小反刍兽疫病毒F蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性分析

利用Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统,构建含有小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因的重组质粒F-p Fast Bac HTA,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒F-Bacmid,转染昆虫Sf9细胞,获得含有PPRV F基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出59 ku左右的表达蛋白,Western blot与间接免疫荧光试验(IFA)检测该蛋白具有很好的反应原性。通过免疫BALB/c小鼠,ELISA结果证明F蛋白可以诱导产生高水平的血清抗体;MTT试验结果显示F蛋白能刺激T淋巴细胞增殖;说明表达的F蛋白具有良好的免疫原性。以上研究结果为小反刍兽疫病毒的检测方法及亚单位疫苗的研究奠定基础。     

基因Ⅰ型乙型脑炎病毒病毒样颗粒的制备及其对小鼠的免疫原性分析

降低猪场的流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE)感染率对于阻断人的JE暴发至关重要,鉴于我国JE防控形势的紧迫性和现有基因Ⅲ型商品化乙型脑炎病毒疫苗对部分基因Ⅰ型乙型脑炎病毒(genotypeⅠJapanese encephalitis virus, GⅠJEV)流行毒株免疫保护的不确定性,急需研制安全高效、成本低廉的新型猪用GI JEV疫苗。本研究在杆状病毒载体pFastBac~(TM)多克隆酶切位点插入GⅠJEV的prME基因表达盒,测序验证后的阳性重组质粒转染DH10Bac~(TM)感受态细胞后获得Bacmid-prME重组杆粒,进一步将其转染至Sf9昆虫细胞后,获得Bac-prME重组杆状病毒。Western blot、间接免疫荧光及电镜观察GⅠJEV病毒样颗粒组成蛋白表达及病毒样颗粒形成情况,通过小鼠免疫试验初步评价GⅠJEV病毒样颗粒的免疫原性。Sf9昆虫细胞中prME基因表达盒编码的蛋白得到高效表达,且组装形成病毒样颗粒。病毒样颗粒免疫原性评估结果表明:GⅠJEV病毒样颗粒可诱导免疫小鼠产生高滴度的乙型脑炎病毒中和抗体。本研究利用杆状病毒昆虫细胞表达系统获得了GⅠJEV病毒样颗粒,为研制安全高效的乙型脑炎病毒病毒样颗粒亚单位疫苗提供物质基础。     

小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因在昆虫细胞中的分泌表达及免疫原性研究

试验旨在探索利用杆状病毒表达系统分泌表达小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV） F基因蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PPRV F基因克隆到已插入蜂毒信号肽（melittin）的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含F基因的重组杆状病毒DNA （F-Bacmid）,转染提取的F-Bacmid DNA至Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒（F-rBac）,应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示,重组蛋白可被PPRV的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠试验结果显示,该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。本研究成功分泌表达了PPRV F蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为小反刍兽疫亚单位疫苗的研制奠定基础。     

小反刍兽疫病毒M蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备鼠抗小反刍兽疫M蛋白多克隆抗体,提取小反刍兽疫病毒(PPRV,Nigeria 75/1疫苗株)总RNA,用RTPCR方法扩增M基因并克隆到pMD18-T载体中,以鉴定正确的质粒进行酶切,回收目的片段后克隆于原核表达载体PGEX-4T-1,获得重组质粒PGEX-4T-1-M,转化大肠杆菌Transetta(DE3)并进行诱导表达,优化诱导蛋白表达条件,放大培养收获目的蛋白,并进行纯化,用纯化后的目的蛋白制备免疫原免疫昆明鼠制备多克隆抗体,利用间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。结果成功扩增出大小约为1 005bp(去掉终止密码子)的PPRV M基因;并构建了真核表达载体PGEX-4T-1-M,经IPTG诱导后目的蛋白以包涵体的形式表达,蛋白表达的最优条件为37℃,0.4mmol/L IPTG诱导4h;用经Ni-NTA纯化后的重组蛋白3次免疫昆明鼠后成功获得了PPRV M蛋白鼠源多克隆抗体,间接免疫荧光试验显示该多克隆抗体能够特异性识别非变性全长M蛋白。     

经密码子优化的小反刍兽疫病毒H蛋白在昆虫细胞中的表达

小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)属于副黏病毒科、麻疹病毒属成员。本实验室已经证明,该病毒的囊膜糖蛋白H蛋白在未经密码子优化条件下难以在昆虫细胞中表达。本研究首先对其密码子进行优化,然后构建了在昆虫细胞中表达该蛋白的重组杆状病毒。经Western-blot和间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒在昆虫细胞中能够表达H蛋白,但表达量相对较低。     

