LTR对J亚群禽白血病病毒感染的影响

为探讨LTR基因在骨髓瘤病变型J亚群禽白血病病毒(ALV-J) NX0101致病中的作用,利用反向遗传将血管瘤病变型ALV-J HN06株中两端LTR元件替换至NX0101株的相应位置,拯救出重组病毒NX-HNLTR株.人工接种7日龄SPF雏鸡,分别检测NX0101株和NX-HNLTR株对鸡体的影响.感染鸡生长都较慢.感染NX0101株的鸡,胸腺指数和腔上囊指数明显比对照组低,脾脏指数与对照组相比波动较大,骨髓和脾脏在攻毒后3周可检测到病毒整合到基因组中,胸腺和腔上囊在攻毒后6周才检测到.感染NX-HNLTR株的鸡脾脏指数明显比对照组低,攻毒后2周可检测到病毒整合到脾脏基因组中,骨髓和胸腺分别在攻毒后3周和6周检测到.结果提示,LTR对NX0101株感染鸡的免疫器官有一定的影响.     

中国6个地方鸡品种的母系起源

通过对线粒体DNA（mtDNA）D-loop区的测序和比对,探讨了中国6个地方鸡品种的母系起源。结果表明,文昌鸡、鲁西斗鸡、寿光鸡、济宁百日鸡和莱芜黑鸡分别有5、5、5、6和7种单倍型,琅琊鸡只有3种单倍型;6个地方鸡品种聚为3个分支：分支A是1个主要分支,共有17种单倍型,有寿光鸡（10只）、鲁西斗鸡（9只）、文昌鸡（5只）、莱芜黑鸡（6只）、济宁百日鸡（6只）和琅琊鸡（2只）,分别占所分析各地方鸡品种个体数的100%、90%、84%、75%、60%和20%,与分布于老挝、云南红原鸡的3个大陆亚种（G.g.gallus、G.g.jabouile和G.g.spadi-ceus）关系较近;分支B中包含8只琅琊鸡（80%）和1只济宁百日鸡（10%）;分支C中有1只鲁西斗鸡（10%）、1只文昌鸡（16.7%）、2只莱芜黑鸡（25%）和3只济宁百日鸡（30%）;分支B和C分别与来自红原鸡G.g.gallus亚种H19单倍型和H32、H33单倍型聚在一起。推测这6个地方鸡品种分别来自云南、老挝和越南附近地区的红原鸡大陆亚种。基因流是上述品种群体间遗传分化的主要因素。错配分布和Fu＇sFs检验表明,分布于山东的5个地方鸡品种未发生群体扩张。     

ALV与MDV混合感染造成鸡群临床肿瘤暴发的诊断

2017年11月,广西某公司两个商品鸡群出现鸡只食欲不振、排绿色粪便症状。病鸡解剖发现内脏有肿瘤发生,采集肿瘤组织和外周血淋巴细胞分别进行病理组织学观察、病毒分离以及PCR鉴定,结果显示两批鸡均为J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus sub-group J,ALV-J)与马立克氏病病毒(Marek′s disease virus,MDV)的混合感染。从每群发病鸡分别获得的2株ALV-J和2株MDV的基因序列测定与遗传进化树分析结果显示,4株ALV-Jgp85基因相似性为100%,均与广西分离株GX15MM6-2的亲缘关系最近,而与NX0101的距离相对较远。4株MDV之间meq基因相似性为99.0%~99.9%,其中1株与MDV标准强毒GA在同一个分支,另外3株与广西分离的MDV超强毒GXY2、GX0101距离最近且在同一个分支,都具有MDV-1型强毒株的特征。     

山东省典型地方鸡饲养管理现状及发展建议

我国丰富的地方鸡品种，是宝贵的遗传资源。莱芜黑鸡、济宁百日鸡、芦花鸡作为山东省珍贵地方鸡种，具有肉质风味好、产蛋量高、耐粗饲和适应性强等突出优点。但由于受到外来品种的冲击、保护不力、饲养管理不规范等因素的影响，其数量锐减、性能退化、杂交严重，品种保护形势非常严峻。为更好的保护及推广山东省地方鸡种的饲养与发展，现针对莱芜黑鸡、济宁百日鸡、芦花鸡的饲养管理情况进行调研。     

