急性镉胁迫下草鱼肝胰脏中几个内参基因表达稳定性的比较研究

为筛选重金属镉胁迫下稳定性较好的内参基因,选择在镉胁迫下草鱼肝胰腺中4个候选内参基因18S核糖体RNA(18SRibosomal RNA,18SrRNA),甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),β-肌动蛋白(beta actin,β-actin)和β微球蛋白(beta-2-microglobulin,β2m)进行分析。结果表明,geNorm软件分析得到18SrRNA和β2m的M值为0.716,稳定性最好;NormFinder软件分析得到GAPDH和18SrRNA稳定值分别为0.423和0.431,稳定性较好;BestKeeper软件分析得到18SrRNA标准差为0.28,稳定性最好。研究结果知,在研究重金属镉胁迫下草鱼肝胰脏基因表达情况时应选用18SrRNA为内参基因。     

小鼠卵巢组织定量PCR分析中内参基因的筛选

旨在选择小鼠卵巢组织中合适的内参基因,为研究卵巢发育过程中基因表达提供可靠数据。以不同年龄(0日龄、3周龄、5周龄、8周龄)小鼠卵巢组织为试验材料,Trizol法提取样本总RNA,并合成cDNA,根据已报道的小鼠(Mus musculus)各组织中相对稳定表达的8个常见内参基因(Gapdh、β-actin、β-tubulin、18S rRNA、16S rRNA、H2afz、Ubc、Rpl13a)的GenBank登录序列设计引物,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法构建卵巢cDNA等梯度(1∶10)稀释后的标准曲线;利用geNorm分析候选内参基因的表达稳定性(M);NormFinder筛选表达最稳定的内参基因;BestKeeper计算qRT-PCR结果的标准差(SD)和变异系数(CV),从而预测候选内参基因的稳定性。结果表明,8个内参基因的引物特异性较强,具有良好的线性关系;候选内参基因的表达稳定度排序:Gapdh=β-actin>18S rRNA>Ubc>16S rRNA> H2afz>Rpl13a>β-tubulin;其中Gapdh表达稳定性最好,且标准差及方差系数最小(SD:0.32,CV:1.95),H2afz标准差及方差系数最大(SD>1.0,CV:5.76)。综上表明,本研究成功获得出生后小鼠卵巢发育过程中稳定表达的内参基因(Gapdh和β-actin),可作为其基因表达研究中的最佳候选内参。     

LPS诱导的免疫应激对肉鸡组织内参基因稳定性的影响

脂多糖(LPS)诱导的免疫应激下,选择适于校正肉鸡肝脏、心脏和回肠组织中目的基因表达量的内参基因。将30只1日龄的肉鸡随机分为对照组与处理组,21日龄时,处理组注射1 mg/kg的LPS,对照组注射等量灭菌生理盐水,2 h后,每组各取7只肉鸡的肝脏、心脏和回肠组织。通过实时荧光定量PCR技术(RT-q PCR)对各组织中β-肌动蛋白(ACTB)、β2-微球蛋白(B2M)、18 S核糖体RNA(18 S r RNA)、28 S核糖体RNA(28 S r RNA)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)共5个内参基因的表达定量,利用Ref Finder和Ge Norm软件分析内参基因的稳定性及配对差异。结果显示:LPS刺激下,5个内参基因的表达水平有不同程度的变化。18 S r RNA、ACTB和GAPDH适于肝脏中目的基因表达量的校正;B2M和GAPDH适于心脏中目的基因表达量的校正;18 S r RNA和ACTB适于回肠中目的基因表达量的校正。选择表达稳定性高的内参基因适于校正目的基因的表达量,RT-q PCR应根据不同的研究对象进行选择,建议选择2个或2个以上的内参基因。     

鹿茸组织中内参基因的筛选和验证

为筛选在不同生长时期鹿茸组织中稳定表达的内参基因,试验以不同生长时期(分别为脱盘后10、20、40和60 d)的鹿茸组织为材料,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β2-微球蛋白(B2M)、还原型辅酶Ⅰ(NADH)、60S 核糖体蛋白L40(RPL40)、谷胱甘肽还原酶7(GPx)和β肌动蛋白(ACTB)6个看家基因的表达情况,并运用 geNorm和NormFinder 两个程序综合分析6个看家基因的表达稳定性.结果显示,GAPDH、ACTB、RPL40表达稳定性较好,可用作鹿茸基因表达研究的内参基因,而NADH和GPx的稳定性最差,不适合作内参基因.通过对鹿茸生长相关基因(ANXA5、HSP27、PRD2、CRABP1、LGALS1)表达分析,进一步验证了上述结果,并且发现这5种基因均在脱盘后10 d的鹿茸组织中高表达.该研究结果为鹿茸快速生长及骨化相关基因的研究奠定了一定基础.     

