布鲁菌DnaK蛋白抑制宿主细胞凋亡

布鲁菌病是一种典型的人兽共患细菌病,胞内寄生是其感染宿主、并难以治疗的主要原因。目前有关布鲁菌胞内寄生的机制尚未清晰。在本试验中,通过克隆布鲁菌DnaK基因到表达载体pQE-80L,分离纯化His-DnaK融合蛋白,探讨DnaK蛋白调节宿主细胞凋亡的功能。试验表明,第一,His-DnaK处理的巨噬细胞Caspase3剪切被抑制;第二,His-DnaK处理的巨噬细胞TUNEL染色显著降低;第三,布鲁菌DnaK蛋白能抑制宿主细胞凋亡。这将为进一步阐明布鲁菌胞内寄生的分子机制奠定基础。     

RNA干扰抑制ST细胞Ⅰ型干扰素受体-2表达的研究

应用RNA干扰技术建立猪睾丸(ST)细胞Ⅰ型干扰素受体-2(IFNAR-2)基因knock down模型。采用FuGENE HD转染剂将pSiCMVE1、pSiCMVE2和pSiCMVE3干扰载体分别转染ST细胞,经荧光定量PCR和Western blot分别检测IFNAR2mRNA和蛋白水平表达变化。结果显示,与对照组比,转染干扰载体组均可明显降低IFNAR2 mRNA和蛋白的表达(P0.05)。RNA干扰技术能够有效抑制IFNAR2基因的表达,为进一步研究IFNAR2基因的生物学功能提供可靠的手段,为研究IFNAR2在病毒感染中的作用奠定基础。     

ST细胞表达TGEV主要蛋白的研究

为了提高猪睾丸(swine testicular,ST)细胞的转染效率,研究猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)各蛋白的功能,试验利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的真核表达载体pEGFP-C1转染ST细胞,对ST细胞的转染条件进行优化;然后利用优化后的转染条件将TGEV各蛋白真核表达质粒转染到ST细胞,通过免疫印迹(Western-blot)和间接免疫荧光(IFA)方法检测TGEV各蛋白在ST细胞中的表达情况。结果表明:悬浮细胞转染法(在细胞传代的同时进行转染)比贴壁细胞转染法(待细胞贴壁后再进行转染)的转染效率更高,且转染质粒与转染试剂的比例为1∶3时是转染ST细胞的最佳比例。利用优化后的转染条件将TGEV各蛋白真核表达质粒转染到ST细胞,48 h后采用IFA法检测发现TGEV各蛋白在ST细胞中成功表达,Western-blot法检测发现TGEV各蛋白在ST细胞中表达的大小与预期相符。说明优化后的转染条件可用于提高ST细胞的转染效率。     

小RNA病毒与细胞凋亡

在小RNA病毒科中,口蹄疫病毒等不同病毒的不同基因可诱导宿主细胞发生凋亡,其作用机制也不完全相同.论文对小RNA病毒诱导细胞凋亡的机制进行了综述,并对相关研究进行了展望.     

小RNA病毒与细胞凋亡

在小RNA病毒科中,口蹄疫病毒等不同病毒的不同基因可诱导宿主细胞发生凋亡,其作用机制也不完全相同。论文对小RNA病毒诱导细胞凋亡的机制进行了综述,并对相关研究进行了展望。     

细胞凋亡抑制蛋白cFLIP在小鼠妊娠黄体中的表达

为了观察FLICE样抑制蛋白(cFLIP)在小鼠卵巢妊娠黄体中的表达情况,试验选择10周龄以上的ICR系健康小鼠,采用苏木精-伊红(H.E.)染色、cFLIP染色、PCNA染色、TUNEL染色方法分别对妊娠12.5天、16.5天、18.5天的黄体进行观察分析。结果表明:cFLIP在小鼠妊娠12.5天、16.5天、18.5天的黄体中均有高度表达。说明cFLIP可能作为抗凋亡因子参与小鼠妊娠黄体的维持。     