山东地方鸡种屠宰及体尺性状的比较分析

本试验随机选取相同环境条件下饲养的170日龄汶上芦花鸡、济宁百日鸡和莱芜黑鸡各30只,测定其屠宰性能和体尺性状,并进行品种间的比较分析。结果表明,170日龄的活体重济宁百日鸡为1532.03 g,莱芜黑鸡为1431.20 g,汶上芦花鸡为1369.83 g;莱芜黑鸡的屠体率、半净膛率、全净膛率和腿比率值均为最高,且与其他品种间存在显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）差异;3个地方鸡种的肌肉pH在宰后15 min至宰后24 h内均呈下降趋势,各时期pH均符合正常肌肉要求范围。肌内脂肪含量以济宁百日鸡最高,剪切力和肌内脂肪含量均以汶上芦花鸡最低;各品种的体型特征比较接近,胫围和髋骨宽以汶上芦花鸡最小,莱芜黑鸡最大。     

不同亚群禽白血病病毒5'LTR序列及启动子活性分析

对不同亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV) 5'LTR序列及其启动子活性进行了比较分析,以探讨LTR对ALV复制和致病力的影响。通过PCR分别扩增克隆了中国分离株GD08(ALV-A)、CD08(ALV-B)、HN06(血管瘤病变型ALV-J)和NX0101(骨髓瘤病变型ALV-J)毒株基因组5'LTR片段。与国内外不同亚群ALV分离株5'LTR核苷酸序列比较发现,NX0101株和HN06株与ALV-J国内外分离株的同源性最高,达90.8％~97.5％;GD08株与ALV-A国内分离株SDAU09C1的同源性最高,为94.6％;CD08株与GD08株和ALV-J各株的同源性高达90％以上。LTR中的R区具有较高的保守性,但CD08株U3区缺失11 bp,GD08株U5区与其它毒株的U5区差异较大。将LTR片段插入到pCAT-Basic载体的CAT报告基因前,通过转染DF-1细胞和测定CAT表达量来评价LTR的启动子活性。HN06株和NX0101株之间,以及GD08株和CD08株之间LTR启动子活性有差异,但差异不显著;而ALV-J毒株与GD08株和CD08株之间的LTR启动子活性差异显著。     

核酸杂交技术在禽白血病病毒TCID_(50)测定中的应用

为探索核酸杂交技术在测定J亚群禽白血病病毒(ALV-J)细胞半数感染量(TCID50)中的可行性,将ALV-J传染性克隆r NX0101株以10倍梯度稀释后按常规方法接种已长满单层鸡胚成纤维细胞(CEF)的96孔板,在维持7 d后收集细胞培养上清。上清液部分按照试剂盒说明书进行p27抗原的ELISA检测,另一部分提取RNA后以鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒进行Dot-blot检测,每孔中细胞固定后以ALV-J特异性单克隆抗体进行IFA检测,确定病毒感染孔后按照Reed-Muench法分别计算三种方法测定的TCID50。结果显示ELISA法、IFA法和Dot-blot法在确定病毒感染中能够相互验证和补充,该病毒在CEF的TCID50分别为10-4.7TCID50/0.1 m L、10-5.2TCID50/0.1 m L和10-5.3TCID50/0.1 m L。表明采用Dot-blot法测定ALV-J的TCID50是可行的,不仅能够排除内源性的干扰,并且比ELISA和IFA具有更高的灵敏度。     

env基因对J亚群禽白血病病毒体外感染和复制能力的影响

为探讨env基因对J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)体外感染和复制能力的影响,本研究利用反向遗传方法构建重组病毒,将血管瘤病变型ALV-J HN06株中env元件替换至髓细胞瘤病变型ALV-J NX0101株的相应位置,成功构建了重组质粒pNX-HNenv。重组毒株能在DF-1细胞上稳定增殖,并能被JE9特异性单抗识别,证明获得了具有感染性的重组病毒NX-HNenv株。结果显示,同一亚群内env基因的替换对病毒的体外感染和复制能力无明显影响。     

