4X₁X₂-200.98X₂²,并最终确定最佳培养基配方为玉米粉20 g/L、葡萄糖39 g/L、黄豆面20 g/L、氯化铵4 g/L、碳酸钙2.65 g/L、氯化镁0.4 g/L。以新配方在28℃、220 r/min进行摇瓶发酵60 h后,武夷菌素效价平均值为7215 μg/mL,较原始培养基发酵后武夷菌素效价提高了26.5%。     

武夷菌素产品的创制与应用

武夷菌素是具有我国自主知识产权的生物农药,先后创制了1％、2％、3％武夷菌素系列产品.作为一种低毒、高效、广谱的核苷类微生物次级代谢产物,对多种作物的真菌性病害具有很好的防治效果.本文总结了四十年来,武夷菌素在产品创制、高产菌株选育、发酵工艺、提取工艺以及田间应用等方面的研究进展,展望了武夷菌素产业化发展过程中存在的问...     

中生菌素高产菌株发酵条件的研究

中生菌素产生菌通过菌种选育，得到４株效价较亲株提高７０％的菌株。通过正交回归实验得到中生菌素高产菌株ＵＶ－７的摇瓶最佳培养条件和最佳发酵配方；明确了通气量和葡萄糖含量是影响最终产素量的主要因素。在６．６Ｌ的全自动发酵罐中优化发酵，明确了ＵＶ－７发酵过程中的代谢规律，证明了发酵代谢的终点与溶解氧和ｐＨ的变化有直接关系。     

苏云金素高产菌株的选育

用硫酸二乙酯(DES)处理苏云金杆菌CT-43菌株,得到了菌落形态、菌形和产生褐色素三种类型的突变株。光滑型(S-型)菌落自发突变的比例依亚种的不同而不同,CT-43菌株高达13.0％,苏云金亚种为10.6％,以色列亚种为3.9％,库斯塔克亚种不产生S-型菌落,S-型菌落依DES处理CT-43菌株芽孢时间的延长而增加,处理90分钟达49.0％。除个别S-型菌落外,均不产生苏云金素。诱变产褐色素菌落的频率为1.4％,它们都不产苏云金素。菌形变异株有仅芽孢,仅伴孢晶体,芽孢和伴孢晶体,营养体和芽孢,营养体和伴孢晶体,营养体、芽孢和伴孢晶体发生变异六种类型,它们产生苏云金素的水平各不相同。还获得了苏云金素产量比出发菌株明显提高的二个菌株。     

嘧肽霉素高产菌株的选育

以不吸水链霉菌辽宁变种为出发菌株,经紫外线、亚硝酸诱变和紫外线与嘧肽霉素复合诱变,选育出了嘧肽霉素的高产菌株,抑菌圈直径由原来的20.5mm提高到36.4mm。传代培养5代表明,该高产菌株遗传特性稳定。     

多杀菌素高产菌株的选育

采用原生质体紫外诱变、等离子束辐射、^60Co-γ射线等诱变处理，对多杀菌素产生菌出发菌株C121进行诱变，通过菌块一薄层层析法初筛、摇瓶发酵复筛和终筛，最终获得产素水平比出发菌株提高174％的高产菌株Co329。经HPLC测定其发酵效价达1260μg／ml。     

武夷菌素可溶性粉剂的研究

比较研究了凹凸棒土、高岭土、硅藻土和水合二氧化硅等载体对武夷菌素发酵液的吸附性能;阴离子表面活性剂萘磺酸盐甲醛缩合物(NNO)、高分子接枝磺酸盐GY-JZH-A、高分子羧酸盐聚合物GY-D02和聚环氧乙烷环氧丙烷醚CY-JM6180等助剂对武夷菌素可溶性粉剂配方的分散性、润湿性和悬浮率的影响;不同助剂对武夷菌素可溶性粉剂的生物学效果的影响.结果表明,水合二氧化硅对武夷菌素发酵液的饱和吸附量为3.52ml/g,最适合用于吸附武夷菌素发酵液以制备高含量的可溶性粉剂;采用聚环氧乙烷环氧丙烷醚GY-JM6180为助剂,配制的2%武夷菌素可溶性粉剂分散性好,悬浮率高,以稀释300倍液喷雾,其对小麦白粉病的防治效果达73.7%,而1%武夷菌素发酵液稀释150倍喷雾对小麦白粉病的防治效果仅为31.5%.在综合以上研究的基础上,研究出了2%武夷菌素可溶性粉剂的最优配方.     

