猪圆环病毒间接免疫荧光方法的建立

将接种PCV2且经多次传代的PK-15带毒细胞分散到96孔细胞培养板上，制成抗原诊断板，应用间接免疫荧光技术检测血清中PCV2的抗体。通过对各种反应物的工作浓度与作用时间的优化，建立了PCV2抗体的间接免疫荧光检测技术，可用于PCV2抗体水平的监测，为今后的猪圆环病毒疫苗抗体检测的研究提供了检测方法。     

应用间接免疫荧光试验检测猪圆环病毒抗体

用猪肾传代细胞系PK－15增殖猪圆环病毒2型（PCV－2）毒株制备抗原，建立了检测PCV抗体的间接免疫荧光试验（IFA）。应用该方法对64份临床送检血清样品进行了检测。结果，38份血清呈现PCV抗体阳性（59％）。IFA方法的建立为临床上进行PCV流行病学调查及相关疾病的诊断提供了另一种检测手段。     

猪圆环病毒2型间接ELISA方法的建立

为了猪圆环病毒2型（PCV2）抗体,该研究建立了快速、敏感的ELISA诊断方法。研究应用原核表达的PCV2-Cap蛋白作为包被抗原,通过抗原最适包被浓度和兔抗猪IgG最佳稀释浓度的确定,待检血清稀释度的选择,阴阳性临界值的确定,然后进行特异性测定、重复性测定和符合率比较等,     

猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用

本研究利用原核表达的猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白作为标准抗原蛋白建立PCV2抗体检测方法,同时对建立的检测方法的相关条件进行了优化。通过优化确定抗原的最佳包被浓度为10 μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶160,最佳封闭试剂为10%牛血清,二抗的使用浓度为1∶1000,血清及二抗的最佳反应条件为37 ℃孵育60 min,底物的最佳反应条件为37 ℃反应10 min,cutoff值为0.25。通过批内及批间重复性的评价,变异系数均小于0.1,表明本检测方法具有较高的可重复性。与标准的检测试剂盒相比,检测临床样本时,本检测方法与对照试剂盒检测结果符合率为91.7%。结果表明,建立的检测方法可用于临床PCV2抗体的检测。     

猪圆环病毒2型IgM抗体间接ELISA的建立

猪圆环病毒2型(PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合症的重要原发性病原,其感染的早期检测有助于及时采取防控措施。以重组衣壳蛋白(Cap蛋白)作为包被抗原,通过对反应条件的优化,建立了PCV2 IgM抗体间接ELISA,其最适抗原包被浓度为1.25 μg／mL,最适血清稀释度为1∶100,临界值为0.35。该检测方法与其他5种常见猪疫病阳性血清无交叉反应,特异性良好。批内、批间重复试验的变异系数均在2%~6%,重复性好。对100份临床样本的检测结果表明,该检测方法与国外同类试剂盒相比,敏感性为90.3%,特异性为92.8%,总符合率为92%。试验结果表明,所建立的PCV2 IgM间接ELISA特异性好和敏感性高,适用于PCV2感染早期的流行病学调查。     

猪圆环病毒2型特异性IgA间接ELISA检测方法的建立与初步应用

为检测猪圆环病毒2型(PCV2)特异性IgA抗体,本研究以纯化的PCV2 Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgA为二抗,建立检测PCV2特异性IgA抗体的间接ELISA方法.确定最佳抗原包被浓度为200 ng/孔,HRP标记羊抗猪IgA的最佳稀释度为1∶30 000.所建立方法与抗猪瘟病毒等病原的抗体间无交叉反应.结果表明该方法具有较好的特异性,组内和组间重复性试验的变异系数介于0.12％～5.47％,具有较好的可重复性.该方法为进一步研究猪感染PCV2和PCV2疫苗免疫后特异性黏膜IgA水平及进行黏膜免疫评价提供了有效的检测方法.     

猪圆环病毒2型和3型检测方法建立及初步应用

为快速检测并鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)病毒。本文研究参考GenBank中PCV2和PCV3高度保守片段分别设计了探针引物,成功建立了一种双重TaqMan荧光定量检测方法。结果显示：该方法特异性好,可鉴别 PCV2、PCV3与其他猪病病毒;PCV2最低检测下限为1.00×10¹ copies/μL,PCV3最低检测下限为1.00×10⁰ copies/μL;重复性高,批内、批间的变异系数分别为0.01%～0.02%和0.02%～0.05%;本研究采用建立的方法与商品试剂盒同步检测猪只样品440份,PCV2样品符合率为97.47%,PCV3样品符合率为96.85%;测序结果显示,PCV2均为2d亚型,PCV3均为3c亚型。结果表明,建立的双重TaqMan荧光定量检测方法具有良好的特异性、敏感性且快速、准确,节约成本,可为PCV2和PCV3的监测与防控提供技术支撑。     

猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用

以大肠杆菌原核表达系统表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白为抗原,建立猪圆环病毒2型间接ELISA检测方法,优化ELISA反应条件,研制猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒。与商品化试剂盒相比,该检测试剂盒敏感性、特异性和符合率分别为95.12%、92.86%和94.55%;同时与猪圆环病毒1型（PCV1）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等多种病毒阳性血清无交叉反应。试剂盒具有较好的重复性,在-20 ℃至少可保存1年以上,将其应用于临床血清样品的检测,结果安徽、广东、广西采样猪场的PCV2阳性率分别为100%、48.39%、100%。     

猪圆环病毒2型抗体间接ELISA检测方法的建立

为了更加快速灵敏地检测血清中猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)抗体的水平,我们通过优化反应条件建立了快速检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA方法。结果显示,本研究研制的试剂盒检测3份PCV2抗体阳性血清的阳性滴度为1∶12 800～1∶25 600,而韩国JBT PCV2试剂盒检测的阳性滴度为1∶3200～1∶6400;对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒等10种其他病原体的20份阳性血清的检测结果均为阴性,表明本研究研制的试剂盒具有良好的特异性;批内重复性试验变异系数(C.V%)为2.26%～7.60%,批间重复试验的变异系数(C.V%)为1.67%～6.41%,变异系数均小于10%,呈现良好的可重复性。因此,我们成功建立了敏感性高、特异性强及重复性好的猪圆环病毒2型抗体间接ELISA检测方法。     

猪圆环病毒2型抗体检测间接ELISA方法的建立

用纯化的重组猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2蛋白作为包被抗原,对各种条件进行优化(如抗原的包被、血清及酶标二抗作用时间、底物的选择等),建立了检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法。结果显示,重组抗原最适包被浓度为0.5mg/L,最适包被条件为4℃过夜,血清稀释度1∶160,酶标二抗工作浓度1∶7500,待检测血清和酶标二抗的反应时间均为37℃,45min,底物37℃显色10min。阻断试验表明,建立的间接ELSA对PCV2抗体具有很好的特异性。板内和板间重复试验显示,同1份血清板内各孔的变异系数均值为2.78%,板间同一份血清D值变化不大,表明重复性好。     

猪圆环病毒2型纳米PCR检测方法的建立及初步应用

建立一种高效、快捷、灵敏的猪圆环病毒2型(PCV-2)的检测方法,本研究根据PCV-2 ORF2基因的保守核苷酸区域设计一对特异性引物,建立了一种用于检测PCV-2的纳米PCR方法,对其反应条件进行优化,并用重组质粒PET28a-ORF2,以及PCV-2(DNA)、猪流行性腹泻病毒(cDNA)、猪瘟病毒(cDNA)和猪细小病毒(cDNA)分别作为模板,检测了该方法的灵敏性及特异性,同时对采集的临床样品进行检测。结果表明,该纳米PCR方法可以扩增出大小为636 bp的特异性片段;最佳的退火温度为54℃,胶体金浓度为0.5 nmol/L,最低可以检出1.0×10~2拷贝/μL,其灵敏度比普通PCR检测方法高10倍以上;对采集的新疆某大型种猪场的78临床份病料进行检测,其阳性检出数量比常规PCR的检出数量高4份样品,表明PCV-2纳米PCR方法具有较高的特异性和灵敏性。本研究建立的纳米PCR方法可用于PCV-2病原学的早期检测和分子流行病学调查;同时对于低病毒的临床样品的检测也提供了一种有效的技术手段。     

猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测方法的建立与初步52用

本研究利用原核表达的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白作为标准抗原蛋白建立PCV2抗体检测方法,同时对建立的检测方法的相关条件进行了优化.通过优化确定抗原的最佳包被浓度为10μg/mL,血清的最佳稀释度为1:160,最佳封闭试剂为10%牛血清,二抗的使用浓度为1:1000,血清及二抗的最佳反应条件为37℃孵育60 min,底物的最佳反应条件为37℃反应10 min,cutoff值为0.25.通过批内及批间重复性的评价,变异系数均小于0.1,表明本检测方法具有较高的可重复性.与标准的检测试剂盒相比,检测临床样本时,本检测方法与对照试剂盒检测结果符合率为91.7%.结果表明,建立的检测方法可用于临床PCV2抗体的检测.     