3个江西地方鸡品种的禽白血病病毒病原学调查

对来自江西3个地方鸡品种(崇仁麻鸡、余干乌骨鸡、东乡绿壳蛋鸡)进行禽白血病病毒(ALV)病原学调查。将所采集的血浆接种DF-1细胞,经ALV p27抗原ELISA检测,结果显示这3个江西地方鸡品种均有外源性ALV感染,经鉴定得到4株J亚群禽白血病病毒(ALV-J)。基于gp85序列分析表明这4个分离株与ALV-J英国原型株HPRS-103 gp85基因核苷酸序列相似性最高(平均为94.6%),而与A、B、C、E亚群ALVgp85基因的核苷酸相似性仅在50.6%~54.5%之间。这是江西地方鸡品种分离和鉴定ALV-J的初次报道,对于我国江西省地方鸡品种的禽白血病净化具有参考价值。     

龙胜凤鸡中一株A亚群禽白血病病毒的基因组分析及其对SPF鸡的致病性研究

为了解中国地方品系鸡中禽白血病病毒(ALV)的基因组序列特征及其致病性,本研究通过DF-1细胞接种、间接免疫荧光和PCR等方法,从某龙胜凤鸡保种鸡群的种蛋中分离到一株A亚群ALV(ALV-A),命名为SDAU14A1株,并对其全基因组进行测序。将该序列与不同参考病毒株进行序列对比,结果显示SDAU14A1分离株与日本矮脚鸡分离株Tym S_90全基因组同源性最高,其U3区同源性达到100%,而与其它中国地方品系鸡分离株同源性较低。人工感染试验显示该病毒分离株感染SPF鸡后不仅引起感染鸡的生长迟缓和免疫抑制,还能够诱发淋巴细胞肿瘤,特别是具有较强的水平传播能力。本研究有助于了解我国地方品系鸡群中ALV-A的分子演变及其致病性,为我国地方品系中ALV净化提供参考依据。     

华东地区蛋鸡群中禽白血病的分子流行病学调查

为了解华东地区蛋鸡群中禽白血病的流行情况,2011年3月至2012年10月,从江苏、山东、安徽、上海等省市的蛋鸡养殖场中采集疑似禽白血病病例样品105份,经DF-1细胞分离培养、间接免疫荧光试验鉴定,从中分离禽白血病病毒(ALV)15株,继而对分离毒株gp85基因进行了序列测定和遗传进化分析。结果表明,在所获得的ALV分离株中,有A亚群ALV(ALV-A)3株,B亚群ALV(ALV-B)4株,剩余8株则均为J亚群ALV(ALV-J)。ALV-A、ALVB分离株遗传进化较为稳定,与其原型株(RAV-1、RAV-2)gp85基因核苷酸序列同源性均在98%以上,与我国近年来的地方分离株亲缘关系较远。ALV-J分离株与其原型株(HPRS-103)gp85基因核苷酸序列的同源性在92.8%~94.5%之间。8株ALV-J分离株中,只有1株与蛋鸡ALV-J分离株有较高的亲缘关系,其余均较远,反而与早期的肉鸡分离株有较高的亲缘关系,表明目前于华东地区蛋鸡群中流行的ALV-J可能来源于早期肉鸡分离株的感染。4株ALV-J分离株与我国地方品系HR土鸡的ALV-J分离株HR332J具有很高的亲缘关系,表明ALV-J的感染范围进一步扩大,对地方品系鸡也造成了很大的危害。     

J亚群禽白血病病毒TCID_(50)不同测定方法的比较

为比较不同方法在测定J亚群禽白血病病毒(ALV-J)组织细胞半数感染量(TCID50)上的差异,将ALV-J传染性克隆r NX0101株同一病毒保存液以10倍梯度稀释后按照常规方法分别接种已长满DF-1细胞和鸡胚成纤维细胞(CEF)的96孔板,维持7 d后取所有细胞培养上清以ALV-p27抗原检测试剂盒检测p27抗原,细胞固定后以ALV-J特异性单克隆抗体JE9进行间接免疫荧光(IFA)检测,确定病毒感染孔后按照Reed-Muench法分别计算两种方法在两种细胞上的TCID50。结果显示,ELISA法测定该病毒在DF-1细胞和CEF细胞上的TCID50分别为10-5.4TCID50/0.1 m L和10-4.666TCID50/0.1 m L,而IFA法测定该病毒在DF-1和CEF细胞上的TCID50分别为10-6.333TCID50/0.1 m L和10-5.2TCID50/0.1 m L。结果表明,IFA比ELISA具有更高的灵敏度,并且ALV-J在DF-1细胞上复制能力比CEF更强,在DF-1细胞上测定ALV-J的TCID50更为科学。     