细胞内寄生虫抑制细胞凋亡的机制

宿主有效地防御机制使寄生在细胞内的虫体发展了多种调节宿主细胞凋亡的途径。刚第弓形虫、杜氏锥虫、利什曼原虫、泰勒虫等都可抑制宿主细胞的凋亡进程而为自身的复制和寄生生活的持续提供了有利的环境,尽管它们进入细胞的机制和在细胞中的定位不同,但都激活相似的途径而发挥抑制作用。目前已知有2个家族的蛋白分子能够打破凋亡进程,一是寄生虫依赖的核因子κappaB,另一个是寄生虫感染诱导表达的热休克蛋白。其确切的分子机制尚不清楚。     

羊驼睾丸细胞凋亡及凋亡相关蛋白的定位

本研究旨在观察羊驼睾丸的出生后发育和精子发生过程中的细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl2和Caspase3 的定位.取材新生、12月龄和24月龄羊驼的睾丸,用TUNEL法检测睾丸发育和精子发生过程的细胞凋亡,用免疫组织化学技术检测凋亡相关蛋白Bcl2和Caspase3在羊驼出生后发育和精子发生过程中的定位.结果显示在新生羊驼睾丸未检测到TUNEL阳性细胞,Caspase3和Bcl2表达于间质细胞,提示在新生期凋亡蛋白参与间质细胞凋亡的调节,为曲精小管的发育提供空间;12月龄羊驼睾丸TUNEL阳性细胞定位于曲精小管中央部分,Caspase3 和Bcl2定位于间质细胞和曲精小管中央生殖细胞,提示在青春期(12月龄)羊驼睾丸,细胞凋亡和凋亡相关蛋白参与曲精小管管腔形成的调节;24月龄羊驼睾丸TUNEL阳性细胞定位于精原细胞、精母细胞和精子细胞,Caspase3 和Bcl2定位于间质细胞和各个发育阶段的生精细胞,Caspase3阳性细胞在精原细胞最高,向精母细胞和精子细胞逐渐减少,Bcl2在精原细胞弱阳性表达,在血睾屏障以内的曲精小管近腔室部分呈弥散性强阳性表达,提示在性成熟(24月龄)羊驼睾丸精子发生过程中,细胞凋亡主要发生于精原细胞和早期精母细胞,Bcl2可能抑制精母细胞之后生殖细胞的凋亡.结果提示在羊驼睾丸出生后发育和精子发生过程中存在细胞凋亡现象;凋亡蛋白Caspase3和Bcl2参与羊驼睾丸发育和精子发生过程中细胞凋亡的调节.     

牛分枝杆菌Mb0869c抑制外源性细胞凋亡的研究

为探究与人受体相互作用蛋白激酶1 (RIPK1)存在互作的牛分枝杆菌(M. bovis) Mb0869c蛋白对细胞凋亡的作用机制,本研究通过PCR从M. bovis DNA中扩增Mb0869c基因片段后构建重组质粒p MN437-Mb0869c并经PCR和测序鉴定正确后,利用电转化法将重组质粒电转入耻垢分枝杆菌(MS)中,并经western blot鉴定Mb0869c蛋白的表达情况。结果显示,重组菌株中出现约55 ku的特异性条带,表明获得了表达Mb0869c的重组菌MS＿Mb0869c。将MS＿Mb0869c株和对照菌株MS＿Vec分别感染人单核巨噬细胞(THP-1),通过PI和AnnexinⅤ/FITC染色,经流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,结果显示,MS＿Mb0869c感染细胞的凋亡率显著低于MS＿Vec感染组,这表明Mb0869c可以抑制MS诱导的细胞凋亡。将上述获得的Mb0869c基因片段克隆于p LVX-IRES-Puro-3×Flag中,构建的重组质粒经测序鉴定正确后,转染HEK293T细胞中,利用嘌呤霉素筛选表达Mb0869c的细胞并经western blot鉴定。结果显...     

