PRRSV特异性肽-N对CSFV弱毒疫苗免疫猪骨髓细胞因子分泌的影响

本试验探讨PRRSV特异性肽-N对CSFV弱毒疫苗免疫猪骨髓细胞因子分泌量的影响。选择已免疫CSFV弱毒疫苗的猪为实验动物,提取四肢长骨骨髓,进行T淋巴细胞的分离培养。分别在培养后的24、72 h,用PRRSV特异性肽N1、N2对所培养细胞进行刺激,再进行培养12 h,经离心方法得到细胞上清液,最终检测上清液中细胞因子IFN-γ、IL-12、IL-10的分泌含量变化。结果显示,PRRSV特异性肽-N对于免疫猪骨髓中IFN-γ的分泌影响较小,能够抑制IL-12的分泌,不利于机体免疫反应,对IL-10的分泌影响复杂,需进一步研究。     

PRRSV GP5类特异性肽对CSF、PRRS免疫猪组织淋巴细胞TGF-β1分泌的影响

选择已成功免疫猪瘟(CSF)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)弱毒疫苗的仔猪作为实验动物,提取其骨髓、胸腺、肺门淋巴结和脾脏,进行T淋巴细胞的分离培养,然后用PRRSV特异性肽GP5-1、GP5-2对培养的细胞进行刺激,再培养至24,48h时间点时,离心取细胞上清液,检测上清液中TGF-β1的分泌含量的变化。结果显示,PRRSV GP5类特异性肽刺激作用后,CSF、PRRS免疫猪组织淋巴细胞中TGF-β1的分泌量减少,表明GP5-1、GP5-2肽具有减弱免疫抑制,恢复宿主抗病毒免疫应答的作用。本试验为PRRSV合成肽疫苗及疫苗佐剂的研制提供了理论依据。     

PRRSV N类特异性肽对CSF、PRRS免疫猪肺门淋巴结细胞因子分泌的影响

为研究猪瘟(CSF)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)免疫猪肺门淋巴结中淋巴细胞对PRRSV N类特异性肽刺激的应答特点,试验从猪肺门淋巴结中分离T淋巴细胞,分别用PRRSV N类特异性肽进行刺激,待细胞培养至24,48h时,离心取细胞上清液,检测上清液中细胞因子TGF-β1、IL-10、IL-12分泌含量的变化。结果显示,PRRSV N类特异性肽能够抑制TGF-β1、IL-10的分泌,表明N1、N2肽具有减弱免疫抑制,促进抗炎性细胞因子分泌的作用;此外IL-12的分泌量也减少,且有逐渐恢复平衡的趋势,提示PRRSV N类特异性肽可能具有双面性,有待于进一步研究。本试验为PRRSV合成肽疫苗及疫苗佐剂的研制提供理论依据。     

PRRSV特异性肽对CSF、PRRS免疫猪IFN-γ、IL-10分泌的影响

应用PRRSV-GP5特异性肽刺激CSF、PRRS免疫猪外周血淋巴细胞,采用ELISA方法测定不同时间点淋巴细胞分泌IFN-γ及IL-10的水平,分析PRRSV-GP5特异性肽刺激后,淋巴细胞培养上清中细胞因子的变化规律。结果显示,CSFV高抗PRRSV低抗体组于PRRSV免疫14d,肽刺激组中IFN-γ水平显著高于对照组(P<0.05);其他组均差异不显著(P>0.05)。PRRSV免疫14d,细胞培养24,72h后加PRRSV-GP5肽刺激,各组中试验组与对照组相比IL-10水平明显降低(P<0.01);PRRSV免疫28d,各组中肽刺激组与空白组相比,IL-10水平均无显著性差异(P>0.05)。结果表明,PRRSV-GP5肽在PRRSV免疫早期可以促进IFN-γ的分泌,并抑制IL-10的产生,但在免疫后期对淋巴细胞分泌的调节作用还需进一步研究。     