相对定量Real-time PCR分析不同品种鸡胚H-FABP基因表达的差异

选用孵化5d的9只莱芜黑鸡,9只汶上芦花鸡和8只济宁百日鸡胚以及孵化11d的12只莱芜黑鸡,11只汶上芦花鸡和9只济宁百日鸡胚作为研究对象,采用相对定量Real-timePCR的方法,研究心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因在不同品种鸡胚中表达的差异。结果显示检测的3个品种孵化11d的鸡胚中H-FABP基因的表达高于孵化5d的鸡胚。其中莱芜黑鸡的H-FABP基因的表达量变化最小,孵化11d的表达量约为孵化5d的2.64倍;变化最大的是济宁百日鸡,孵化11d的表达量约为孵化5d的4.17倍;汶上芦花鸡H-FABP基因在孵化11d的表达量约为孵化5d表达量的2.96倍。     

山东地方鸡种遗传距离与聚类分析方法比较研究

选用5个多态性较好的微卫星标记，检测了山东省仅存的5个地方鸡种：寿光鸡、日照麻鸡、莱芜黑鸡、济宁百日鸡、鲁西斗鸡，以及一个外来鸡种——安卡黄鸡和一个外省地方鸡种——广西黄鸡共7个鸡种的遗传多样性。根据测试结果计算了每个等位基因的频率，并以基因频率为基础计算了Nei氏标准遗传距离(Ds)和DA遗传距离，发现日照麻鸡与济宁百日鸡的距离最近，而鲁西斗鸡与其他6个鸡种距离都较远。根据两种遗传距离分别进行了NJ法和UPGMA法聚类，得到4个聚类图。结果表明：DA遗传距离的UPGMA聚类图比较可靠。     

黄羽肉鸡中一株ALV-J的分离与鉴定

通过抗体检测、病毒分离、间接免疫荧光检测和序列分析等诊断方法确认了山东黄羽肉鸡感染了J亚群禽白血病病毒(ALV-J)。对ALV-J env基因克隆测序后分析发现这株地方鸡群毒株的gp85基因与从白羽肉鸡中分离到的ALV-J具有非常高的同源性。进化树分析表明本文分离到的ALV-J毒株与从中国三黄鸡以及从中国和美国白羽肉鸡中分离到的一些参考毒株密切相关。本文报道了山东地区黄羽肉鸡中ALV-J的感染,ALV-J在地方品系鸡中的净化亟待解决。     

广东地方品种鸡J亚群禽白血病病毒分离鉴定及遗传进化研究

为了解广东地方品种鸡J亚群禽白血病病毒(ALV-J)净化情况,利用ALV-p27特异性抗原检测、病毒分离、PCR扩增和全基因组测序分析等方法,从广东某地方品种鸡群中分离鉴定出1株ALV-J,命名为GDYH-Y1。全基因组序列分析表明,GDYH-Y1分离株的LTR、gag和pol基因相对保守,而3′UTR和gp85基因变异较大,其中gp85基因与ALV-J参考毒株序列同源性仅为87.5%~92.8%,3′UTR区的rTM出现大量碱基缺失,遗传进化分析表明GDYH-Y1分离株与美国白羽肉鸡源分离株ADOL-7501亲缘关系最近。研究为广东地方品种鸡ALV-J净化效果提供数据参考,为分析广东地方品种鸡ALV-J毒株的分子特征和变异趋势提供了重要的数据资料。     

