新城疫病毒样颗粒研究进展

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种急性、高度接触性禽类烈性传染病,以呼吸道、消化道及神经系统症状为主要特征,在易感家禽中死亡率高达100%,给中国及世界养禽业和贸易往来带来了严重的经济损失。病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是由病毒蛋白在感染过程中体外表达或自发组装而形成的不含病毒基因组、不能复制、不具有感染能力的病毒样蛋白颗粒。VLPs适宜的大小及独特的表面结构可被天然免疫细胞和分子有效识别,诱导良好的先天性免疫应答和适应性免疫应答,且VLPs不含病毒的感染性核酸,安全性较高,近年来成为疫苗领域中的研究热点。树突状细胞(dendritic cells,DCs)作为专职抗原递呈细胞,在连接天然免疫与适应性免疫之间具有独特功能,是目前抗原递呈能力最强的专职免疫细胞。成熟DCs (mature DCs,mDCs)迁移至次级淋巴组织能刺激初始型T细胞活化和增殖,被认为是特异性免疫应答的始动者,体外培养的不成熟DCs (immature DCs,imDCs) 也可辅助增强抗原递呈能力。NDV-VLPs主要是以NDV-M蛋白为骨架,来装配HN、F和NP蛋白,可表现出与活的NDV颗粒相似的外观和免疫原性。可见通过NDV-VLPs制成的疫苗同样具备安全、稳定、可刺激体液和细胞免疫应答、作为载体表达其他抗原及可设计成区分自然感染与免疫接种等诸多优点。文章主要就NDV-VLPs的相关内容展开探讨,以期为后续研究提供参考。     

不同药物对树突状细胞捕获猪细小病毒样颗粒的影响

通过磁性筛选的方法从猪的脾脏分离树突状细胞(DC),经低渗和钾离子缺乏处理或与氯丙嗪、二甲基氨基吡咪、松胞素D、菲律平等药物分别在37℃下作用1h后,再与荧光素FITC标记的猪细小病毒样颗粒(FITC-PPVVLPs-E290)在37℃下作用4h,应用流式细胞仪检测在体外DC对PPV-VLPs的捕获情况。结果显示:钾离子缺乏及氯丙嗪对DC的捕获效率无影响,而经二甲基氨基吡咪、菲律平、及松胞素D处理的DC对PPV-VLPs-E290捕获效率明显下降。结果表明:DC对PPV-VLPs-E290的捕获与肌动蛋白及巨胞饮、小窝蛋白介导的方式有关,而与网格蛋白介导的方式无关。     

鸡毒支原体TM-1蛋白嵌合新城疫病毒样颗粒的构建及鉴定

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)感染引起的禽类的慢性呼吸道病(chronicrespiratory disease,CRD)与新城疫(Newcastle disease,ND)是严重危害禽类的两种重要疾病,可呈并发或继发感染,给养禽业造成巨大的经济损失.因此,研制安全有效、免疫程序简...     

基因Ⅶ型新城疫病毒样颗粒的制备与鉴定

利用Bac-to-Bac昆虫-杆状病毒表达系统分别构建了含有新城疫强毒株M、F、NP和HN等4个结构基因的单顺反子重组杆粒,经转染后,观察Sf9细胞病变以及PCR鉴定结果表明成功构建了4种重组杆状病毒;收集重组杆状病毒采用共感染策略,Sf9细胞上清经超速离心,蔗糖密度梯度纯化与浓缩后,利用Western blotting方法和透射电子显微镜技术检测,结果表明目的蛋白均正确表达且组装成具有完整囊膜形态的病毒粒子。     

传染性法氏囊病毒VP2蛋白嵌合新城疫病毒样颗粒的构建和鉴定

将传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)强毒株的保护性蛋白VP2替换新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白胞外域部分,利用杆状病毒表达系统,构建了含有IBDV候选抗原表位VP2蛋白的重组杆状病毒rBV-VP2,并通过间接免疫荧光试验鉴定杆状病毒蛋白表达正确。rBV-VP2与NDV-HN、NDV-F、NDV-M组装成病毒样颗粒(cVLPs),形成含有IBDV候选抗原表位的IBD-ND二联病毒样颗粒(IBD-ND cVLPs),利用Western blot鉴定cVLPs各组分蛋白,证明IBD-ND cVLPs各组分组装正确。IBD-ND cVLPs的构建可为我国养禽业提供一种绿色、安全且可一针多防的IBD-ND二联病毒样颗粒疫苗候选株。     