PRRSV GP5蛋白及猪IL-18基因共表达核酸疫苗免疫原性试验

本试验通过分子克隆技术分别构建了单独表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5基因以及PRRSVGP5基因和猪IL-18基因共表达的重组核酸疫苗质粒（pEGFP—GP5和pEGFP—ILl8-GP5）,并进行仔猪免疫原性研究,对构建的PRRSV核酸疫苗所诱导的体液免疫和细胞免疫水平进行检测,进一步研究了PRRSV核酸疫苗免疫效果以及猪IL-18基因对PRRSV核酸疫苗免疫调节作用的影响。同时,调查了商业上应用不同类型的PRRSV疫苗诱导的免疫效果,并与核酸疫苗免疫效果进行比较。结果表明,IL-18作为免疫佐剂在疫苗免疫猪后诱导的病毒特异性细胞免疫反应方面具有很好的调节作用,共表达IL18-GP5蛋白能够明显的改善DNA疫苗的免疫效力,增强抗PRRSV的免疫保护。因此,DNA疫苗做为一种新一代疫苗可用于对抗高致病性PRRSV感染。     

PRRSV特异性肽N对PRRS免疫猪IL-12分泌的影响

选取体质量相同、雌雄各半、生长环境相同的乳猪26头,通过检测筛选出猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)阴性仔猪15头。对这些猪正常免疫PRRSV疫苗,特定时间分离外周血淋巴细胞进行培养,用PRRSV特异性肽N进行刺激,采用ELISA方法测定不同时间点淋巴细胞分泌IL-12的水平。结果显示:PRRSV免疫确切(经ELISA抗体检测呈阳性)14d时淋巴细胞用PRRSV-N-1肽刺激前期能够抑制IL-12的分泌,PRRSV免疫确切(经ELISA抗体检测呈阳性)28d时淋巴细胞用PRRSV-N-1肽能刺激IL-12的分泌量增加。表明淋巴细胞经PRRSV-N-1肽刺激后其IL-12的分泌量会受PRRSV抗体水平的影响,在抗体水平较高时促进淋巴细胞对IL-12的分泌。猪只在PRRSV免疫确切时(经ELISA抗体检测呈阳性),淋巴细胞经PRRSV-N-2肽刺激的时间点越往后其IL-12的分泌量会降低,随着时间的推移受抑制。可以得出PRRSV特异性肽N可以调节外周血淋巴细胞对IL-12的分泌,临床上可以使用PRRSV特异性肽N来增强对PRRSV的抵抗力,但其影响机制还有待研究。     

应用类病毒对PRRSV GP5包膜蛋白的功能进行鉴定

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是有包膜的RNA病毒。PPRSV的病毒粒子有6种包膜蛋白,主要是GP5蛋白和M蛋白,以及少量的GP2、GP3、GP4和E蛋白。GP5是重要的包膜蛋白,它与其它包膜蛋白一起参与PPRSV的形成与感染。在本试验中,为确定单独的GP5包膜蛋白在病毒侵入细胞过程中的作用,对GP5类病毒粒子的构型和感染力进行了研究。把表达GP5的质粒与带有小鼠白血病病毒(MulV)的逆转录病毒载体(pHIT60,编码MuLVGag-Pol基因;pHIT111,编码带有β-半乳糖苷酶报告基因的MuLV基因组)共转染293T细胞,使用超速离心法、蛋白质印迹及感染试验对培养基进行分析,观察到GP5包膜蛋白整合到MulV逆转录病毒载体上形成小鼠白血病的类病毒,这种类病毒能感染PAM和Mack-145细胞,并与野生型PRRSV有同样的寄主范围。该类病毒对PAM细胞的感染力可被PRSV或GP5蛋白特异性多克隆抗体有效中和。这些结果显示,GP5蛋白可能通过与寄主细胞受体相互作用,在病毒侵入细胞过程中起重要作用。GP5类病毒用于鉴别与GP5蛋白结合的细胞受体十分有用。     