Dynamic of nasal colonization by methicillin-resistant Staphylococcus aureus ST398 and ST1 after mupirocin treatment in a family in close contact with pigs

Nasal colonization by methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) was evaluated after a mupirocin treatment in a family previously colonized by MRSA sequence type ST398 and ST1, who lived close to a pig farm. Eight nasal samples were swabbed from each of the four family members on different moments after mupirocin treatment. The efficacy of treatment was low in those family members who worked in the farm, and higher in the remaining two family members with sporadic contact with pigs. In addition, nasal and skin swabs from randomly selected pigs of the farm were taken. MRSA were detected in 33% of pigs tested. All MRSA isolates obtained were characterized by Staphylococcal-Cassette-Chromosome mec (SCCmec) determination, Multilocus-Sequence-Typing (MLST), spa- and agr-typing, Pulsed-field-gel-electrophoresis (PFGE), antimicrobial susceptibility, detection of antimicrobial resistance genes, and toxin gene profiling. Spa-types t011, t1255 and t1197 were detected in humans and animals, with indistinguishable PFGE patterns, suggesting animal to human MRSA transmission. Each spa-type was ascribed to a specific pulsotype. Spa-types t127 and t108 were only detected in MRSA isolates obtained from humans, and t012 only in those from animals. MRSA ST1-t127 isolates and some ST398-t011 and ST398-t1197 isolates presented a multiantimicrobial-resistance phenotype. None of them harbored lukF/lukS, tst, eta and etb virulence genes. This study showed that the efficacy of nasal MRSA decolonization in healthy people with very close contact with pigs is especially low.     

基于CRISPR/Cas9技术的Wip1基因敲除ST细胞的建立

旨在采用CRISPR/Cas9编辑系统获得Wip1基因敲除的猪睾丸（swine testis,ST）细胞,为后续在细胞水平上探究Wip1基因对ST细胞增殖、凋亡的影响奠定基础。本研究将实验室已有的靶向Wip1基因第一外显子的两条sgRNA（sgWip1-1和sgWip1-2）分别连接到pX330-GFP和pX330-RFP载体,然后共转染ST细胞（从80~90日龄的猪胚胎睾丸组织中分离出未成熟的支持细胞）。利用流式细胞仪收集红绿双荧光阳性的ST细胞,以用于单克隆细胞挑选。对得到的30个单克隆细胞进行基因型鉴定,并将PCR产物进行T-A克隆。结果显示,有29个单克隆细胞出现了基因片段敲除,Wip1基因的片段敲除效率为96.7%。其中单等位基因片段敲除的有5个,纯合双等位基因片段敲除的有8个,杂合双等位基因片段敲除的有16个。本研究高效地构建了Wip1基因敲除的ST细胞,不仅为后续研究Wip1基因对ST细胞增殖、凋亡的影响提供了细胞模型,也为研究Wip1基因对公猪繁殖性能的影响奠定了基础。     

副产物乳酸对猪链球菌疫苗株ST171发酵的影响

为提高猪链球菌(S.suis)疫苗的高密度发酵效果,本研究对S.suis疫苗株(ST171)的发酵过程进行检测,利用外源添加试验研究乳酸对ST171发酵的影响,并通过对发酵工艺的优化减少乳酸的生成.结果表明,ST171发酵液中积累有大量对其生长及活菌数量有不利影响的代谢副产物乳酸.经优化确定ST171发酵的最优工艺参数为:溶氧水平20％,初始葡萄糖浓度10g/L,残糖浓度1g/L,最大比生长速率小于0.7 h-1.在优化条件下,发酵过程中乳酸生成量与原工艺相比降低了41.41％,菌体生物量和活菌数量分别提高了70.58％、129.09％,取得了良好的发酵效果.     

基因对雄性生殖细胞凋亡调控的研究进展

生殖细胞凋亡是维持精子正常发生及导致少精或无精的重要因素,生精异常是诱发男性不育、生殖系统肿瘤等生殖系统疾病的原因之一.生殖细胞凋亡受多种因素控制,从基因水平研究雄性生殖细胞凋亡的过程将有助于揭示各种因素相互间作用的关系.作者就近些年对一些基因如Bc1-2基因家族、p53抑癌基因、Fas/FasL系统等在雄性生殖细胞凋亡调控中作用的研究进行了综述.目的是从分子水平上阐明生殖细胞凋亡的机理,为相关生殖系统疾病的治疗提供理论基础.     