基因Ⅶ型新城疫病毒样颗粒作为疫苗候选株的免疫效果

利用昆虫细胞/杆状病毒表达载体系统,将已构建编码新城疫病毒(NDV)M、F和HN结构基因的3种单顺反子重组杆粒共感染悬浮培养的Sf9细胞以大量制备新城疫病毒样颗粒(ND VLPs)。收集细胞培养上清经超速离心浓缩,蔗糖密度梯度纯化后,利用Western blot检测和透射电镜观察。结果显示,3种目的蛋白均正确表达且组装形成与原病毒粒子形态相似的颗粒,测定其血凝活性效价可达12log2。动物试验结果表明,与LaSota灭活油乳苗相比,将纯化后的病毒样颗粒以含25μg蛋白的剂量或联合佐剂免疫商品蛋鸡后能产生较高水平的HI抗体,且可有效减少攻毒鸡只口咽、泄殖腔途径的排毒时间,从而减少病毒在健康鸡群中的传播感染机会;表明所研制的基因Ⅶ型ND VLPs可作为疫苗候选株具有很大的防控优势。     

新城疫病毒样颗粒(ND-VLPs)免疫效力的研究

为了研究ND-VLPs的免疫原性,利用共表达NDV F、HN、NP和M蛋白的重组杆状病毒rBac-F-HN-NP-M感染Sf9细胞,采用蔗糖密度梯度离心法纯化释放到细胞培养上清的VLPs,免疫60只,18日龄SPF鸡,监测血清中NDV特异性抗体滴度的变化.2周后用相同剂量的VLPs加强免疫.二免后2周以3.16×103EID50的F48E9株强毒滴鼻攻毒.攻毒前,La Sota灭活苗、La Sota 20μg VLP和不同剂量VLPs组(10 μg、20 μg、25 μg)HI效价分别为28.3、28.9、24.1、26.1、26.7;攻毒后,10 μg和20 μg VLP免疫组仅能提供了80%和90%的保护率,但与La Sota灭活苗、La Sota 20 μg VLP一样,25 μg VLP试验组却能够完全抵抗致死剂量的NDV强毒攻击.本试验表明,ND-VLPs具有良好的免疫原性,25 μg VLP诱导机体产生的免疫应答能抵抗致死剂量强毒的攻击.ND-VLPs有可能用来研制针对新城疫流行变异株的高效疫苗.     

新城疫病毒对鸡外周血T淋巴细胞迁移的影响

本试验研究新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)对鸡外周血T淋巴细胞迁移的影响,为探讨鸡对NDV免疫应答机制提供理论支撑.采用Transwell共培养,上室为淋巴细胞,下室为树突状细胞(Dendritic cells,DC),通过NDV攻毒刺激后,分别在第0、2、4、6 h收集各个时间点上...     

新城疫病毒载体研究进展

随着反向遗传学操作技术的发展,重组新城疫病毒载体成为当今病毒载体系统研究的热点之一.论文在综述了新城疫病毒的安全性评价、分子生物学特性的基础上,着重介绍了以新城疫病毒作为病毒载体表达外源基因应用于基础研究、疫苗研究和作为基因治疗载体等研究概况.     

GPI锚定蛋白介导嵌合新城疫病毒样颗粒的组装

当前嵌合病毒样颗粒(chimeric VLPs,cVLPs)策略主要基于融合序列的基因转染水平,但该方法存在多基因表达操控困难、锚定蛋白无法定量等问题。糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)是一种蛋白与细胞膜结合的方式,改造的GPI锚定蛋白可以被定量嵌合至真核细胞膜表面。因此,本研究以可溶性蛋白、Ⅰ型跨膜蛋白、Ⅱ型跨膜蛋白为嵌合对象,以GPI锚定方式将外源蛋白嵌合至新城疫病毒样颗粒(NDV VLPs)表面。流式细胞术检测可见GPI锚定蛋白可锚定至各真核细胞表面,并且与孵育时间呈正相关性;各组装GPI-cVLPs在电镜观察下具有完整的病毒粒子结构,与野生型NDV相似;经Western blot检测分析各GPI-cVLPs与NDV阳性血清和His单抗发生反应。综上,该GPI锚定策略能有效将外源蛋白嵌合至NDV VLPs,可为NDV VLP载体平台的应用奠定基础。     

鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备

为了制备鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒,本试验通过RT-PCR技术扩增出鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株JL株的VP2全长基因,并将其插入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建含有IBDV VP2基因的重组供体质粒pFast-VP2,转化DH10Bac E.coli感受态细胞中,经蓝白斑筛选,获得重组杆粒rBacmid-VP2,将重组杆粒rBacmid-VP2转染sf9细胞后得到重组杆状病毒vBac-VP2。rBac-VP2感染sf9细胞,提取DNA,经PCR电泳分析,得到1条与预期大小相符的特异性条带;间接免疫荧光检测,可见特异性荧光;Western-blotting分析,在大约53 000处出现1条特异性的蛋白条带;电镜观察感染重组杆状病毒的细胞上清和沉淀,均可见重组VP2蛋白自行组装形成的病毒样颗粒。试验结果表明IBDV VP2基因在昆虫细胞中得到了表达,并自组装成了IBDV病毒样颗粒。本试验为研制鸡传染性法氏囊病病毒样颗粒疫苗奠定了基础。     

内含NDV核酸的耐核糖核酸酶病毒样颗粒作为荧光定量RT-PCR内标的制备与鉴定

为制备检测新城疫病毒的实时荧光RT-PCR病毒样颗粒内标,扩增MS2噬菌体的成熟酶蛋白和衣壳蛋白序列,将其定向插入pET32a载体的相应位置,双酶切和PCR鉴定,构建pET32a-MS2重组质粒;根据新城疫病毒实时荧光RT-PCR检测的目标片段,采用化学合成和klenow酶连接技术制备内标片段,将内标片段插入pET32a-MS2重组质粒,构建pET32a-MS2-IC重组质粒,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,经RNase和DNase消化后,采用荧光RT-PCR检测耐核糖核酸酶病毒样颗粒内标的含量。结果表明,制备了高表达量耐核糖核酸酶病毒样颗粒内标,可用于新城疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立。     

应用高免血清控制鸵鸟新城疫的效果观察

新城疫 ( ND)也称亚洲鸡瘟 ,是由副黏病毒科腮腺炎病毒属的新城疫病毒引起的鸡和火鸡的急性败血性传染病。发病率、致死率均很高 ,是长期以来严重危害养鸡业的最主要的疾病之一。近年来 ,本病毒毒力越来越强 ,感染范围也越来越广 ,以前鸡、火鸡、珍珠鸡最易感染 ,发病率最严重。后来 ,有较多关于鹌鹑和鸽暴发新城疫的报道 ,近几年来 ,孔雀、观赏鸟类、野禽 ,尤其是鸵鸟也频繁暴发新城疫 ,发病严重 ,死亡率高 ,难以控制 ,让刚刚兴起的孔雀、鸵鸟等珍禽养殖业者促不及防 ,损失惨重。我们对辽宁省某鸵鸟场的一起鸵鸟新城疫采取一般药物和抗 N…     

Effect of breeder vaccination on immunization of progeny against Newcastle disease

Two experiments were conducted to determine the effect of breeder vaccination program and maternal antibody on the efficacy of Newcastle disease immunization of 1-day-old chicks. Experimental protocol was the same for both. In the first experiment, broilers were from breeders that were 32 weeks old, and in the second experiment, broilers were from breeders 50 weeks old. Breeders received three live Newcastle disease virus (NDV) vaccines and either a killed vaccine at 18 weeks or continual live boosting at 60-to-70-day intervals through lay. Broilers were vaccinated at 1 day of age with a commercial coarse-spray machine; they were bled, sera were examined for antibody against NDV, and broilers were challenged with virulent NDV at 2, 4, and 6 weeks of age. In the first experiment, maternal antibody was higher in chicks from the younger breeders given the inactivated vaccine, and in the second experiment maternal antibody was higher in chicks from older breeders given continual live vaccines. Higher antibody in 1-day-old broilers resulted in fewer vaccine-induced reactions, less vaccine virus shed, and decreased duration of vaccine-induced immunity from coarse-spray vaccination.     

蜂胶对NDV的灭活作用效果观察

本文通过鸡胚接种的方法就蜂胶乙醇浸出物对NDV的灭活作用进行了试验观察,结果表明常温下3分钟,含蜂胶乙醇浸出物0.1mg/ml的95%乙醇稀释液、含蜂胶乙醇浸出物10mg/ml的47.5%乙醇稀释液、含蜂胶乙醇浸出物10mg/ml的生理盐水稀释液;37℃3分钟,含蜂胶乙醇浸出物0.1mg/ml的95%乙醇稀释液、含蜂胶乙醇浸出物0.1mg/ml的47.5%乙醇稀释液、含蜂胶乙醇浸出物10mg/ml的生理盐水稀释液均对ND克隆-30具有完全灭活作用;常温下3分钟,1mg/ml的47.5%乙醇稀释液对ND克隆-30具有灭活作用。