经鸡胚感染的ALV-J对新城疫弱毒疫苗免疫的抑制作用及疫苗株对病毒载量的影响

为了解经鸡胚感染携带J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的雏鸡体内ALV-J对新城疫(ND)弱毒疫苗(La Sota株)免疫的抑制作用以及疫苗免疫后增强ALV-J对雏鸡致病作用的可能性,随机选择50个SPF鸡胚经卵黄囊接种模拟ALV-J感染,同时选取等量SPF鸡胚以相同方式接种PBS作为对照。出雏后于接毒组和对照组各取20只SPF鸡在7日龄时免疫ND弱毒疫苗(La Sota株)。2～6周龄时,记录各组鸡的体重和免疫器官指数,并对雏鸡的NDV抗体水平和血液ALV-J病毒载量进行动态检测。结果显示,感染ALV-J的SPF鸡5、6周龄时体重显著低于PBS对照组(P0.05),而感染ALV-J再免疫新城疫弱毒疫苗后SPF鸡体重进一步降低(P0.05);与PBS对照组相比,6周龄时感染ALV-J的SPF雏鸡胸腺萎缩和脾脏肿大(P0.05),免疫新城疫弱毒疫苗后胸腺和脾脏损伤加剧(P0.05);3、4周龄时感染ALV-J再免疫ND弱毒疫苗组的雏鸡NDV抗体水平极显著低于仅免疫ND弱毒疫苗组(P0.01);4周龄时免疫弱毒疫苗后的SPF鸡血液中ALV-J病毒载量高于未免疫组(P0.01)。研究表明,感染ALV-J的雏鸡在免疫ND弱毒疫苗(La Sota株)后增强了ALV-J对SPF雏鸡的致病作用,提示净化种源的重要性。     

鸡胚和雏鸡接种ALV-J相关急性纤维肉瘤浸出液的致病性比较

为了比较鸡胚接种ALV-J相关急性纤维肉瘤浸出液对胚体及雏鸡的致病性,将含ALV-J相关病毒的肉瘤浸出液分别经5日龄胚卵黄囊、11日龄胚绒毛尿囊膜、1日龄雏鸡腹腔接种,比较不同接种方式对SPF鸡胚及雏鸡的致病性.结果表明,5日龄卵黄囊接种的鸡胚在18～22日龄死胚率为14/30,肿瘤发生率为8/14; 11日龄绒毛尿囊膜接种的鸡胚在18～22日龄引起鸡胚死亡率为17/30,肿瘤发生率为6/17.对雏鸡的致病性比较表明,绒毛尿囊膜接种的13只出壳雏鸡全部死亡,有11只出现肿瘤.结果提示,绒毛尿囊膜接种的致病性不仅高于卵黄囊接种,也高于1日龄雏鸡接种.绒毛尿囊膜接种不仅肿瘤发生率高,且发生得更早、更快,可作为这种急性纤维肉瘤进一步作人工造病的实验模型.     

蛋鸡血管瘤型J亚群禽白血病病毒的分离与鉴定

通过临床观察、剖检、接种DF-1细胞、间接免疫荧光试验和PCR等方法,从安徽父母代种鸡场、青岛平度和沙子口某商品蛋鸡场分离到3株血管瘤型J亚群禽白血病病毒(ALV-J),分别命名为AH-101、PD-101、SZK-101.采集病鸡的血液、肝脏和脾脏组织,接种DF-1细胞分离病毒,提取DNA,用P11/PJ2 ALV-J引物进行PCR扩增结果为阳性,IFA检测为阳性.用J3/J4引物扩增gp85并测序,序列分析发现,3株毒株与国内外各ALV-J的相应核苷酸相似性为91.6%～96.9%,氨基酸序列的同源性为83.4%～96.9%.系统进化分析表明,AH-101和PD-101与原型株HPRS-103的亲缘关系最近,SZK-101与美国株AF247391的亲缘关系最近.     

一株Clade1.3 ALV-J分离鉴定及其全基因组序列分析

为了解地方品种鸡禽白血病病毒(ALV)感染情况,本试验用从广西某养殖公司地方品种鸡采集的血浆样品接种DF-1细胞进行ALV的培养分离,然后用ALV-p27抗原检测试剂盒对其细胞培养上清进行ELISA检测,并进一步对细胞培养物进行病毒亚群的PCR鉴定和病毒分离株的全基因组序列测定与分析。结果显示：从鸡血浆样品中获得一株ALV,分离毒株经分子鉴定及测序分析确定其为J亚群(ALV-J),命名为GX22YL01;通过对毒株GX22YL01的全病毒基因组与参考毒株序列进行比对分析,发现其与课题组建立的ALV-J分类方法“Pilot tree”中的参考株GX14HG04相似性最高,且同处于Clade 1.3分支。