小反刍兽疫病毒N基因重组杆状病毒的构建及间接ELISA抗体检测方法的建立

本研究旨在建立基于真核表达的小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白的诊断小反刍兽疫的间接ELISA方法。利用Bac-to-Bac杆状病毒-昆虫表达系统,构建含有PPRV N基因的重组供体质粒pFastBacHTA-N,转化E.coliDH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒pBacmid-PPRV-V,转染昆虫细胞Sf21,获得含有PPRV N基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出60ku左右的表达蛋白,Western blot检测该蛋白具有很好的反应原性。以重组Bacmid-PPRV-N蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。临床检测来自西藏疫区的37份山羊血清和来自青海省非疫区的92份山羊血清,与法国蒙彼利埃农学发展研究国际合作中心(CIRAD-EMVT)提供的竞争ELISA试剂盒相比较,特异性为96.2%,敏感性为100%,二者的符合率达到96.9%。结果表明本研究建立的间接ELISA方法可以很好地用于小反刍兽疫的临床诊断。     

经密码子优化的小反刍兽疫病毒H蛋白在昆虫细胞中的表达

小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）属于副黏病毒科、麻疹病毒属成员。本实验室已经证明,该病毒的囊膜糖蛋白H蛋白在未经密码子优化条件下难以在昆虫细胞中表达。本研究首先对其密码子进行优化,然后构建了在昆虫细胞中表达该蛋白的重组杆状病毒。经Western-blot和间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒在昆虫细胞中能够表达H蛋白,但表达量相对较低。     

广西优势血清西优势血清型IBV代表株M基因在杆状病毒系统中的表达

采用RT-PCR扩增鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西优势血清型代表性毒株GX-YL5的膜(M)蛋白基因,将其克隆至pFastBac~(TM)/HBM-TOPO杆状病毒转移载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得重组杆粒rHBM-M;将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒;利用间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白质免疫印迹(Western-blot)鉴定表达的M蛋白。IFA检测可见重组杆状病毒感染后72h细胞出现特异性荧光,Westernblot检测可见大小约为26ku的特异性蛋白带,表明该重组M蛋白在Sf9昆虫细胞中成功获得表达。研究为IBVM蛋白的生物学功能、IBV诊断试剂和新型疫苗制备等奠定基础。     

表达小反刍兽疫病毒F蛋白的重组山羊痘病毒疫苗的研究

本研究利用gpt筛选基因和eGFP报告基因纯化筛选重组小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因的重组山羊痘病毒(rGPV-PPRV-F),并经过PCR鉴定.免疫荧光和蛋白印迹试验都证实重组病毒能够感染绵羊羔羊睾丸细胞并表达PPRV F蛋白.以2×106PFU的rGPV-PPRV-F皮内注射免疫山羊3只,并于首次免疫后第28 d以相同剂量进行二次免疫.分别于一免后21 d和二免后14 d采血后分离血清进行病毒中和试验.结果表明,一免后21 d山羊痘病毒(GPV)中和抗体效价依次为1:40、≥1:80、≥1:80,PPRV中和抗体效价依次别为1:20、1:40、1:20,全部阳转;二免后14 d,GPV中和抗体效价≥1:80,PPRV中和抗体效价依次为1:20、1:80、1:40.本研究为小反刍兽疫重组山羊痘疫苗的产业化奠定了基础.     

小反刍兽疫病毒重组N蛋白抗原制备及间接ELISA检测方法的建立

将编码小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白的基因全长克隆到pBacPAK9载体中,并在昆虫细胞中进行表达。对表达产物进行SDS-PAGE分析,并用PPRV阳性血清进行了Western blot鉴定。用Ni-IDA亲和柱对组氨酸融合表达的N蛋白进行了纯化,并对纯化产物进行了理化性质和抗原活性分析。最后以表达的N蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法,临床检测137份山羊血清并与IDvet公司的商品化PPRV抗体检测试剂盒进行比较。结果表明,制备的PPRV N蛋白抗原在溶液中以单体形式存在,具有非常好的抗原活性。用该蛋白建立的间接ELISA检测方法与IDvet试剂盒符合率为956%。本研究为小反刍兽疫病毒重组N蛋白抗原制备相关质量标准的建立奠定了基础,同时建立的ELISA抗体检测方法可以很好地用于小反刍兽疫的临床诊断。