猪圆环病毒2型实时荧光RAA检测方法的建立及初步应用

根据猪圆环病毒2型(PCV2)Rep基因序列,设计引物及探针,建立了PCV2实时荧光重组酶介导等温扩增(recombinase-aid amplification, RAA)检测方法。该方法能在40℃恒温条件下20 min内对病原进行快速检测,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪传染性胃肠炎病毒、繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒3型和口蹄疫病毒均无交叉反应;对病毒核酸的最低检测限为21.2 copies/μL。用荧光PCR检测方法与建立的荧光RAA检测方法对66份临床样品进行检测,两种方法符合率为90.09%。结果表明,建立的PCV2实时荧光RAA方法适用于PCV2的快速检测。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白ELISA检测方法的建立及初步应用

将杆状病毒表达系统表达并经梯度离心纯化的PCV2Cap蛋白作为标准品,利用双抗夹心法建立了针对猪圆环病毒2型Cap蛋白的ELISA检测方法,并应用于圆环病毒2型基因工程疫苗的质控。结果表明,多抗最适包被浓度为1μg/mL,最佳封闭液为1％BSA,最佳单抗反应浓度为2μg／mL,反应时间60min,最佳二抗使用稀释度1：40000,反应时间60min。该方法与St9细胞、BSA和其他猪病病毒抗原之间无交叉反应,最低检测抗原量为5ng。     

猪圆环病毒2型RPA恒温扩增检测方法的建立及初步应用

利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),以猪圆环病毒2型Cap基因的保守序列为靶序列设计并筛选出一组特异性的引物和探针,建立了快速检测猪圆环病毒2型核酸的RPA方法。试验结果表明,该方法特异性强,猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)核酸检测结果均为阴性,灵敏性高,最低可检出核酸浓度为0. 87×10-4ng/μL,简单快速,且重复性好。利用所建立的RPA方法对183份临床样品进行检测,结果与实时荧光PCR方法符合率为98. 9%。本研究为猪圆环病毒2型核酸的快速检测提供了一种新方法,尤其适合基层实验室或养猪场的快速检测。     

猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测试剂盒研制及应用

以原核表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白为包被抗原,建立间接ELISA方法并进行相应优化,成功研制猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测试剂盒,与国内市场标杆产品进行比较,敏感性为97.8%,特异性为92.8%,总体符合率达到了95%。同时,该试剂盒批间、批内变异系数均小于10%,具有较好的重复性。在临床应用中显示,该试剂盒测定江苏A猪场阳性率为82.2%,其中母猪阳性率为100%,育肥猪阳性率为73.3%。B猪场免疫母猪及后代的阳性率为98.3%,其中母猪阳性率为100%,后代为97.7%,且母猪的抗体水平高于子代,结果为圆环病毒2型在猪场的感染情况与疫苗免疫效果提供了有力的支撑。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白间接ELISA诊断方法的建立和应用

以纯化的原核表达的猪圆环病毒2型（PCV-2）重组结构蛋白（rCap蛋白）为包被抗原,建立PCV-2间接ELISA诊断方法;对抗原最适包被浓度、待检血清稀释浓度、重组抗原包被条件、封闭液的筛选、阴阳性临界值等条件进行了优化;对优化后的ELISA检测方法进行特异性试验、临床应用试验;组装试剂盒并进行试剂盒保存期试验。优化反应条件后确定的抗原最适包被浓度为2.815 μg/mL,抗原最佳包被条件为37 ℃ 2 h;血清最适稀释度为1∶40,酶标抗体最适稀释度为1∶500,最佳封闭液为1% BSA;阴阳性临界值判定标准为D450 nm≥0.33,判为阳性,D450 nm＜0.33,判为阴性。特异性试验结果表明,只有PCV-2阳性血清反应后的D450 nm＞0.33,包括抗PCV-1阳性血清在内的其他5种抗血清反应后的D450 nm＜0.33,说明所建立的ELISA方法具有良好的特异性。经对临床疑似PCV-2感染的100份血清样品进行检测,阳性检出率为69%。组装试剂盒在4 ℃条件下至少可保存12个月以上,说明所建立的诊断方法可以在生产中大量推广应用。本研究成功建立了能特异性检测抗PCV-2血清抗体的ELISA检测方法。     

猪捷申病毒与猪圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立可同时检测猪捷申病毒（PTV）与猪圆环病毒2型（PCV2）的双重PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以上2种病毒的PCR诊断方法,扩增片段长度分别为187bp（PTV）、120bp（PCV2）。通过实验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性,对PTV、PCV2核酸检测最低浓度分别为2．8×10^-2ng和6．6×10^-3ng。应用该方法对43份临床样品进行检测发现,PTV阳性率为23％,PCV2阳性率为38％,PTV与PCV2共感染率为16％。该方法的成功建立,为快速高效地检测以上2种病毒提供有力手段。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank登录的PCV2的保守序列,设计1对引物,建立了PCV2的PCR检测方法。试验结果表明,该PCR方法敏感、特异,适于临床样品检测,为PCV2的临床诊断和流行病学调查奠定了基础。