家兔不同发育阶段和组织中内参基因的稳定性分析

本研究旨在筛选出新西兰白兔不同时期不同器官中表达最稳定的内参基因。以胚胎期(E28.5)、幼龄期(10d)和成年期(A)3个阶段的新西兰白兔的肾、心和肝3种组织作为研究对象,按照RT-qPCR试验最低要求试验信息量(MIQE)的指导,运用RT-qPCR和在线内参基因稳定性评价工具RefFinder,比较6个常用的内参基因(GAPDH、HPRT1、18S rRNA、B2 M、Sdha、β-actin)mRNA的表达稳定性。结果表明,新西兰白兔的肝和肾组织中的6个内参基因在3个发育阶段最稳定的3个内参基因依次是β-actin、HPRT1、GAPDH,而在心组织中最稳定的3个内参基因依次是β-actin、HPRT1、Sdha。在新西兰白兔胚胎期的3种组织中,最稳定的3个内参基因依次是GAPDH、β-actin、HPRT1,而在幼龄期和成年期最稳定的3个内参基因依次是HPRT1、GAPDH、β-actin。对新西兰白兔的3个发育阶段和3种组织的内参基因稳定性结果分析表明,最稳定的3个内参基因依次是β-actin、HPRT1、GAPDH。本研究证实,新西兰白兔不同的发育时期和组织中,最稳定的内参基因不同。推荐在进行新西兰白兔的相关试验时,可以选择上述表达最稳定的至少3个内参基因的几何平均数作为标准化相关RT-qPCR数据的指标,以确保试验组个体间的差异最小,和小变量的准确数据分析。     

干扰MSTN的牛骨骼肌卫星细胞实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选在牛骨骼肌卫星细胞(MSCs)分化前后稳定表达以及不受MSTN基因表达影响的内参基因,试验以野生组(WT)、转染干扰MSTN组(si-MSTN)和对照组(NC-MSTN)的牛MSCs作为样品,选取HMBS、B2M、GAPDH、TUBB、SDHA、18S rRNA、ACTB、RPL4、PPIA、HPRT1和YWHAZ作为候选内参基因,采用实时荧光定量PCR技术Ct值分析法对各候选内参基因的相对表达进行测定,首先利用3个独立评价软件geNorm、NormFinder和BestKeeper分别对各候选内参基因在野生组牛MSCs增殖期(GM)和分化第3天(DM3)细胞中的表达稳定性进行评价,筛选出前5个表达相对稳定的候选内参基因;然后以此为基础,利用相同的方法分析MSTN干扰组和对照组增殖期和分化第3天的细胞中上述5个内参基因的表达水平和稳定性。geNorm、NormFinder分析结果均显示,HMBS、B2M、TUBB、GAPDH和ACTB在牛MSCs分化前后表达较稳定,BestKeeper分析显示ACTB和TUBB相关系数(r)排序靠前,GAPDH、HMBS和B2M排序不是很高,但是GAPDH的SD值最小,因此选择这5个候选内参基因做后续试验;在牛MSCs MSTN干扰组和对照组增殖期和分化第3天,geNorm、NormFinder软件分析结果显示,上述5个候选内参基因中GAPDH、TUBB和B2M表达最稳定,BestKeeper分析显示TUBB相关系数排名不是最高,但其SD值最小,综合以上分析,选择TUBB作为牛MSCs干扰组和对照组增殖期和分化第3天最适内参基因。研究结果可为以后进行牛MSCs在不同生长时期以及MSTN表达被调控后基因的表达分析提供参考。     