丁烯基多杀菌素高产菌株的巴龙霉素抗性筛选

为了提高须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona的丁烯基多杀菌素产量水平,利用核糖体工程技术,对其进行巴龙霉素抗性筛选,在10×MIC巴龙霉素浓度下,分离得到巴龙霉素自发抗性突变株54株。通过对原始菌株和突变株代谢产物变化的初步研究发现,相比于原始菌株,丁烯基多杀菌素组分在抗性突变株中的合成能力有明显差异,有6株抗性突变株的产量明显高于原始菌株,约20%左右的突变株产量提高,约45%左右的突变株产量降低。其中突变株P-7的丁烯基多杀菌素产量提高幅度最大,相比原始菌株提高2.2倍。对巴龙霉素抗性突变株P-7进行DNA序列分析,在编码核糖体S12蛋白的rps L基因保守区域中发现点突变,第314位的C突变为A,由脯氨酸突变为谷氨酰胺;第320位的C突变为T,由丙氨酸突变为缬氨酸。     

嗜线虫致病杆菌高产菌株的选育

用 4种诱变方法 (紫外线、氯化锂、60 Co γ射线、自身代谢产物 )对嗜线虫致病杆菌进行了诱变处理。结果表明 ,菌株对各种诱变剂均比较敏感 ,低剂量诱变和复合诱变处理的菌株正变率较高 ,其中氯化锂加紫外线复合诱变的累加处理效果最好 ,效价提高了 6 0 %～ 70 % ;连续5代传代培养 ,其产素能力基本稳定。     

放线菌GAAS7310高产菌株的选育研究

采用自然选育、紫外线和空间诱变相结合,对抑菌霉素A17(Antimycin A17)的产生菌——放线菌GAAS7310(Streptomycessp.)进行菌种选育。筛选出高产菌株TK1,其产素效价比原始菌株提高了约60%;酯酶同工酶分析表明该突变株在酯酶同工酶的谱带上与出发菌株有差异,但表现不明显。     

武夷菌素防治葡萄灰霉病的作用及机理

为了探讨武夷菌素对葡萄灰霉病的防治效果及作用机理,本文通过菌丝生长速率测定、分生孢子萌发抑制测定、胼胝质沉积测定、离体叶片和果实防治等试验,发现武夷菌素可以抑制灰霉病菌的菌丝生长,浓度达到120μg/mL时,对菌丝的抑制作用达到94.3%;当浓度达到100μg/mL时,武夷菌素对葡萄灰霉病菌的孢子萌发抑制率可达到96.0%;通过离体叶片及果实防效试验发现,武夷菌素浓度达到120μg/mL时,防治效果分别为87.5%和96.6%。武夷菌素可以显著降低灰霉病菌的草酸合成能力,导致其致病力减弱,从而减轻灰霉病菌对寄主的侵染。武夷菌素能够通过诱导葡萄叶片的胼胝质沉积,增加葡萄组织的防御能力,从而起到有效防治灰霉病的作用。综上所述,武夷菌素对葡萄灰霉病具有良好的防治效果,可以作为生物防治药剂进行应用推广。     