流感病毒NS1蛋白在细胞凋亡中的作用

NS1蛋白是在细胞凋亡中发挥重要作用的流感病毒蛋白之一。流感病毒NS1是的颉颃剂,押制干扰素诱导的抗凋亡效应,同时也与病毒的致病力有直接的关系。详尽论述了NS1蛋白在细胞凋亡中的作用及其抗凋亡的作用机制,流感病毒的免疫预防和delNS1病毒作为特异性肿瘤杀手在临床上应用的前景与近年来的研究进展。     

表达无毒性大肠杆菌ST1-LTB融合蛋白基因工程菌株的构建

利用基因突变技术，将形成ST1分子内二硫键的半胱氨酸碱基进行突变，使ST1失去本身毒性，进而将其与含有LTB基因的pET-28b( )连接，转化至受体菌BL21(DE3)，重组菌株BL21(DE3)(pXST3LTB)经IPTG诱导后，其表达产物免疫的小鼠能够抵抗大肠杆菌强毒菌的攻击并且消除了ST1的毒性，表明构建的工程菌株BL21(DE3)(pXST3LTB)可作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选菌株。     

大肠杆菌耐热性肠毒素ST1—K99／LacZ基因重组的研究

将构建的ｐＢＳＴ２～６工程菌质粒用限制性内切酶ＢａｍＨＩ／ＢｇｌⅡ酶切，经琼脂糖凝胶电泳和电洗脱，回收１４７ｂｐ的目的ＳＴ１基因。随之将该基因分别重组到能有效表达Ｋ９９菌毛抗原和ＬａｃＺ酶的ｐＧＫ９９之Ｋ９９基因ＢｇｌⅡ位点和ｐＵＣ１８的ＢａｍＨＩ位点中。通过ＳＴ１基因探针菌落原位杂交、特定酶切分析及ＤＮＡ序列分析，筛选并鉴定出了理想重组子，从而构建出了能分别表达ＳＴ１融合基因产物的工程菌株ｐＳＫ２１９和ｐＸＳＴ１。     

Ghrelin对雌激素诱导小鼠胸腺细胞凋亡的抑制作用

6周龄BALB/c雌性小鼠80只,分为4组：雌激素＋Ghrelin组、雌激素＋生理盐水组、生理盐水组、空白对照组。雌激素＋Ghrelin组首先隔日腹腔注射苯甲酸雌二醇（0.1mg/只）2周,然后采用相同方法注射Ghrelin（120μg/只）2周;雌激素＋生理盐水组首先注射苯甲酸雌二醇2周,然后注射生理盐水2周;生理盐水组注射生理盐水4周;空白对照组不注射任何试剂。测量各组小鼠的胸腺指数,同时应用光镜、电镜和流式细胞术检测胸腺的显微结构、超微结构和胸腺细胞凋亡率。结果雌激素＋Ghrelin组的胸腺指数极显著大于雌激素＋生理盐水组,胸腺细胞凋亡率极显著小于雌激素＋生理盐水组（P〈0.01）,而二者与生理盐水组和空白对照组均差异不显著（P〉0.05）;雌激素＋Ghrelin组的胸腺显微结构和超微结构基本恢复正常,并与生理盐水组和空白对照组相似。结论得出Ghrelin可以通过抑制胸腺细胞凋亡和促进胸腺细胞增殖,从而逆转雌激素诱导的小鼠胸腺萎缩。     

Inhibitory effects of epigallocatechin gallate on the propagation of bovine coronavirus in Madin-Darby bovine kidney cells

Epigallocatechin gallate (EGCg) is the main active component of tea polyphenol and shows several biological activities, such as antimicrobial, antitumor‐promoting, anti‐inflammatory and anti‐oxidative activities. In the present study, the inhibitory effect of EGCg on bovine coronavirus (BCV) propagation in Madin‐Darby bovine kidney (MDBK) cells was investigated. EGCg at concentrations of less than 10 µg/mL did not show any cytotoxicity to MDBK cells. BCV propagation was significantly inhibited by pretreatment of the virus with EGCg (0.5–10 µg/mL) before virus inoculation in dose‐dependent, incubation time‐dependent and temperature‐dependent manners. The antiviral effect of pretreating MDBK cells with EGCg on BCV propagation was much weaker than that of pretreating BCV with EGCg. The hemagglutination activity of BCV was also reduced by EGCg in a dose‐dependent manner. These results demonstrate that EGCg possesses a distinct anti‐BCV activity and strongly suggest that EGCg interferes with the adsorption of BCV to MDBK cells by the interaction of EGCg with BCV particles. EGCg may therefore be a useful candidate for controlling BCV infection more effectively.