绵羊基因表达定量分析内参基因的筛选

内参基因在基因表达定量分析中常用于修正基因的表达量,但不同条件下内参基因的表达并不稳定。本实验旨在选出在绵羊不同组织稳定表达的内参基因。选取6月龄广灵大尾羊的皮肤、肾周脂肪、肝脏、背部最长肌组织为实验样本,用实时荧光定量PCR方法分别测定内参基因GAPDH、18S rRNA、B2M、ACTβ、RPLPO、YWHAZ在绵羊各组织内的mRNA丰度,经GeNorm、NormFinder及BestKeeper综合分析内参基因的稳定性。结果表明:在绵羊背部最长肌和肾周脂肪中,3个软件都得出GAPDH表达最稳定;在肝脏中,3个软件都得出RPLPO表达最稳定;在皮肤中,GeNorm和NormFinder均得出18S rRNA表达最稳定,而GeNorm和BestKeeper均得出GAPDH表达最稳定,所以选取18S rRNA或GAPDH作为内参基因;比较4个组织中表达最稳定的基因时,GeNorm和NormFinder软件均得出RPLPO表达最稳定,而BestKeeper分析表明B2M基因稳定性最好,所以选取RPLPO或B2M作为内参基因。     

羊草不同组织实时定量PCR内参基因的筛选

为筛选羊草(Leymus chinensis)不同组织实时定量PCR(qRT-PCR)试验体系中的最佳内参基因,以羊草叶、茎、根、穗为研究材料,利用qRT-PCR技术分析TUA、TUB、18SrRNA、EF-1α、APRT、CYP、Actin和CBP20共8个常用候选管家基因的表达情况,并使用geNorm和NormFinder软件进行综合评价,以期筛选出羊草不同组织中最稳定的内参基因。结果表明,8个候选内参基因在羊草不同组织表达稳定性不同,其中,叶片中稳定性较高的内参基因是Actin;茎中稳定性较高的内参基因是EF-1a;根中稳定性较高的内参基因是APRT和18SrRNA;穗中稳定性较高的内参基因是TUB。本研究结果将为开展羊草功能基因的表达分析提供重要参考。     

H5N1禽流感病毒感染小鼠后内参基因的筛选

本研究旨在评定H5N1禽流感病毒(H5N1 avian influenza virus,H5N1 AIV)感染小鼠后,脾脏组织中6个候选内参基因酪氨酸3/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein,Ywhaz)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1,Hprt1)、琥珀酸脱氢酶A亚基(succinate dehydrogenase flavoprotein subunit,Sdha)、β-肌动蛋白(β-actin,Actb)、肽基脯氨酰异构酶A(peptidyl prolyl isomerase A,Ppia)和18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA,18S rRNA)的稳定性。通过H5N1 AIV强毒株A/DK/GD/378/08感染小鼠,采用Real-time PCR方法分别于12、24、48、72、96、120和144 h检测感染组与对照组中6个候选内参基因的表达水平,然后用Genorm软件对内参的稳定性进行评价。结果表明,正常小鼠脾脏组织中6个内参基因稳定度由高到低分别为Ywhaz/Hprt、Sdha、Actb、Ppia、18S rRNA;H5N1 AIV感染的小鼠脾脏组织中6个内参基因稳定度由高到低分别为Ppia/Sdha、18S rRNA、Hprt、Ywhaz、Actb;综合评价正常和H5N1 AIV感染后小鼠脾脏组织中6个内参基因的表达稳定度由高到低分别为Sdha/Hprt1、Ywhaz、Ppia、Actb、18S rRNA。因此,小鼠脾脏组织中Ppia和Sdha是研究H5N1 AIV在机体中复制时最理想的2个内参基因;Sdha和Hprt1则是在研究H5N1 AIV与机体相互作用时最理想的2个内参基因。     

新生籽鹅组织qRT-PCR分析中内参基因的选择

分别以1日龄健康籽鹅肝脏、肾脏、心脏、肌肉和卵巢为研究对象,应用实时定量RT-PCR技术,探讨28SrRNA、18SrRNA、GAPDH、ACT、HPRT1、SDH和TUB等7个内参基因mRNA的表达水平。经过geNorm和NormFinder程序分析,结果显示7个内参基因稳定度由高到低依次为GAPDH=HRPT1〉28SrRNA〉TUB〉SDH〉ACT〉18SrRNA;基因表达的稳定值分别为0.215（GAPDH）,0.215（HRPT1）,0.339（28SrRNA）,0.471（TUB）,0.721（SDH）,0.888（ACT）,1.177（18SrRNA）;表明GAPDH和HRPT1这2个内参基因适合用于目的基因表达的校正。