利用原生质体融合技术选育农抗120高产菌株及应用的研究

利用TF-120和KT-739菌株理化特性相似、抗性互补、届者生长速度快等特点,进行了原生质体的形成、再生及其融合的研究,从近千个融合子中选育出一株FR-220。经鉴定,确认FR-220为农抗120高产菌株。工厂中试结果,其发酵单位可以提高一倍,由6000～8000μg/ml增加到14000～17000lμg/ml,相当于生产成本降低一半。1988-1089年田间防治瓜果蔬菜上的白粉病、炭疽病、枮萎病,试验示范面积2000亩,防效达70～90％,增产20～25％,扩大推广20万亩。     

武夷菌素(Bo—10)通过鉴定

武夷菌素研究是国家“七.五”攻关项目之一,现已经过验收并通过鉴定。此菌是中国农科院植保所微生物室,从武夷山土中分离的一株链霉菌,并由黑龙江省肇东市生物制品厂投入生产。此菌素主要组成部分是核苷类抗菌素,其毒性很低,经试验对多种植物病原真菌和一些     

武夷菌素生物合成调控基因wysPIII的功能

为了深入研究武夷菌素生物合成调控机理,通过筛选对武夷菌素产量有影响的基因,明确基因的功能,利用分子育种技术来获得武夷菌素高产菌株。本研究通过基因敲除和过表达技术,获得了wysPⅢ基因的缺失突变株、互补菌株和过表达菌株,验证了该基因在武夷菌素生物合成过程中的功能和武夷菌素产量的关系。结果表明：wysPⅢ基因的过表达菌株生长速率加快,产孢时间提前,而缺失突变株较野生菌株生长变慢,产孢量下降,孢子颜色由正常的深灰色变为灰白色,菌丝变稀疏,但是构建好的菌株与野生型菌株相比,武夷菌素产量没有显著变化。由此可知：wysPⅢ基因调节菌株的生长和产孢特征,而不影响武夷菌素的产量,过表达菌株生长速率加快可缩短武夷菌素发酵时间,降低生产成本。     

武夷菌素对活体微生物农药的影响

本文以武夷菌素为主要对象,以牛津杯抑菌测试法和菌丝生长抑制法观察武夷菌素对几种常见的真菌类活体微生物农药之间的影响。武夷菌素对于真菌孢子的抑制试验结果显示,武夷菌素在高浓度处理下对球孢白僵菌的抑制作用显著大于金龟子绿僵菌,其中对球孢白僵菌的最小抑菌浓度为400 mg/L,对金龟子绿僵菌的最小抑菌浓度为200 mg/L。武夷菌素对绿色木霉、哈茨木霉、淡紫拟青霉菌丝生长率的抑制试验结果显示：武夷菌素100 mg/L浓度对于三种真菌菌丝生长的抑制率分别为64.6%、48.6%、39.2%,进行毒力回归方程计算,数据表明武夷菌素对绿色木霉的EC₅₀为57.13 mg/L,对哈茨木霉的EC₅₀为109.81 mg/L,对淡紫拟青霉的EC₅₀为170.03 mg/L。武夷菌素在防治病害过程中实际用药量约100 mg/L,会对金龟子绿僵菌、球孢白僵菌、绿色木霉、哈茨木霉和淡紫拟青霉产生不同程度的抑制,建议应错开使用。本研究所获得的结果对指导武夷菌素及活体微生物农药的生物防治应用具有重要的意义,为生物防治技术集成提供理论基础。     

武夷菌素防治大豆菌核病的作用机制

武夷菌素是一种核苷类农用抗生素,具有高效、广谱、低毒等优点,对大豆菌核病具有良好的防治效果。武夷菌素防治大豆菌核病包括抑制核盘菌和诱导大豆抗病性两方面的作用。本文分别从核盘菌生长发育、生理毒性和基因表达三个层面介绍了武夷菌素抑制核盘菌的作用机制,同时,从植物防御过程中的胼胝质沉积、防御相关酶活变化和激素信号传导途径三方面综述了武夷菌素诱导大豆抗病的作用机制。此外,本文分析并展望了今后深入研究武夷菌素防治大豆菌核病作用机制的工作重点。