PRRSV特异性肽对猪骨髓、脾脏、胸腺、肺门淋巴结中T细胞表型的影响

通过猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)特异性肽PRRSV-GP5(GP5aa96-104)、PRRSV-N(Naa49-57)刺激PRRS免疫后的仔猪骨髓、脾脏、胸腺、肺门淋巴结,用流式细胞仪检测T淋巴细胞表型的变化。结果显示:(1)骨髓和脾脏T细胞受到刺激时,首先转化为以CD4~+ T细胞为主,而胸腺和肺门淋巴结主要转化为以CD8~+ T细胞为主,并产生CD4~+ CD8~+ T细胞。其中,胸腺和肺门淋巴结中CD4的降低为一过性降低。(2)N特异性肽对骨髓CD3~+ 和CD4~+ CD8~+ T细胞有抑制作用,对脾脏和肺门淋巴结中的CD3~+ T细胞有促进作用,该抑制作用在48h后得以改善。(3)胸腺中T淋巴细胞转化能力最持久。(4)骨髓中T淋巴细胞开始以CD4~+ T细胞为主,后转为以CD8~+ T细胞为主。这为进一步研究有效防制PRRS的途径提供理论数据。     

PRRSV特异性肽对CSF、PRRS免疫猪IFN-Y、IL-10分泌的影晌

应用PRRSV-GP5特异性肽刺激CSF、PRRS免疫猪外周血淋巴细胞,采用EI。IsA方法测定不同时间点淋巴细胞分泌IFN-7及IL-10的水平,分析PRRSv_GP5特异性肽刺激后,淋巴细胞培养上清中细胞因子的变化规律。结果显示,CSFV高抗PRRSV低抗体组于PRRSV免疫14d,肽刺激组中IFN-7水平显著高于对照组（P〈0．05）;其他组均差异不显著（P〉0．05）。PRRSV免疫14d,细胞培养24,72h后加PRRSV—GP5肽刺激,各组中试验组与对照组相比IL-10水平明显降低（P〈0．01）;PRRSV免疫28d,各组中肽刺激组与空白组相比,IL-10水平均无显著性差异（P〉0．05）。结果表明,PRRSV-GP5肽在PRRSV免疫早期可以促进IFN-7的分泌,并抑制IL-10的产生,但在免疫后期对淋巴细胞分泌的调节作用还需进-步研究。     

免疫复合物对猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导的PAM细胞因子转录的影响

本试验通过研究免疫复合物影响猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在巨噬细胞内增殖的因素,来进一步探讨免疫复合物经FcγR介导的PRRSV感染机制.本研究将含200 TCID50 PRRSV病毒液与等体积的终浓度为1.30 mg· mL-1的猪IgG-兔抗猪IgG复合物分别先后和同时接种于PAM细胞,分别于12、24、36、48 h收集细胞液,同时设PRRSV感染对照组、免疫复合物对照组和健康细胞对照组,利用建立的相对荧光定量PCR和绝对荧光定量PCR方法分别检测巨噬细胞中IFN-α、IL-10和TNF-α的mRNA转录水平及PRRSV的RNA水平,并进行定量分析,同时采用ELISA方法检测健康细胞中IFN-α的蛋白水平.结果显示,在感染后12～36 h期间,免疫复合物能够抑制PRRSV诱导的IFN-α的mRNA水平,TNF-α mRNA水平在感染后12 h被促进,而在24～36 h期间被抑制.在感染后48 h,免疫复合物能促进IFN-α和TNF-α的mRNA水平,而在12～48 h期间均能抑制IL-10的mRNA水平,此外,免疫复合物在感染12、24和36 h时间段内均能明显促进病毒的增殖,但在48 h后不显著.健康细胞中IFN-α的蛋白水平在培养12～48 h之内呈“降-升-降”的趋势.结果表明,IFN-α蛋白的表达与其mRNA的转录不同步.在PRRSV感染初期,免疫复合物能抑制PRRSV诱导的抗病毒因子的mRNA水平,病毒的复制被促进,而在感染后期,抗病毒因子达到一定的浓度后发挥抗病毒作用,在一定程度上抑制病毒的复制.而TNF-α的转录规律不明显,表明免疫复合物可能同时与激活型和抑制型FcγR结合来共同调节PRRSV诱导的细胞因子的转录.     

PRRSV GP5蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5重组牛痘病毒,本研究通过RT-PCR获得PRRSV CH-1a株GP5蛋白基因,将其克隆至pMD18-T栽体.经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至转移质粒pSC11中,构建重组转移质粒(pSC11-GP5).将pSC11-GP5转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞.与牛痘病毒进行同源重组.在舍有X-gal的琼脂培养基上进行蓝斑筛选,获得了含有PRRSV GP5基因的重组病毒(rWR-PRRSV-GP5).IFA及动物试验表明,重组病毒表达了PRRSV GP5蛋白,并在免疫小鼠体内诱生了较强的PRRSV抗体.实验表明,该重组病毒所表达的PRRSV GP5蛋白保持了良好的抗原性,为进一步研究PRRSVGP5蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白在酿酒酵母中的定位研究

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)gp5基因在酿酒酵母中表达后蛋白的定位位置,以此揭示PRRSV在感染细胞中获取囊膜的位置信息,本研究首先将gp5基因克隆到酿酒酵母表达载体pUG35的gfp基因上游,构建重组质粒pUG-gp5-gfp,电击导入酿酒酵母CEN.PK2中,经尿嘧啶缺陷型营养筛选,获得重组酵母pUG-gp5-gfp/CEN.PK2,在甲硫氨酸营养缺陷培养基诱导表达后,荧光显微镜观察显示,gp5-gfp融合基因在酿酒酵母中获得表达,所表达的融合荧光蛋白主要聚积位置与内质网和质膜的定位模式一致,表明GP5蛋白信号肽在酵母中起到了导向作用,揭示了PRRSV在宿主细胞中获得囊膜的可能位置。该研究为其他病毒在宿主细胞中的组装位置研究提供新的思路。     

4株PRRSV GP5蛋白编码序列的序列测定和特性分析

针对PRRSV ORF5基因组设计了1对特异性引物,利用RT-PCR的方法,对在南方地区分离的4株PRRSV ORF5基因进行了基因扩增,克隆到pMD18-T载体后测序,获得了4株PRRSV ORF5基因全长603bp的核苷酸序列。利用生物信息学软件对4株PRRSV ORF5基因序列进行了遗传进化分析,结果显示GD1、GD2、GD3、GD4株与美洲型参考株(VR-2332)的核苷酸序列同源性分别为87.1%、87.2%、87.1%和86.9%。利用系统进化树分析表明GD1、GD2、GD3、GD4株均属于美洲型。进一步采用序列分析软件对病毒结构蛋白推导糖基化位点比较,结果表明不同毒株GP5糖基化位点在基序和位置上均有所不同,这可能与毒株的毒力、免疫原性的差异相关,这些为更好地了解PRRSV的分子流行病学特征和抗原变异规律提供依据,同时为研制基因工程疫苗奠定了基础。     

抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以大肠埃希菌表达的与GST融合的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白为抗原,免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、克隆后,获得1株能稳定分泌抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为52-C.52-C杂交瘤细胞染色体平均数为90条(86～96);经间接ELISA鉴定,单抗52-C为IgG2a亚型;腹水效价为100×27;与伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、圆环病毒(PCV)、猪瘟病毒(CSFV)和口蹄疫病毒(FMDV)无交叉反应;不能中和PRRSV.以表达的GP5不同突变体为抗原经间接ELISA和Western blot证实,单克隆抗体52-C针对的表位位于GP5蛋白的胞内区.     

猪生殖与呼吸综合征病毒CH-1a株GP5蛋白基因的表达及其单克隆抗体的制备

将猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）CH-1a株GP5蛋白基因信号肽部分删除后克隆于pGEX-6p-1．载体上，并在大肠埃希氏菌中进行表达。经SDS-PAGE电泳分析发现，融合表达的rtGP5蛋白约42ku，将融合蛋白rtGP5用PRRSV阳性血清进行Western-blotting分析，证实所表达的融合蛋白能被其特异性识别。收获融合表达产物rtGP5，按50pg／只的剂量与等量弗氏佐剂乳化，经腹腔免疫BALB／c小鼠3次后，取脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合，分别以融合蛋白rtGP5和GST蛋白为抗原，通过间接ELISA方法对融合细胞的上清液进行检测，筛选阳性克隆，结果得到了15株能稳定分泌抗rtGP5蛋白抗体的阳性细胞克隆株。经间接免疫荧光检测发现，获得的15株单克隆抗体都能与PRRSV感染细胞产生特异性荧光。15株单克隆抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型，且轻链均为k链。     

PRRSV GP5基因的原核表达及其免疫性分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的糖蛋白GP5含有中和表位,是检测用抗原和亚单位疫苗的首选蛋白。本研究将糖蛋白GP5基因截短后,克隆至表达载体pET-30a,转化大肠埃希菌,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示重组蛋白以包涵体形式得到了表达,每升重组菌可纯化得到目的蛋白87.5mg。Western blot和间接酶联免疫吸附试验分析表明,该蛋白与PRRSV阳性血清具有良好免疫反应性。     

共表达PRRSV GP5和N蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

利用杆状病毒双表达系统构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP—PRRSV）N蛋白和GP5蛋白的重组杆状病毒Bac—N—GP5,对重组病毒进行间接免疫荧光、Westernblot分析以及动物免疫试验。结果表明：重组杆状病毒中表达了重组N和GP5蛋白,重组杆状病毒免疫小鼠后产生了抗PRRSVGP5蛋白和N蛋白的特异性抗体。本试验成功构建共表达PRRSVN蛋白和GP5蛋白的重组杆状病毒,为下一步应用该重组杆状病毒作为基因工程亚单位疫苗奠定基础。     

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5基因对小鼠的DNA免疫

将表达完整猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5和融合表达泛素与GP5成熟肽的真核重组表达质粒（pCI—GP5和pcDNA—U—GP5）分别肌肉注射免疫BALB／c小鼠，共免疫3次。采用间接ELISA法检测血清中抗GP5的抗体水平，MTT法检测脾淋巴细胞的增殖能力，LDH释放试验检测脾NK细胞的杀伤活性，并通过流式细胞术检测脾淋巴细胞亚群的比例。结果发现，2种DNA重组质粒免疫后均可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫。三免后第5周，pCI—GP5质粒免疫组诱导产生的抗GP5抗体水平及NK活性明显高于pcDNA—U—GP5质粒免疫组；而pcDNA—U—GP5免疫组的淋巴细胞增殖指数及CD4%-CD8^＋T细胞比例明显高于pCI—GP5组。表明，GP5基因可诱导产生较高的免疫反应，泛素与GP5的融合表达可增强PRRSVGP5诱导的细胞免疫反应。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M基因重组腺病毒的构建及表达

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组腺病毒活载体疫苗,本研究将PRRSV GP5和M基因串联表达盒定向克隆至穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA多克隆位点处,获得重组穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-GP5-M,与骨架质粒pacAd5 9.2-100共转染293AD细胞,包装出含有GP5和M基因的重组腺病毒rAd5-GP5-M。应用PCR技术、间接免疫荧光、Western blot分析,结果表明,GP5和M基因已经被成功整合到了腺病毒基因组上,且GP5和M蛋白在293AD细胞上均得到了表达;滴度测定表明,该重组腺病毒rAd5v-GP5-M的TCID50为10-6.5/mL;连续传代试验表明该重组腺病毒可在细胞内稳定繁殖,有效地转录并表达GP5和M蛋白,具有较高的遗传稳定性。该研究为PRRSV重组腺病毒疫苗的研制打下了基础。